BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TRẦN THỊ ðÀO
ðÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT
THỰC VẬT LÊN SỰ SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ
HOẠT TÍNH ENZYME UREASE CỦA MỘT SỐ
VI KHUẨN ðẤT
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 80
giáo – PGS. TS. Nguyễn Tất Cảnh, giảng viên Bộ môn Canh Tác-Khoa Nông
học và TS. Nguyễn Thành Trung, giảng viên Bộ môn Công nghệ vi sinh-Khoa
Công nghệ sinh học-Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện,
hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ sinh
học, các thầy cô giáo; Cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Công nghệ vi sinh-
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá
trình học tập cũng như trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè luôn bên cạnh động viên,
giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, học tập và làm thực tập tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 2 tháng 10 năm 2012
Học viên Trần Thị ðào
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG vi
2.2. Giới thiệu về vi sinh vật đất 9
2.2.1. Thành phần vi sinh vật đất 9
2.2.2. Vai trò của vi sinh vật đất 10
2.3. Cấu trúc và chức năng của enzyme urease 11
2.3.1. Cấu trúc phân tử và hoạt động của enzyme urease 11
2.3.2. Vai trò của enzyme urease 14
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iv
2.4. Các chất ức chế hoạt động enzyme urease 16
2.4.1. Ảnh hưởng của các hợp chất vô cơ đến khả năng hoạt động của
enzyme urease 16
2.4.2. Một số chất hữu cơ kìm hãm hoạt động enzyme urease 18
2.5. Vai trò của dịch chiết thực vật trong hoạt động kháng khuẩn 20
III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
3.1. Vật liệu 24
3.2. Môi trường 24
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
4.1. Kết quả thu thập các mẫu thực vật mục tiêu từ Sa Pa – Lào Cai 34
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
v
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn amôn hóa trong đất trồng lúa vùng đồng
bằng sông Hồng Gia Lâm – Hà Nội 40
4.3. Kết quả giải trình tự 16s rDNA của các isolate phân lập được 46
4.3.1. Kết quả nhân 16s rDNA của các chủng phân lập 46
4.3.2. Kết quả giải trình tự 16s rDNA của các chủng phân lập được 47
4.4. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật đến sinh
trưởng, phát triển của vi khuẩn phân lập được 48
4.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật đến hoạt tính
enzyme urease 51
4.5.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật chiết bằng nước
cất đến hoạt tính enzyme urease thương mại 52
4.5.2. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật chiết bằng các loại
dung môi hữu cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease 56
Lâm – Hà Nội 41
Bảng 4.5. Kết quả Blast trình tự 16s rDNA của isolate R17 47
Bảng 4.6. Khả năng kìm hãm của các mẫu dịch chiết thực vật chiết bằng
nước đến sinh trưởng, phát triển của các isolate phân lập được 50
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
vii
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1. Các quá trình chuyển hóa đạm trong đất (Courtney Johnson, 2005) 4
Hình 2. Trung tâm hoạt động của urease dựa trên phân tích sinh lý
và quang phổ (Mobley et al., 1995) 12
Hình 3. Cấu trúc tinh thể trung tâm hoạt động của enzyme urease
(Mobley và cộng sự, 1995) 13
Hình 4. Cơ chế hoạt động của enzyme urease (Mobley và cộng sự, 1995) 14
Hình 5. Các hợp chất vô cơ ức chế hoạt động của enzyme urease
(Shabana, 2010) 17
Hình 6. Các dạng cấu trúc của quercetin glycoside (Shabana, 2010) 19
Hình 7. Kết quả kiểm tra các mẫu vi khuẩn amôn hóa phân lập được
trên môi trường Christene’s urê agar 45
