BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN QUANG CHẨN

XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN ĐỊNH
TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA
CAO ĐẶC XẤU HỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG CHẨN

XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN ĐỊNH
TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA
CAO ĐẶC XẤU HỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Nguyễn Quỳnh Chi

MỤC LỤC
TRANG BÌA PHỤ
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1-TỔNG QUAN 2
1.1. Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái 2
1.1.2. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 3
1.1.3. Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L. 3
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của Xấu hổ Mimosa pudica L. 6
1.1.5. Sử dụng loài Mimosa pudica L. trong YHCT 12
CHƢƠNG 2-ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 13
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 13
2.1.2. Các trang thiết bị nghiên cứu 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
- Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ 15
- Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng cao
đặc Xấu hổ. 15
- Đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ 15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ 15
2.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng
cao đặc Xấu hổ. 16
2.3.3. Đánh giá độc tính cấp của cao đặc Xấu hổ 17
CHƢƠNG 3-THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1. Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ 19

Lethal dose 50%
MCP
Monocyte chemotactic protein
NP/PEG
Natural product / Polyethylenglycol
OVA
Ovalbumin
P/ƣ
Phản ứng
TT
Thuốc thử
UV
Ultraviolet
YHCT
Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
3.1
Hàm ẩm các mẫu dƣợc liệu.
19

1.3
Công thức cấu tạo một số sterol trong Xấu hổ
6
2.1
Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.)
13
3.1
Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng 3 mẫu cao đặc Xấu hổ quan sát ở
UV 254 nm (A), 366 nm (B) và sau khi hiện màu bằng thuốc
thử vanillin - acid sulfuric (C)
29
3.2
Mô tả sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao đặc Xấu hổ sau khi hiện
màu bằng thuốc thử vanillin - acid sulfuric (Hệ dung môi 1)
30
3.3
Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng 3 mẫu cao đặc Xấu hổ quan sát ở
UV 254 nm (A), 366 nm (B); sau khi hiện màu bằng thuốc thử
NP/PEG quan sát ở ánh sáng thƣờng (C) và quan sát ở UV 366
nm (D)
32
3.4
Mô tả sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao đặc Xấu hổ sau khi hiện
màu bằng thuốc thử NP/PEG (Hệ dung môi 2)
33
1


Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa Hồng (Rosidae)
Bộ: Đậu (Fabales)
Họ: Đậu (Fabaceae)
Phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae)
Chi: Mimosa
Loài: Mimosa pudica L.
1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái
Cây nhỏ, mọc hoang lòa xòa ở ven đƣờng cái, thân có gai hình móc. Lá 2 lần kép
lông chim, nhƣng cuống phụ xếp nhƣ hình chân vịt; khẽ động vào lá cụp xuống.
Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ 2 đôi, có lông trắng cứng.
Lá chét 15-20 đôi nhỏ, gần nhƣ không có cuống.
Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan. Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ
thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép. Hạt gần
nhƣ hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1,5mm [10]. Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều
hoa nhỏ xếp thành đầu tròn, màu tím hồng; đài nhỏ hình đấu; tràng 4 cánh dính
nhau ở nửa dƣới; nhị 4, rất mảnh, bầu 4 noãn.
Mùa hoa quả: tháng 6-8.
3

Ở Việt Nam, Xấu hổ phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi có độ
cao dƣới 1000m [13].
1.1.2. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
- Phần trên mặt đất, thu hái vào mùa hè khi cây đang phát triển xanh tốt, cắt lấy
phần trên mặt đất, rửa sạch, phơi khô.
- Rễ đào quanh năm rửa sạch, thái mỏng, phơi hay sấy khô [10], [13].
1.1.3. Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L.
1.1.3.1. Các hợp chất vô cơ
- Xấu hổ là loài có hàm lƣợng selen cao. Hàm lƣợng selen có sự dao động lớn theo
mùa và theo vùng thu hái. Xấu hổ mọc ở các tỉnh khác nhau ở Việt Nam có hàm

- rhamnopyranosyl - (1 → 2) β - D -
glucopyranosyl - flavon

5, 7, 3’, 4’ - tetrahydroxyl - 6 - C - [α - L
- rhamnopyranosyl - (1 → 2) β - D -
glucopyranosyl - flavon

