BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
LÊ THANH MINH XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CHẤT LƢỢNG VIÊN NGẬM DƢỚI
LƢỠI ASLEM 1 mg KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.
TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, ngƣời đã cống hiến hết mình vì sự nghiệp giáo
dục, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và hƣớng dẫn em trong suốt quá trình nghiên
cứu, hoàn thành khóa luận.
Em xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu
đã cung cấp chất chuẩn, chế phẩm để em có thể thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội, các thầy cô, anh chị Phòng kiểm nghiệm, phân tích và tƣơng
đƣơng sinh học – Viện Công nghệ dƣợc phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi để em thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những ngƣời luôn động
viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực
hiện đề tài.
Hà nội, ngày tháng năm
Sinh viên

Lê Thanh Minh
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ASLEM 3
1.1.1. Hoạt chất Glycyl funtumin 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt chất Glycyl funtumin 4

3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 25
3.3.1. Độ phù hợp của hệ thống 25
3.3.2. Độ chọn lọc 25
3.3.3. Độ tuyến tính 27
3.3.4. Độ chính xác 29
3.3.5. Độ đúng 32

3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VIÊN
NGẬM DƢỚI LƢỠI ASLEM 1 mg 34
3.4.1. Tính chất 34
3.4.2. Định tính 34
3.4.3. Độ đồng đều khối lƣợng 35
3.4.4. Độ rã. 36
3.4.5. Độ đồng đều hàm lƣợng 36
3.4.6. Định lƣợng 37
BÀN LUẬN 39
KẾT LUẬN 42
ĐỀ XUẤT 43

STT
Số thứ tự
t
R

Thời gian lƣu
tt/tt
Thể tích/thể tích
UV
Tử ngoại (Ultraviolet)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Nội dung
Trang
3.1
Kết quả độ phù hợp hệ thống sắc ký.
25
3.2
Pha dãy chuẩn chạy độ tuyến tính.
27
3.3
Kết qủa khảo sát độ tuyến tính của GF.HCl.
28
3.4

Trang
3.1
Phổ hấp thụ UV của GF.HCl.
24
3.2
Kết quả khảo sát đánh giá độ chọn lọc.
26
3.3
Sắc ký đồ khảo sát độ tuyến tính.
28
3.4
Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích
và nồng độ GF.HCl.
29
3.5
Sắc ký đồ định tính.
34
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tổ chức Y tế Thế giới đã dự báo về mô hình bệnh tật trong thế kỷ 21,
các bệnh không lây nhiễm trong đó có ung thƣ sẽ trở thành nhóm bệnh chủ
yếu đe dọa đến sức khỏe con ngƣời, chiếm 54% nguyên nhân gây tử vong. Ở
Việt Nam, theo nhận định của Bộ Y tế, các bệnh ung thƣ, tim mạch, tâm thần

độ chọn lọc, độ đúng, độ chính xác cao và đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến
hiện nay.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra chất lƣợng và hoàn thiện hồ sơ
đăng ký thuốc cho viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg”
với 2 mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng Glycyl
funtumin hydroclorid trong viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC).
2. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng viên ngậm dưới lưỡi
Aslem (glycyl funtumin hydroclorid 1mg).

3

O
N
C
O
H
C
H
2
NH
2

+ Bị phân hủy ở nhiệt độ 220-230°C.
+ Dễ tan trong nƣớc nóng và methanol, tan trong cloroform, khó tan trong
nƣớc nguội.
+ Năng suất quay cực: dung dịch 0,5% trong MeOH ở 25°C có [α]
D
= 88-
98°.
- Tính chất hóa học:
4

+ GF có tính chất hóa học của một amin, tham gia phản ứng tạo muối với
các acid nhƣ HCl, HBr (dạng dƣợc dụng là GF. HCl); tham gia các phản
ứng alkyl hóa và dễ bị oxy hóa.
+ GF có bản chất là một phân tử amid nên dễ bị thủy phân khi đun nóng.
+ Có tính chất hóa học của một ceton, tham gia phản ứng cộng hợp vào
nhóm carbonyl, phản ứng oxy hóa khử nhóm carbonyl… [12].
1.1.1.3. Tác dụng dược lý
Các nghiên cứu ban đầu cho thấy: thuốc có tác dụng kích thích miễn
dịch dịch thể [11] và qua trung gian tế bào theo cơ chế hoạt hóa chức năng
thực bào của đại thực bào và tăng chuyển dạng lympho bào. Ngoài ra, nó còn
có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng và chống nhiễm khuẩn ở mô hình
in vitro và mô hình thực nghiệm gây viêm phúc mạc bởi trực khuẩn mủ xanh
kháng kháng sinh [12].
1.1.1.4. Chỉ định
Aslem đƣợc chỉ định kết hợp với phẫu thuật, hóa trị liệu và xạ trị để điều
trị bổ trợ ung thƣ đƣờng tiêu hóa (gan, dạ dày, đại trực tràng, tụy), ung thƣ
phổi và ung thƣ vú. Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục đích ngăn
ngừa nhiễm trùng trƣớc và sau phẫu thuật [12].
1.1.1.5. Tác dụng không mong muốn
Ở liều điều trị, chƣa có báo cáo nào về tác dụng phụ nguy hiểm. Một số

