TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHÒNG
VIỆN SINH - NÔNG
*****
HỌ VÀ TÊN : VŨ THỊ VÂN ANH
LỚP: KSNTTS K12. KHÓA : 2011 - 2015

TÊN ĐỀ TÀI: Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phản
nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn.
Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản
BÁO CÁO ĐỀ CƯƠNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Giáo viên hướng dẫn: 1.Ts. Đỗ Mạnh Hào
2. Ths. Mai Thị Yến
Học viên thực hiện: Vũ Thị Vân Anh
MỞ ĐẦU
Nước ta có bờ biển dài với hệ thống kênh rạch chằng chịt rất thuận lợi cho
nghề phát triển nuôi trồng thủy sản, trong đó nghề nuôi tôm đóng góp một phần
không nhỏ vào sự phát triển của ngành. Sản lượng tôm không chỉ đáp ứng nhu cầu
trong nước mà còn xuất khẩu ra nước ngoài và góp phần quan trọng vào tăng
trưởng kinh tế cho đất nước (7.662 triệu USD/8 tháng 2004).
Trong nuôi trồng thủy sản, các điều kiện vật lý, hóa học và sinh học của môi
trường ao nuôi có ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe và khả năng sản xuất của tôm.
Sự tiếp xúc của tôm với các độc tố như H
2
S, NH
3
, CO
2
dễ làm tôm bị stress và từ
đó mang bệnh. Các chất thải trong ao nuôi tôm bao gồm: (1) thức ăn dư thừa và
phân; (2) các sản phẩm phụ trong quá trình trao đổi chất; (3) tồn dư các chất diệt
khuẩn như kháng sinh; (4) các chất thải có nguồn gốc từ phân bón; (5) các chất thải

nitrate, ammonium gây ô nhiễm nguồn nước, cải thiện chất lượng nước ao nuôi,
góp phần thực hiện nuôi thủy sản bền vững. Ngoài ra, việc ứng dụng các kỹ thuật
sinh học phân tử sẽ giúp nhận diện vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính
xác.Do vậy, thực hiện đề tài “Tổng hợp một số loài vi sinh vật có khả năng phản
nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn” là hết sức cần thiết.
1.2. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
- Mục tiêu chung: Phân lập được một số chủng vi sinh vật phản nitrate từ ao
nuôi tôm vùng ven biển. Kết quả của việc nghiên cứu sẽ góp phần vào việc giải
quyết vấn đề ô nhiễm đạm trong nước ở ao nuôi tôm.
- Mục tiêu cụ thể:
+ Học tập được các phương pháp cơ bản trong nghiên cứu vi sinh vật.
+ Có được một số chủng vi sinh vật phản nitrate phân lập từ các ao nuôi tôm
ven biển Đồ Sơn.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo tốt cho các công trình nghiên cứu
tiếp theo về lựa chọn, phân lập các chủng vi sinh vật phản nitrate trong nước.
- Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng quy trình lựa chọn các một số
chủng vi sinh vật.
1.2.2. Nội dung
- Phân lập một số chủng vi khuẩn phản nitrate trong trầm tích thu từ các ao
nuôi tôm ven biển.
- Thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn phản nitrate từ các mẫu thu được.
- Bước đầu đánh giá tiềm năng khử nitrate của khu hệ vi sinh vật bản địa
trong khu vực nuôi trồng thuỷ sản nước lợ khu vực cửa sông Lạch Tray, Hải
Phòng.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. HIỆN TRẠNG NUÔI TÔM HIỆN NAY VÀ CÁC CHẤT Ô NHIỄM
NITƠ TRONG ĐẦM NUÔI THỦY SẢN NƯỚC LỢ
Trong khoảng 2 thập niên gần đây, chúng ta đang chứng kiến ngành nuôi trồng

