Nguyên lý và ứng dụng của
phương pháp PCR trong phát
hiện và chẩn đoán bệnh ở động
vật thủy sản

Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào:
2. tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang
được áp dụng ở phòng thí nghiệm
3. lảnh vực nghiên cứu của người chẩn đoán
4. những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ
sở các loài địa phương.
Chẩn đoán bệnh ở thủy sản

Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật
Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật
đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn
đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn
xác có ý nghĩa rất quan trọng.
xác có ý nghĩa rất quan trọng.
Chẩn đoán bệnh ở thủy sản

Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu
1. thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh
2. thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố
định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân
lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv,
cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu.
3. số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả
phân tích

pháp là:
- biến động giữa các cá thể phân tích
-
biến động giữa các lần đọc kết quả

Kary Mullis
Giải Nobel hóa học
(1993)
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

PCR là phương pháp khuếch đại nhanh
và nhạy có chọn lọc môt trình tự
DNA/RNA nhất định từ một mạch khuôn
axit nucleic
Phương pháp PCR là gì?

Nguyên tắc

Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (một mồi xuôi và
một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen).
Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì
chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tồng hợp. Hai mồi này gồm mồi xuôi và
mồi ngược theo chiều phiên mã gen.
PCR.EXE

Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung
dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho

90
80
70
60
50
40
Giai đoạn Biến tính

90
80
70
60
50
40
Giai đoạn lai

90
80
70
60
50
40
Giai đoạn kéo dài

Sản phẩm PCR đầu tiên

Khuếch đại trình tự mong muốn

•
Mạch khuôn (template)

•
Nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-65°C
và tương thích giữa mồi xuôi và mồi
ngược
•
Mồi cần phải có xấp xỉ số bazơ nitơ
A, T, G,C và tránh các vùng
polypurines hay polypyrimidines
•
Tránh sự tạo thành hairpin loop
•
Trình tự phần đầu 3’ kết thúc (3’-end)
của mồi không bổ sung nhau
(để giảm “primer
dimer”)
A
A
A
T
T
T
G
G
C
C
5’3’
5’ 3’
5’ 3’
OH 3’
3’HO

Mồi ngắn hơn 20 nucleotides
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperature-Tm)

Bước 1
Biến tính (92
o
C - 95
o
C)
tách hai mạch AND
xoắn kép thành 2 mạch đơn
Bước 2
Lai (37
o
C - 65
o
C) Mồi
lai với trình tự bổ sung trên
mạch khuộn DNA
Bước 3
Kéo dài (70
o
C- 72
o
C)
polymerase tổng hợp DNA
mới
Lai
37°C- 65°C

Tối ưu hóa PCR
•
DNA template concentration
–
Hàm lượng: 5-100 ng
–
Tinh sạch
•
Nồng độ MgCl2 : 1.0 - 6.0 mM
•
Taq DNA polymerase: 1-5 units
•
Nhiệt độ lai
•
Số chu kỳ PCR: 25-40 cycles
•
Thể tích PCR: 13-100 µl