sinh và trong nhiễm khuẩn virus khác ở các bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức,
Viện Lao và Bệnh Phổi, bệnh viện Hữu Nghị Việt Xô.
Năm 1982, nhờ tổng hợp thành công Funtumin tại khoa Hóa trƣờng Đại
học Tổng hợp Leiden (Hà Lan), Phó giáo sư Đào Kim Chi và cộng sự đã tổng
hợp thành công GF.HCl từ pregnenolon qua trung gian phtalimid tại Labo
6

Tổng hợp thuốc của trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội do tổ chức NUFFIC tài trợ
[12], [22].
Sau gần 50 năm nghiên cứu và phát triển, năm 2002, chế phẩm thuốc
tiêm miễn dịch Aslem (Glycyl Funtumin Hydroclorid 0,3mg) đã ra đời. Chế
phẩm hiện do công ty cổ phần Dƣợc phẩm Vĩnh Phúc sản xuất (Số đăng ký:
VD-0105-06). Hiện nay, Phó giáo sƣ Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu đang
tiếp tục nghiên cứu để cho ra đời chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem
(Glycyl funtumin hydroclorid 1mg).
Cho đến nay đã có khá nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh tác
dụng của Aslem trong điều trị bổ trợ ung thƣ gan [1], sau phẫu thuật ung thƣ
đại tràng [20], ung thƣ dạ dày [22], ung thƣ đƣờng tiêu hóa [25]. Các nghiên
cứu về ảnh hƣởng của Aslem trên hệ thống enzyme CY-P450 ở gan động vật
thí nghiệm [3], ảnh hƣởng lên chức năng hệ tạo máu, gan thận và huyết áp
[18], nghiên cứu thăm dò tác dụng sinh học [21] đều cho kết quả hết sức khả
quan. Các nghiên cứu về dƣợc động học của Aslem cũng đã đƣợc tiến hành
trên động vật thí nghiệm và ngƣời tình nguyện [13], [16], [19], [23].
1.1.3. Các phƣơng pháp định lƣợng Glycyl funtumin
1.1.3.1. Các phương pháp định lượng trong huyết tương
1.1.3.1.1. Phương pháp LC-MS
Phạm Nhƣ Quỳnh [23] sử dụng LC- MS để khảo sát dƣợc động học của
GF trong huyết tƣơng chó. Phƣơng pháp đã định lƣợng đƣợc GF ở khoảng
nồng độ 0,01 – 0,2 μg/ml.
- Các điều kiện để sử dụng LC-MS cho định lƣợng GF gồm:

trình gradient [16], [17], [19].
- Cột Luna C18, kích thƣớc 75 × 4,6 mm; 2,7μm; Pha động: MeOH
– dung dịch acid formic 0,5% (80:20) (tt/tt); Tốc độ dòng: 0,5
ml/phút [13].

8

1.1.3.2. Các phương pháp định lượng trong nguyên liệu và chế phẩm
Định lƣợng GF.HCl trong chế phẩm không đòi hỏi phƣơng pháp có độ
nhạy cao cỡ ng/ml nhƣ đối với định lƣợng trong huyết tƣơng.
1.1.3.2.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS
Phương pháp tạo màu với ninhydrin
Nguyên tắc: GF.HCl có khả năng tạo phức màu xanh tím không bền với
ninhydrin. Hợp chất màu có tác dụng với cadimi clorua sẽ cho một phức màu
hồng bền, phức này hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 510 nm.
Phương pháp tạo cặp ion với heliantin
Nguyên tắc: GF.HCl là một base hữu cơ có khả năng tạo cặp với acid
hữu cơ mang màu (heliantin). Cặp ion này đƣợc chiết bằng dung môi hữu cơ
cloroform rồi đem đo quang.
Cực đại hấp thụ của cặp ion này ở khoảng 425 – 426 nm.
Phƣơng pháp tạo cặp ion có độ lặp lại cao hơn và đòi hỏi dụng cụ, thuốc
thử, thao tác đơn giản hơn nên phƣơng pháp này đƣợc chọn để đƣa vào tiêu
chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu GF.HCl và dung dịch tiêm Aslem [15].
Phƣơng pháp chiết đo quang thực hiện qua nhiều giai đoạn, đòi hỏi nhiều
thời gian và phải tiếp xúc với dung môi độc hại (cloroform).
1.1.3.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự đã xây dựng và thẩm định
phƣơng pháp HPLC định lƣợng GF.HCl với khoảng nồng độ 0,05-0,25
mg/ml. Phƣơng pháp có độ chính xác cao với khả năng thu hồi > 97% và độ
chụm ≤ 0,12%.