) được tích luỹ dần do sự bài tiết trực tiếp từ đối tượng nuôi, phân huỷ thức ăn
dư thừa hay sẵn có từ nguồn nước cấp vào đã nhiễm các hợp chất nitơ. TAN và
nitrite là độc tố đối với các đối tượng nuôi, bởi nó có thể gây ra hiệu ứng cấp tính
và kinh niên dẫn đến giảm khả năng đề kháng bệnh và sinh trưởng của vật nuôi.
Theo Chin & Chen (1987), nồng độ NH
3
là 0,09 mg/L có thể làm giảm sinh
trưởng, tại nồng độ 0,1 mg/L có thể gây chết tôm (Chin & Chen, 1987; Boyd,
2000). N-NO
2
có thể ảnh hưởng đển sức khỏe của tôm trong dài hạn tại nồng độ
thấp đến 0,45 mg/L (Gross & cs., 2004). Nitrate không gây độc trực tiếp đối với
vật nuôi nhưng sự có mặt của nitrate với nồng độ cao sẽ kích thích sự nở hoa của
tảo, có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vật nuôi như cá chình (Kamstra &
van der Heul, 1998), mực (Hyrayama, 1996), cá hồi (Berka & cs., 1981) và tôm
(Muir & cs., 1991).
Hình 1. Chu trình nitơ trong đầm nuôi tôm ven biển
2.2. KHÁI QUÁT VỀ CHU TRÌNH NITƠ VÀ VI KHUẨN PHẢN NITRATE
2.2.1. Chu trình chuyển hoá nitơ sinh học trong đầm nuôi thuỷ sản nước lợ
Chu trình nitơ là một trong những chu trình quan trọng nhất của hệ sinh thái
bởi nitơ là nguyên tố chính cấu thành các hợp chất hữu cơ quan trọng của sự sống
như protein và axit nucleic. Trong nhiều hệ sinh thái tự nhiên, nitơ thường là
nguyên tố cần thiết cho sự sống của sinh vật do nguồn cung cấp nitơ giới hạn có
thể làm giảm năng suất sơ cấp của hệ sinh thái. Trong một số hệ sinh thái khác như
hệ sinh thái đồng ruộng canh tác nông nghiệp, sông ngòi và ven biển, do chịu ảnh
hưởng mạnh mẽ bởi các hoạt động của con người mà nguồn nitơ trong các hệ sinh
thái này thường dư thừa (eutrophication) và có ảnh hưởng tiêu cực đến sự cân bằng
của hệ sinh thái.
Hình 2. Chu trình nitơ vi sinh vật trong hệ sinh thái tự nhiên
Các nhóm vi khuẩn mới được phát hiện bao gồm nhóm vi khuẩn lam đơn bào

2
-
→ NO → N
2
O → N
2

Quá trình phản nitrate xảy ra chủ yếu do nhóm vi sinh vật dị dưỡng trong điều
kiện kị khí hoặc hiếu khí tuỳ tiện và có chuỗi hô hấp hoàn chính, chúng phân bố
rộng rãi trong tự nhiên. Chúng gồm một số đại diện như Pseudomonas,
Alcaligenes, Azospirillum, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Propionibacterium,
Achromobacter, Micrococcus, Paracoccus, Bacillus v.v. Ngoài ra còn một số vi
khuẩn lưu huỳnh cũng có khả năng này như Thiobacillus denitrificans, Sulfomonas
denitrificans. Bên cạnh các vi khuẩn dị dưỡng còn có các vi khuẩn tự dưỡng như
Thiobacillus denitrificans hoặc tự dưỡng không bắt buộc khác. Các vi khuẩn này là
các vi khuẩn kị khí tuỳ tiện trong môi trường đủ ôxy các vi khuẩn phản nitrate hoá
ôxy hoá các hợp chất hữu cơ giống như vi khuẩn hiếu khí bình thường, khi môi
trường thiếu ôxy chúng mới tiến hành khử nitrate.
Quá trình phản nitrate hoá có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí tùy tiện,
nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện thiếu ôxy. Các vi khuẩn phản nitrate hoá là
các tác nhân có hại cho sản xuất nông nghiệp vì làm mất một lượng lớn chất đạm
vô cơ ở dạng NO
3
-
dành cho thực vật. Tuy nhiên, chúng lại là tác nhân quan trọng
trong xử lý nước thải và nước sinh hoạt vì chúng loại bỏ nguồn nitơ liên kết đối với
môi trường sinh thái.
Cần chú ý một tới một số loài vi khuẩn như Alcaligens, Escherichia,
Aeromonas, Enterobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia, Spirillum,
Staphylococcus và Vibrio, chúng chỉ chuyển hoá NO