6, 7, 3’, 4’ - tetrahydroxyl - 8 - C - [α
- L - rhamnopyranosyl - (1 → 2)] - β
- D - glucopyranosyl - flavon

O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
CH
3
O
O
OH
OH
OH

OH
OH
OH
O
OH
OH
O
HO
HO
O
O
CH
3
OH
OH OH
O
OH
OH
OH
5
5, 7, 3’, 4’ - tetrahydroxyl - 8 - C - [β - D
- apiose - (1 → 4)] - β - D -
glycopyranosyl - flavon
cassiaoccidentalin B

3
C
HO
O
O
O
OH
OH
OH
H
3
C
O
OH
OH
OOH
HO
O
HO
HO
OH OH
O
OH
OH
O
HO
OH
O
OH
OH


β-sitosterol
α-spinasterol stigmasterol
stigmastanol
Hình 1.3. Công thức cấu tạo một số sterol trong Xấu hổ.
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của Xấu hổ Mimosa pudica L.
Trên thế giới, Xấu hổ đã đƣợc nghiên cứu với nhiều tác dụng sinh học khác nhau.
OO
OH O
OH
O
OH
OH
HO
HO
7

 Tác dụng làm lành vết thƣơng
Điều trị vết thƣơng bằng thuốc mỡ chứa 2% (w/w) dịch chiết methanol và 2%
(w/w) dịch chiết nƣớc toàn phần cho thấy tác dụng làm lành vết thƣơng đáng kể
(P<0,001). Tác dụng làm lành vết thƣơng có thể là do thành phần các chất phenol.
Hàm lƣợng phenol toàn phần trong dịch chiết methanol và dịch chiết nƣớc toàn
phần cây Xấu hổ đƣợc xác định lần lƣợt là 11% (w/w) và 17% (w/w) [23].
 Tác dụng chống co giật
Nƣớc sắc lá Xấu hổ tiêm màng bụng với liều 1-4g/kg có tác dụng bảo vệ chuột
khỏi các cơn co giật gây ra bởi pentylentetrazol và strychnin nhƣng không có tác
dụng chống lại sự co giật gây ra bởi picrotoxin. Nó cũng làm giảm những thay đổi

Bangarus caerulus [27].
 Tác dụng trên chu kỳ rụng trứng
Dịch chiết methanol rễ Xấu hổ cho chuột uống với liều 300 mg/kg/ngày trong 20
ngày liên tiếp, có tác dụng kéo dài chu kỳ sinh sản với sự tăng lên đáng kể khoảng
thời gian không giao phối và giảm số lần đẻ ở chuột bạch. Số lƣợng các lần đẻ tăng
lên trong giai đoạn sau điều trị. Phân tích các hormon liên quan đến sự điều tiết chu
kỳ sinh sản cho thấy dịch chiết rễ có tác dụng ức chế giải phóng gonadotropin và
bài tiết estradiol [21].
 Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết methanol phần trên mặt đất cây Xấu hổ cho thấy tác dụng chống oxy
hóa trên in vitro khi sử dụng thử nghiệm dọn gốc tự do 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl-hydrate. Dịch chiết này có tác dụng chống oxy hóa vừa phải (IC
50
=
296.92μg/ml) khi so với acid ascorbic (IC
50
= 131.29μg/ml) [18], [30].
 Tác dụng chống sốt rét
Dịch chiết ethanol lá Xấu hổ đƣợc nghiên cứu tác dụng chống sốt rét trên chuột
nhiễm Plasmodium berghei và kết quả cho thấy dịch chiết này có tác dụng chống
sốt rét đáng kể ở cả 3 mô hình đánh giá. Tác dụng này có thể liên quan đến các
thành phần trong dịch chiết có tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét nhƣ: terpenoid,
flavonoid và alkaloid [14].
9