Hình 8. Kết quả nhân gen 16s rDNA với cặp mồi 16sF1 và 16sR1 46
Hình 9. Kết quả Blast trình tự 16s rDNA của isolate R17 48
Hình 10a. Khả năng ức chế sinh trưởng isolate R19 của các mẫu dịch chiết
thực vật chiết bằng nước cất 49
Hình 10b. Khả năng ức chế sinh trưởng isolate R20 của các mẫu dịch chiết
thực vật chiết bằng nước cất 49
Hình 11a. Ảnh hưởng của dịch chiết dàng mê công và dịch chiết Puồng
đìa nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 53
Hình 11b. Ảnh hưởng của dịch chiết đìa chụt và dịch chiết đìa sài đến hoạt
CT: Công thức
DCD: Dicyandiamide
DCTV: Dịch chiết thực vật
H. pyroli: Helicobacter pyroli
IC: Inhibitor concentration
MT: Môi trường
LB: Luria Broth
nBTPT: N-(n-butyl) thiophosphoric triamide
NCBI: National center for biotechnology information
PCR: Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction)
SB: Sodium phosphate buffer
WHO: World health organism
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
1
I. MỞ ðẦU
1.1 ðặt vấn ñề
Urê là loại phân bón hiện nay được sử dụng rộng rãi trên thế giới và ở
Việt Nam. Đây là một loại phân đạm dạng hạt, có hàm lượng đạm khá cao trong
phân (46%). Do giá thành sản xuất thấp, đồng thời có ít nguy cơ làm tăng độ
chua của đất nên phân urê hiện được sử dụng rộng rãi (Tisdale et al., 1985). Urê
là loại phân dễ hoà tan trong nước. Nó có thể tồn tại ở hai dạng là phân urê
amôn nitrat và phân urê hỗn hợp. Tuy nhiên, phân urê có hai nhược điểm là
dễ dàng bị mất đạm do bốc hơi khi bón lên bề mặt đất (Fenn & Hossner,
1985) và dễ làm tổn thương hạt giống cây trồng nếu bón gần hạt với nồng độ
cao. Khi được bón vào đất, urê bị thủy phân rất nhanh thành amôn (NH
3
hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật cũng rất đa dạng và tác dụng của chúng
đến hệ sinh thái, đến sản xuất nông nghiệp có tiềm năng to lớn. Gần đây,
nhóm nghiên cứu của Trường ĐHNN Hà Nội đã tiến hành thu thập một số
loài cây bản địa của Việt Nam thuộc nhóm cây trong bài thuốc tắm của
người Dao đỏ ở Sa Pa-Lào Cai. Dịch chiết từ những loài thực vật này đã
được sử dụng để kiểm tra khả năng làm giảm quá trình mất đạm trên một
số ruộng trồng lúa và ngô. Kết quả bước đầu cho thấy, một số dịch chiết
thực vật có tác dụng kìm hãm quá trình mất đạm thể hiện qua lượng phân
đạm được sử dụng thấp hơn mà cây trồng vẫn duy trì, thậm chí sinh trưởng
và phát triển tốt hơn so với đối chứng (Đỗ Thanh Bình, 2010; Bùi Hữu
Ngọc, 2010). Dựa trên kết quả này, nhóm nghiên cứu đã sơ bộ nhận định
rằng, một số dịch chiết thực vật có nguồn gốc từ Sa Pa-Lào Cai có khả
năng làm giảm quá trình mất đạm trong đất nông nghiệp. Do đó, đề tài
“ðánh giá ảnh hưởng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh trưởng
phát triển và hoạt tính enzyme urease của một số vi khuẩn ñất” được
thực hiện sẽ là cơ sở cho việc sử dụng các dịch chiết thực vật nhằm làm
tăng hiệu quả sử dụng đạm urê trong sản xuất nông nghiệp.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
3
1.2. Mục ñích, yêu cầu
1.2.1 Mục ñích
- Xác định được dịch chiết thực vật có khả năng kìm hãm hoạt tính
enzyme urease.
- Đánh giá được tác động của dịch chiết thực vật lên sự sinh trưởng của vi
sinh vật chuyển hóa đạm trong đất.
1.2.2. Yêu cầu
- Thu thập một số mẫu thực vật sinh trưởng tại vùng Sa Pa – Lào Cai
- Phân lập và bảo tồn nhóm vi khuẩn amôn hóa trên đất phù sa sông Hồng
(Courtney Johnson, 2005).
Hình 1. Các quá trình chuyển hóa ñạm trong ñất (Courtney Johnson, 2005)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
5
2.1.1. Quá trình cố ñịnh nitơ trong ñất
Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình đồng hóa nitơ của không khí
thành nitơ dưới dạng amôn nhờ tác dụng của các vi sinh vật đất có khả năng sinh
enzyme nitrogenase.