1999). Cho phản ứng dương tính với kiểm tra catalase và oxidase. Nó được phân
lập lần đầu tiên bởi Burri và Stutzer (Burri và Stutzer, 1895), có tên gọi là Bacillus
denitrificans II, sau đó được đổi tên thành Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen
(Van Niel và Allen, 1952). Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có dạng không
bình thường và độ sệt thay đổi theo thời gian, có khuẩn lạc thì khô cứng và gắn kết
chặt, có nếp gấp, có khuẩn lạc có màu trắng đục hay màu vàng nhạt (Van Neil và
Allen, 1952; Lalucat và các cộng sự, 2006).
2.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC
Năm 1983, Curtis đã tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng khử nitrate của
ba loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
paracoccus, mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate tạo ra nitơ, nhưng tốc
độ tích lũy số lượng các chất trung gian của chúng khác nhau. Sản phẩm sinh ra
của quá trình khử nitrate của 3 loài vi khuẩn có sự khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn P.
stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N
2
, P. aeruginosa và P.
paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là khí NO
2
. Vi khuẩn P.stutzeri và P.
Paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh nồng độ NO
3
-, NO
2
-, NO
2
và vi khuẩn này
có thể tăng trưởng trong môi trường kỵ khí khi có sự hiện diện của NO
2
trong môi
trường.

một có chứa đồng (Cu-nir). Cả hai loại enzyme này đều tương tự nhau về chức
năng và đặc điểm sinh lý học.
Chèneby cùng cộng sự (2000) tiến hành phân tích 16S rDNA về đặc tính của
vi khuẩn khử đạm phân lập từ 3 vị trí đất nông nghiệp ở Đông bắc nước Pháp, đất
được lấy từ tầng mặt (0-20 cm). Tổng cộng đã phân lập được 138 chủng từ tổng số
1445 chủng vi khuẩn kỵ khí là có khả năng khử đạm. Phân tích hệ thống phát sinh
loài của 16S rDNA của những dòng khử đạm đã phân lập được từ 3 loại đất trên đã
phát hiện sự đa dạng ở một mức độ cao.
Su và đồng nghiệp (2001) tiến hành so sánh sự khử nitrite ở điều kiện hiếu
khí, dưới bầu khí quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC
35512 và P. stutzeri SU2. Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống
xử lý nước thải từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan.
Năm 2002, Sikorski cùng cộng sự sử dụng môi trường SW-LB để phân lập P.
stutzeri từ mẫu môi trường (đất). SW-LB gồm có 10 g/l Bacto Trypton; 5 g/l yeast
extract và 15 g/l agar cùng với nước biển nhân tạo (SW) chứa 24 g/l NaCl; 10,5 g/l
MgSO4.7H2O và 0,11 g/l NaHCO3, có bổ sung 50mg cycloheximide để ngăn
chặn sự phát triển của nấm. Cặp mồi đặc hiệu và rất nhạy dựa trên vùng gen 16S
rDNA được sử dụng trong bài là fps158 và rps743 đã được mô tả bởi Bennasar et
al. (1998) để phân tích sự diện của P. stutzeri trong mẫu môi trường. Phương pháp
này đã cải tiến một chuyên biệt những qui trình phân lập, nhận diện P. stutzeri
được Baggi và cộng sự mô tả năm 1987 bằng đoạn mồi thích hợp và đặc biệt hơn
nữa là có độ nhạy tối đa để khuếch đại mẫu DNA vi khuẩn đã phân lập từ môi
trường. Gia tăng tính chuyên biệt của qui trình phân lập, nhận diện đối với P.
stutzeri có quan hệ với những vi khuẩn khác bằng việc rút ngắn 4 nucleotide ở đầu
5’của mồi ngược rps743, đổi tên thành rps743minus4; mà các nucleotide đó được
cho là đã làm tăng hiệu quả mất ổn định của những lỗi sao chép ở đầu 3’ trong lúc
mồi gắn với các gen của vùng 16S rDNA của vi khuẩn khác hơn là của P. stutzeri.
Cùng lúc đó Lee và đồng nghiệp (2002) nghiên cứu về đặc điểm phân tử của
quần xã vi khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính loại thải nitrate với việc sử dụng phương
pháp dựa trên 16S rDNA. Bài báo cáo cũng đã mô tả một vài đặc tính của một số