 Tác dụng chữa giun sán
Các dịch chiết ether dầu hỏa, ethanol và nƣớc của hạt Xấu hổ tại các nồng độ
khác nhau (100, 200, 500 mg/kg) đƣợc thử trên loài giun Pheretima posthuma, dùng
phƣơng pháp kiểm nghiệm sinh học đánh giá tình trạng tê liệt và thời gian chết của
giun. Kết quả cho thấy dịch chiết cồn và dịch chiết nƣớc có tác dụng đáng kể gây tê

 Tác dụng ức chế thần kinh trung ƣơng
Một số kết quả nghiên cứu chứng minh kinh nghiệm trong nhân dân dùng cây
Xấu hổ chữa mất ngủ. Cao toàn cây Xấu hổ có tác dụng kéo dài thời gian ngủ do
thuốc ngủ barbituric nhƣ hexanbarbital và cả meprobamat [13].
 Tác dụng giải độc arsen
Uống cao toàn cây Xấu hổ trƣớc 24h hoặc uống cùng một lúc với một liều asen
trioxid độc gây chết cho chuột nhắt trắng, thấy cao có tác dụng bảo vệ và làm giảm
số chuột chết so với lô chứng [13].
 Tác dụng kích thích tình dục
Dịch chiết ethanol rễ Xấu hổ có khả năng làm tăng hoạt động tình dục ở chuột
đực, đặc biệt có tác dụng đáng kể ở liều 500 mg mà không gây loét đƣờng tiêu hóa
và tác dụng phụ [28].
 Một số tác dụng khác đang đƣợc nghiên cứu có hiệu quả nhƣ điều trị chứng
rong kinh [22], bệnh viêm đƣờng tiết niệu [40].
 Tác dụng chống co thắt khí phế quản
 Nghiên cứu trên thế giới [20]
Dịch chiết ethanol 80
0
cây Xấu hổ có các tác dụng sau:
- Ức chế sự di chuyển của tế bào HMC-1
Sự thâm nhập của tế bào là giai đoạn quan trọng gây phản ứng viêm. Kết quả cho
thấy sau khi dùng dịch chiết Xấu hổ 10μg/mL trong 1h, sự xâm nhập của tế bào
HMC-1 đã giảm đáng kể.
- Làm giảm sự giải phóng MCP-1 và IL-6 do HDM trong tế bào EoL-1
11

HDM là một tác nhân gây dị ứng ở bệnh nhân hen phế quản và làm tăng nồng độ
cytokin từ các tế bào khác nhau. Để xác định nồng độ cytokin liên quan tới hen phế
quản, tế bào EoL-1 đƣợc xử lý sơ bộ bằng dịch chiết Xấu hổ trong 1h và sau đó
đƣợc dùng HDM 1μg/mL trong 24h. Kết quả cho thấy dịch chiết Xấu hổ ức chế

hình gây viêm tại phổi do Sephacryl S-200, đƣa các giá trị này về gần tƣơng tự lô
chứng thƣờng.
Dịch chiết nƣớc Xấu hổ làm giảm thâm nhiễm rõ rệt các tế bào viêm vào trong tổ
chức phổi, đặc biệt là số lƣợng bạch cầu ƣa acid khi so sánh với lô chứng bệnh [1].
1.1.5. Sử dụng loài Mimosa pudica L. trong YHCT
Theo YHCT, Xấu hổ có vị ngọt, se, tính hơi hàn, có ít độc, có tác dụng an thần,
dịu cơn đau, long đờm, chống ho, hạ nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu [8].
Trên thế giới, Y học truyền thống của nhiều nƣớc đã sử dụng Xấu hổ với nhiều
tác dụng khác nhau: chống độc, giải độc gan, chữa lành vết thƣơng, chống oxy hóa.
Toàn cây đƣợc dùng làm thuốc để điều trị các bệnh: vàng da, phong, tả, các bệnh về
âm đạo và tử cung, chống viêm, suy nhƣợc, mệt mỏi, các bệnh về máu [38]. Ở
Cameroon, dịch chiết nƣớc của loài này đƣợc sử dụng để điều trị trong trƣờng hợp
cấp và mạn tính các vấn đề liên quan đến bệnh đau đầu (chứng đau nửa đầu), mất
ngủ và phổ biến hơn là chứng rối loạn lo âu [15]. Ở Đôminica, nƣớc hãm sắc của
Mắc cỡ (Xấu hổ) với Cỏ voi (Panicum maximum Jacquin) dùng để điều trị bệnh
phổi [8].
Ở nƣớc ta, Xấu hổ thƣờng dùng để điều trị: suy nhƣợc thần kinh, mất ngủ, viêm
phế quản, viêm kết mạc cấp, viêm gan, viêm ruột non, sỏi tiết niệu, phong thấp tê
bại, huyết áp cao (không dùng cho phụ nữ có thai), dùng ngoài trị chấn thƣơng,
viêm mủ da, dùng tƣơi giã đắp. Rễ cây cũng đƣợc dùng uống trị sốt rét, kinh nguyệt
khó khăn, hen suyễn, dùng gây nôn. Hạt dùng trị hen suyễn và gây nôn [8].
13