N
2
+ 6e + 12ATP + 12H
2
O 2NH
4
+
12ADP + 12P + 4H
+
Có nhiều loài vi khuẩn trong đất có khả năng cố định nitơ phân tử. Trong
đó, có 3 nhóm chính: nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh (Rhizobium sp),
nhóm vi khuẩn cố định sống tự do trong đất (Azotobacter sp, Clostridium sp) và nhóm
vi tảo cố định nitơ (Lương Đức Phẩm, 2009).
2.1.2. Quá trình amôn hóa
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ
khác chứa nitơ tạo thành amôniac.
Các vi khuẩn có khả năng amôn hóa bao gồm nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn
sinh bào tử và không sinh bào tử. Đa số vi sinh vật amôn hóa thuộc nhóm đa
thực. Khi sinh trưởng trong môi trường chứa nhiều thành phần protein, các vi
thành NH
3
, CO
2
và nhiều sản phẩm trung gian khác. Khi phân giải các amino
acid chứa S (như metionin, xistin, xistein), vi sinh vật giải phóng ra H
2
S và nếu
tích lũy nhiều H
2
S trong đất sẽ làm thối rễ cây trồng. Ngoài ra, khi phân giải
tryptophan, một số vi sinh vật có thể sinh ra chất có mùi thối là indon và scaton.
Một số amin sinh ra trong quá trình khử cacboxyl của các amino acid có thể độc
với người và gia súc, đáng chú ý là histamin, acmatin, putrexin, cadavein.
* Các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải protein:
Các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải protein đa dạng và phong phú
bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn. Vi khuẩn có khả năng phân giải protein bao
gồm: Bacillus mycoides, Bacillus mesentercus, Bacillus subtilis, Proteus
vulgaris, Chromobacterium prodigiosum, Pseudomonas fluorescens,
Escherichia coli, Clostridium sporogenes. Xạ khuẩn có khả năng phân giải
protein bao gồm: Streptomyces griseus, Streptomyces rimesus. Nhiều chủng nấm
cũng có khả năng phân giải protein như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus,
Aspergillus terricoda, Aspergillus niger, Penicillum camomberli, Mucor. Các vi
sinh vật này đều có khả năng sinh enzyme protease, peptidase xúc tác quá trình
thủy phân liên kết peptit và một số liên kết khác (Nguyễn Xuân Thành, 2007).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
7
Amôn được sinh ra có thể được cây trồng hấp thụ hoặc tham gia vào quá
Bacillus pasteurii, Bacillus hesmogenes, Bacillus psichrocatericus, Bacillus
amylovorum, Pseudobacterium eruolyticum, Chromobacterium, Proteus
vulgaris. Vi khuẩn phân giải urê thường thuộc loại háo khí hoặc kỵ khí không
bắt buộc, chúng phát triển tốt ở pH = 6,5 – 8,5.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
8
2.1.3. Quá trình nitrat hóa
Quá trình nitrat hóa là quá trình chuyển hóa amôn thành nitrat bởi tác
động của vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí. Quá trình này được thực hiện qua
hai giai đoạn: giai đoạn nitrite hóa và giai đoạn nitrat hóa bởi hai nhóm vi khuẩn
tuần tự nối tiếp nhau được gọi chung là vi khuẩn nitrat hóa (Lương Đức Phẩm, 2009).
NH
4
+
NO
2
-
NO
3
-
amôn nitrite nitrate
Cây trồng có thể hấp thụ dinh dưỡng nitơ ở cả 2 dạng: dạng amôn và dạng
nitrat. Tuy nhiên, nitrat mang điện tích âm và không được giữ trong đất. Do vậy,
nitrat dễ bị rửa trôi khi gặp điều kiện phù hợp. Ngược lại, amôn mang điện tích
dương và được duy trì bởi khả năng trao đổi cation của đất. Hơn nữa, trong điều
kiện yếm khí, nitrat bị giảm do quá trình phản nitrat hóa thành N
2
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
9
2.2. Giới thiệu về vi sinh vật ñất
2.2.1. Thành phần vi sinh vật ñất
Đất là môi trường lý tưởng đối với nhiều loài vi sinh vật. Hệ vi sinh vật
trong đất rất phong phú và đa dạng, bao gồm: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, nhiều
loại tảo, nguyên sinh động vật. Trong đó, vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất
về số lượng. Trong một gram đất có hàng trăm, hàng nghìn triệu vi khuẩn.