viên đặt dƣới lƣỡi thƣờng đƣợc chế với khối lƣợng nhỏ (<150 mg) và mỏng.
10

Do vậy dƣợc chất phải là loại dùng ở liều thấp (1-15 mg), không kích ứng
niêm mạc và ở dạng bột rất mịn [8].

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Nguyên tắc và phân loại
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid
Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các
chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng
dƣới áp suất cao.
Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân, chất lỏng
đƣợc bao trên bề mặt một chất rắn, hoặc là chất mang rắn đã đƣợc biến đổi
bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Tùy thuộc vào bản chất các pha, cơ chế tách mà ngƣời ta phân làm nhiều
loại sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion,
sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó, sắc
ký lỏng phân bố đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay [5], [9], [10], [14].
1.3.2. Các thông số đặc trƣng
1.3.2.1. Thời gian lưu t
R

Thời gian lƣu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
tan đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại.
Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là
xác định. Vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lƣu phụ thuộc vào các yếu tố:



=







Trong đó: K: hệ số phân bố.
V
S
, V
M
: thể tích pha tĩnh và pha động.
t
R
, t
M
: thời gian lƣu của chất cần phân tích và chất không lƣu
giữ.
Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng 1≤ k’≤8 [5], [9], [14].
1.3.2.4. Hệ số đối xứng F
Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng:
F =



Trong đó:

R

lớn, rửa giải tốn nhiều dung môi. Theo thực tế, trong phân tích hầu hết các
hỗn hợp mẫu, N nằm trong khoảng 3500 – 7500 là vừa đủ.
Nếu gọi L là chiều dài của cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết đƣợc
tính bằng công thức: H =


.
H càng nhỏ, hiệu lực cột càng cao [5], [9], [14].
1.3.2.6. Độ phân giải R
S

Để đánh giá mức độ tách của các chất trong một hệ pha, ngƣời ta dùng
đại lƣợng độ phân giải R
S
.
R
S
=









=

> 1, giá trị tối ƣu R
S
= 1,5 [5], [9], [14].
1.3.3. Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phƣơng pháp định lƣợng hay đƣợc sử dụng trong sắc ký là:
- Phƣơng pháp chuẩn ngoại.
- Phƣơng pháp chuẩn nội.
- Phƣơng pháp thêm chuẩn.
- Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng
pháp chuẩn ngoại. Đây là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu
chuản và thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện
tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu
chuẩn sẽ tính dƣợc nồng độ chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phƣơng pháp
chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm.
 Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của
mẫu thử. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: C
X
= C
S
.





C
X

15

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1.1. Chất chuẩn
Chuẩn GF.HCl (hàm lƣợng: 99,89%, độ ẩm: 0,7%) do Viện kiểm
nghiệm thuốc trung ƣơng cung cấp.
2.1.1.2. Viên Aslem
Viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem chứa GF.HCl (hàm lƣợng ghi nhãn 1mg),
chế phấm do bộ môn Hóa sinh trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội cung cấp. Số lô:
012014, sản xuất ngày: 15/01/2014.
2.1.2. Dung môi, hóa chất
- Methanol (MeOH) tinh khiết HPLC (Merck – Đức).
- Dikali hydrophosphat (PA), dung dịch H
3
PO
4
85% (PA) (Merck –
Đức).

theo hƣớng dẫn DĐVN IV (Phụ lục 1.20) gồm các chỉ tiêu sau:
 Tính chất.
 Định tính.
 Độ đồng đều khối lƣợng.
 Độ rã.
 Độ đồng đều hàm lƣợng.
 Định lƣợng.

Trích đoạn LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Tính chất

---