C/N là 2,5 : 20 hoặc 25 là những điều kiện nuôi cấy thành công nhất. Nghiên cứu
cũng đồng thời quan sát sự đa dạng của vi khuẩn khử đạm từ bùn hoạt động của hệ
thống xử lý nước thải đô thị. Có 199 vi khuẩn khử đạm đã được phân lập, trong đó,
đa số thuộc về lớp Betaproteobacteria (50,4 %) và Alphaproteobacteria (36,8 %),
còn tìm thấy một số lớp khác như Gammaproteobacteria (5,6 %),
Epsilonproteobacteria (2 %), Firmicutes (4 %) và Bacteroidetes.
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC
Hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn khử đạm P.
stutzeri: Phan Trường Khanh (2007), thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý
ammonia trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm”. Tác giả đã phân lập được 20
dòng vi khuẩn Pseudomonas từ các mẫu đất phù sa, phèn, mặn ở ĐBSCL và nhận
diện được một dòng P. stutzeri bằng cặp mồi đặc trưng 16S rDNA. Bước đầu khảo
sát khả năng khử đạm trong nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia.
Nguyễn Trần Hải Bằng (2008), dùng cặp mồi đặc hiệu nosZ2F-nosZ2R và
cd1-nirF-cd1-nirR đã nhận diện được 6 dòng Pseudomonas stutzeri có chứa gen
nosZ, và 8 dòng có chứa gen cd1-nir.
Tô Thị Lài (2008), ở qui mô phòng thí nghiệm cho thấy các dòng vi khuẩn
P. stutzeri phân lập từ môi trường nuôi cá tra đều có khả năng xử lý
ammonia hiệu quả.
Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học- Trường Đại Học Cần Thơ
(2006) đã thực hiện: phân lập và nhận diện vi khuẩn khử đạm Pseudomonas
stutzeri từ đất và trong các ao nuôi thủy sản.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU:
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
- Nhóm vi sinh vật có khả năng khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử trong
hợp phần trầm tích ao nuôi thuỷ sản:
+ Hoạt lực khử nitrate của vi khuẩn phản nitrate.
+ Đặc điểm sinh học của vi khuẩn phản nitrate.