Chúng bao gồm vi khuẩn háo khí, vi khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dưỡng, vi
khuẩn dị dưỡng. Số lượng và thành phần hệ vi sinh vật đất thay đổi theo điều
kiện sống trong đất. Chúng phụ thuộc vào thành phần hóa học, tính chất cơ lý,
pH đất, nhiệt độ, độ ẩm và mức thoáng khí trong đất. Ngoài ra, vi sinh vật đất
còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố khí hậu, thời gian trong năm, phương thức
canh tác, cây trồng che phủ.
Số lượng vi sinh vật đất thay đổi theo độ sâu của đất. Trên bề mặt đất và
sâu xuống 0,5cm, số lượng vi sinh vật thường rất ít. Do ở lớp đất này, vi sinh vật
chịu ảnh hưởng lớn bởi tác động của bức xạ mặt trời. Ở độ sâu 10 - 20 cm so với
bề mặt, đất có độ ẩm thích hợp, các chất dinh dưỡng tích luỹ nhiều, không bị tác
động của bức xạ mặt trời nên vi sinh vật phát triển nhanh, các quá trình chuyển
hoá quan trọng trong đất chủ yếu xảy ra trong tầng đất này. Số lượng và thành
phần vi sinh vật sẽ giảm đi khi độ sâu của đất hơn 30 cm và tại độ sâu 4 - 5m
hầu như rất ít (trừ trường hợp đất có mạch nước ngầm). Mặt khác, số lượng và
thành phần vi sinh vật trong đất còn thay đổi tuỳ chất đất. Ở nơi đất nhiều chất
hữu cơ, giàu chất mùn, điều kiện hiếu khí tốt, độ ẩm đất thích hợp vi sinh vật
phát triển mạnh. Trong khi những nơi đất có lẫn đá, cát số lượng và thành phần
vi sinh vật ít hơn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
2.080.000
119.000
25.000
20 - 25 2.179.000
245.000
50.000
5.000
35 - 40 570.000
49.000
14.000
500
65 - 75 11.000
5.000
6.000
100
135
-
Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường đất là rất lớn. Vi sinh vật đất
không những tham gia vào các quá trình tổng hợp các chất cần thiết cho cây
trồng, tăng nguồn dinh dưỡng cho đất mà còn tham gia vào các quá trình phân
giải các hợp chất hữu cơ trong đất, tạo thành mùn làm tăng độ phì cho đất. Bên
cạnh đó, vi sinh vật đất có vai trò tăng cường chuyển hóa các chất vô cơ chứa
nitơ, phospho, lưu huỳnh, sắt, mangan từ các dạng khó tan thành dạng dễ tan
cho cây trồng sử dụng. Hơn nữa, nhờ có hệ vi sinh vật, đất có thể được sử dụng
như các cánh đồng lọc sinh học cho các loại nước thải sinh hoạt, nước thải chế
biến thực phẩm có chứa các chất hữu cơ dễ dàng phân hủy, giàu nitơ, phospho
nhưng không chứa kim loại nặng vượt mức cho phép (Lê Xuân Phương, 2008).
Sở dĩ hệ vi sinh vật đất có vai trò quan trọng trong chuyển hóa các
chất dinh dưỡng trong đất là vì chúng có khả năng tiết ra ngoài môi trường
ngoại bào rất nhiều loại enzyme như amylase, protease, phytase, urease,…
Những enzyme này tham gia vào quá trình thủy phân, chuyển hóa các hợp
chất hữu cơ tồn tại sẵn trong đất cũng như thông qua hoạt động sản xuất
nông nghiệp dưới dạng phân bón. Khi bón phân urê vào đất, hợp chất này sẽ
được chuyển hóa thành các dạng khác nhau thông qua sự hoạt động của hệ
vi sinh vật amôn hóa, nitrit hóa, nitrat hóa. Nhóm vi sinh vật này đều có khả
năng tiết ra enzyme urease, xúc tác cho quá trình thủy phân urê cung cấp
dạng nitơ dễ tiêu cho cây trồng.