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
* Mẫu nghiên cứu:
Bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ đƣợc thu hái ở 3 vùng: Hà Nội (tại huyện
Từ Liêm, tháng 8/2013), Phú Thọ (tại huyện Lâm Thao, tháng 9/2013) và Thanh
Hóa (tại TP Thanh Hóa, tháng 9/2013). Cả 3 mẫu nghiên cứu đều đƣợc giám định

Cách pha thuốc thử vanillin - acid sulfuric: Pha 2 dung dịch:
Dung dịch vanillin 1% trong ethnol.
Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol.
Trộn đồng thể tích 2 dung dịch thu đƣợc thuốc thử vanillin - acid sulfuric.
- Chất đối chiếu: rutin (Viện kiểm nghiệm cung cấp), β - sitosterol.
- Bản mỏng tráng sẵn HPTLC Silicagen 60 F
254
.
- Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thƣờng quy (bông, giấy lọc, ống nghiệm, bình
nón, bình gạn, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pipet…), dụng cụ chiết hồi lƣu (bếp, bình
cầu, ống sinh hàn…) và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm (mao quản, cốc
chạy sắc ký…).
15

- Các dụng cụ cho chuột uống thuốc: bơm, kim tiêm.
2.1.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Tủ sấy SHELLAB, tủ sấy MODEL UNB 500
- Cân phân tích Precisa
- Cân kỹ thuật Sartorius
- Máy cất quay Buchi ROTAVAPOR R-200
- Máy xác định hàm ẩm SARTORIUS
- Bếp đun cách thủy, bếp điện
- Hệ thống máy chấm sắc ký tự động Linomat V
- Buồng chụp sắc ký gắn máy ảnh Camag reprostar 3
- Máy ảnh Canon ISUS 115
- Máy vi tính với phần mềm VideoScan 1.01
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Chiết xuất dạng cao đặc Xấu hổ.
- Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng cao đặc
Xấu hổ.


    
 
Trong đó: m
1
-

khối lƣợng dƣợc liệu (gam)
m

- khối lƣợng cao đặc thu đƣợc (gam)
H
1
- hàm ẩm của dƣợc liệu (%).
2.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp
mỏng cao đặc Xấu hổ
2.3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
Xác định sự có mặt của các nhóm chất trong 3 mẫu cao đặc Xấu hổ theo phƣơng
pháp ghi trong tài liệu [4]. Từ kết quả định tính đề xuất một số tiêu chuẩn định tính
cao đặc Xấu hổ bằng phản ứng hóa học.
2.3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp cho 2 nhóm chất kém phân cực và phân cực,
khảo sát trên 3 mẫu dƣợc liệu.
- Đối với nhóm chất kém phân cực lựa chọn chất đối chiếu là β-sitosterol.
- Đối với nhóm chất phân cực lựa chọn chất đối chiếu là rutin.
Mẫu thử và mẫu đối chiếu đƣợc đƣa lên bản mỏng nhờ hệ thống máy chấm sắc ký
tự động Linomat V. Hình ảnh sắc ký đồ đƣợc xử lý trên phần mềm VideoScan 1.01.
17

So sánh các vết trên sắc ký đồ của 3 mẫu và so sánh với chất chuẩn. Bƣớc đầu đƣa