 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường phản nitrat hóa (nitrat-glucoza): Pepton: 5g/ L, Cao thịt: 3g/ L, KNO
3
:
1g/ L, NH
4
NO
3
: 1g/L, Agar (5g/ L cho môi trường dịch thể và 16g/ L cho môi
trường thạch), NaCl (10-20g/ L)
 Dùng để tách triết DNA vi khuẩn khử đạm
- TE (10mM Tris-HCl [pH 7,6], 1mM EDTA, pH 8,0) hòa tan DNA
- Sodium dodecyl sulfate (SDS)10% hòa tan DNA và giúp proteinase K hoạt động
tách protein khỏi DNA hiệu quả hơn.
- Isopropanol nhằm tủa DNA
- Ethanol 70% dùng rửa DNA
- Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75 M
- Proteinase K (20 mg/ml) để loại bỏ protein hoặc polysaccharid khỏi DNA
- Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) nhằm tủa protein và tạo màng ngăn giữa
DNA và protein.
- Lysozyme
- RNase A
- Nước cất hai lần vô trùng
 Dùng để chạy điện di sản phẩm PCR
- Agarose 1,5% - 2%
- TAE buffer, loading buffer
- Ethidium bromide (EtBr)
- Thang chuẩn 1kb để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel
agarose
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4
+
, NO
2
-
, NO
3
-
và PO
4
3-
).
- Mẫu bùn được lấy bằng thiết bị lấy bùn chuyên dụng hoặc bằng thìa inox đã
khử trùng, một lượng bùn nhất định được cho vào túi nylon (đã được chiếu đèn cực
tím và dán nhãn). Mẫu được bảo quản lạnh trong hộp xốp ở 4
o
C trước khi mang về
phòng thí nghiệm phân tích.
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.3.3.1. Phương pháp phân tích các thông số môi trường
- Xác định NH
4
+
bằng phương pháp Indophenol, so màu trên máy quang phổ
kế ở bước sóng 630 nm.
- Xác định NO
2
-
bằng cách sử dụng thuốc thử diazotizing và so màu trên máy
quang phổ kế ở bước sóng 543nm.

Nhóm vi sinh vật phản nitrat hoá được phân tích bằng phương pháp pha loãng
tới hạn và nuôi cấy trên môi trường phản nitrat lỏng (nitrat-glucoza). Sau 5- 7 ngày
nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả. Những chủng dương tính (có khả năng khử hết
nitrat) với thuốc thử difenylamin hay sinh khí nitơ sẽ được làm thuần trên môi
trường thạch. Định loài bằng phương pháp PCR và đọc trình tự gen 16S rRNA kết
hợp với đặc điểm sinh lý, sinh hoá theo khoá phân loại của Bergey (1989).
b. Nuôi sinh khối vi khuẩn
Cấy chuyển khuẩn lạc đã kiểm tra độ thuần vào ống nghiệm có chứa môi
trường dịch thể phản nitrate và đặt trên máy lắc 5-7 ngày.Các chủng vi khuẩn đã
phân lập, nuôi cấy được cất trữ trong glycerol 15 % (Hallin và Lindgren, 1999)
hoặc glycerol 10% (Sikorski và cộng sự, 2002) cho đến khi lấy ra sử dụng cho các
bước tiếp theo.
3.3.3.3 Phương pháp thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn khử nitrate
Tốc độ phản nitrate được xác định bằng phương pháp ức chế acetylene như mô
tả của Sirensen (1978). Khí N
2
O được phân tích bằng máy sắc ký khí. Tốc độ phản
nitrate được tính toán dựa trên sự chênh lệch nồng độ nitrate trước và sau thời gian
nuôi ủ 4h, tại nhiệt độ 20
o
C dưới điều kiện kị khí.
3.4. TỔNG HỢP, XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
- Các số liệu, kết quả nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học.
-Số liệu được nhập, tổng hợp và xử lí bằng phần mềm excel 2010.
DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
4.1. KẾT QUẢ CHÍNH DỰ KIẾN SẼ ĐẠT ĐƯỢC
- Nắm vững được các phương pháp cơ bản trong nghiên cứu vi sinh vật
- Phân lập được một số chủng vi khuẩn phản nitrate có trong các đầm nuôi tôm.
- Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn phản nitrate có hoạt tính cao, từ đó đưa ra
hướng ứng dụng của chúng vào xử lý môi trường ao nuôi thuỷ sản ven biển.