2.3. Cấu trúc và chức năng của enzyme urease
2.3.1. Cấu trúc phân tử và hoạt ñộng của enzyme urease
2.3.1.1. Cấu trúc phân tử của enzyme urease
Enzyme urease là enzyme liên kết với ion kim loại Nikel (Ni). Cấu
trúc phân tử, số lượng, kiểu dáng của các tiểu cấu tử, khối lượng phân tử và
trình tự amino acid của enzyme urease phụ thuộc vào nguồn gốc sinh ra nó.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
12
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
13
Cấu trúc trung tâm hoạt động 2 ion Ni của enzyme urease được xác định
bằng phân tích cấu trúc tinh thể. Các phối tử với trung tâm kim loại của enzyme
urease bao gồm các đuôi UreC. Lys-217 được carbamyl hóa cho phép Lys-217
tạo thành cầu nối giữa 2 ion Ni. Một phân tử nước được liên kết chính với các
ion Ni, được điều phối bởi ASP-360, 134, 136 tạo nên một cấu trúc hình cầu.
Một ion kim loại ở cấu trúc năm thành phần và một ion kim loại khác ở cấu trúc
4 thành phần có một phần chiếm giữ ở phía dưới. His219 và His320 là môi
trường trung gian với trung tâm kim loại. Cấu trúc này thuận lợi cho sự liên kết
cơ chất.
Hình 3. Cấu trúc tinh thể trung tâm hoạt ñộng của enzyme urease
(Mobley và cộng sự, 1995)
2.3.1.2. Cơ chế hoạt ñộng của enzyme urease
Enzyme urease có trung tâm hoạt động liên kết với hai ion Ni. Các phối tử
liên kết với trung tâm hoạt động của enzyme urease của vi khuẩn bao gồm cầu
lysine cacbamate, một cầu nối phân tử nước, 4 imidazone histidine có chứa liên
kết đôi với 1 ion Ni và một aspartic có phần đuôi liên kết với một ion Ni. Cơ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
14
chất urê bám vào vị trí O liên kết với một ion Ni dẫn đến phân cực nhóm
cacbonyl của urê. His320 hoạt động như một chất nền chung (B) hoạt hóa phân
tử nước (hoặc nhóm hydroxyl) đã được liên kết với ion Ni thứ hai. Ái lực của
nhóm hydroxyl với nhóm cacbonyl của urê tạo nên thể tứ bội trung gian phân
hủy thành cacbamate giải phóng NH
3
tăng trong cơ thể gây ra một số rối loạn
thần kinh dẫn tới bệnh Parkinson (Amtul et al., 2002). Một số nghiên cứu gần
đây cho thấy, nhiễm H. pylori cũng liên quan đến các bệnh động mạch vành và
bệnh tim (Danesh et al., 1998; Mendall et al., 1994; Tougas et al., 1999).
2.3.2.2. Vai trò enzyme urease trong nông nghiệp
Trong nông nghiệp, enzyme urease sinh ra bởi các vi sinh vật phân bố
rộng rãi trong các môi trường đất và môi trường nước, nơi mà nó đóng một vai
trò thiết yếu trong quá trình trao đổi nitơ (Bast, 1986). Ví dụ, quá trình phân hủy
protein và tạo nucleotide yêu cầu hoạt động của enzyme urease. Việc bón phân
urê hiệu quả đòi hỏi quá trình thủy phân urê phải được kiểm soát để nâng cao
hiệu quả phân bón và giảm thiểu thiệt hại cây trồng.
Khả năng nitơ bị cố định là yếu tố giới hạn chính tới năng suất nông
nghiệp. Hai hình thức tồn tại chính của nitơ trong môi trường đất là protein
và polynucleotide. Các hợp chất này bị thủy phân thành amino acid và
monor nucleotide và sau đó tiếp tục bị thủy phân bởi nhiều enzyme tạo
thành amôn. Sản phẩm amôn có thể được các vi sinh vật và cây trồng tiếp
nhận và sử dụng. Tuy nhiên, trong nhiều môi trường, mức độ sẵn có các
hợp chất nitơ là không đủ để tạo năng suất cây trồng tối ưu. Vì vậy, các
Copyright: Tài liệu đại học ©