BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
*****************************

NGÔ GIA BÔN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ
XÁC ðỊNH PHYTOPLASMA GÂY BỆNH TRÊN CÂY MÍA Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật
Mã số : 60.62.01.12 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học
TS. Trịnh Xuân Hoạt
Hà Nội - 2014


Page ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận
được sự giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể.
Trước hết, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn TS.
Trịnh Xuân Hoạt, Viện Bảo vệ thực vật, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi
thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô trong Ban Đào tạo
sau Đại học-Viện KHNN Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành
học tập chương trình cao học cũng như hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với sự quan tâm của thầy
giáo hướng dẫn, sự giúp đỡ nhiệt tình và động viên của lãnh đạo Viện Bảo vệ
thực vật, lãnh đạo và cán bộ Bộ Môn Chẩn đoán giám định dịch hại và thiên địch
Viện Bảo vệ thực vật
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện
thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2014
Tác giả luận văn
Ngô Gia BônHọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

2.1.1. Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu 25

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

2.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 25
2.2. Nội dung nghiên cứu 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 26
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xác ñịnh bệnh phytoplasma hại trên mía 27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35
3.1. Kết quả ñiều tra sự phân bố và gây hại của nhóm bệnh do phytoplasma gây hại
trên cây mía 35
3.1.1. Kết quả ñiều tra thu thập mẫu bệnh tại Nghệ An 35
3.1.2 Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây hại trên mía 39
3.2. Kết quả nghiên cứu xác ñịnh bệnh do phytoplasma gây hại trên mía 42
3.2.1. Kết quả xác ñịnh phytoplasma trong mô mía bằng kính hiển vi ñiện tử 42
3.2.2. Xác ñịnh phytoplasma trong mô cây mía biểu hiện triệu chứng bệnh chồi cỏ
bằng phương pháp PCR 44
3.2.3. Phân tích trình tự gen secA 70
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO 74
PHỤ LỤC 84
Page vi

DANH MỤC BẢNG
TT bảng Tên bảng Trang
1.1 Tình hình sản xuất mía trên thế giới………………………

5
1.2 Phân nhóm Phytoplasma dựa trên phân tích RFLP của gene
16SrRNA…………………………………………………

11
2.1 Các cặp primer được sử dụng trong nghiên cứu…………… 33
3.1 Tình hình phát sinh bệnh chồi cỏ mía tại Nghệ An………… 37
3.2 Tỷ lệ bệnh chồi cỏ tại Huyện Tân Kỳ, Nghệ An năm 2012…

39
3.3 Kết quả chạy PCR các cặp primer 55
3.4 Mức sai khác trình tự nucleotide của SCGSNA so với các
đại diện của các nhóm Phytoplasma khác nhau…………….
58

3.5 Phytoplasma sử dụng trong phân tích phả hệ………………. 61
3.6 Phytoplasma sử dụng trong phân tích phả hệ………………. 67 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii

DANH MỤC HÌNH
TT hình Tên hình Trang

C …………. 47
3.12 Kết quả sản phẩm PCR ở điều kiện nhiệt độ 60
0
C …………. 47
3.13 Nested PCR sử dụng cặp primer P1/P7 và R16mF2/R16mR1
để phát hiện Phytoplasma trong mô cây mía ………………
48

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

3.14 Nested PCR sử dụng cặp mồi P1/P7 – R16F2/R16R2 để phát
hiện Phytoplasma trong mô cây mía …………………………

49
3.15 Nested PCR sử dụng cặp mồi P1/P7-R16F0/R16R0 để phát
hiện Phytoplasma trong mô cây mía …………………………

50
3.16 Nested PCR sử dụng cặp mồi P1/P7-R16F2N/R16R2 để phát
hiện Phytoplasma trong mô cây mía …………………………

50
3.17 Nested PCR sử dụng cặp mồi P1/P7-R16(I)F2/R16(I)R1 để
phát hiện Phytopalsma trong mô cây mía ……………………

51
3.18 Nested PCR sử dụng cặp mồi P1/P7-R16(III)F2/R16(III)R1
để phát hiện Phytoplasma trong mô cây mía ………………
52

khuếch đại từ mẫu mía biểu hiện triệu chứng trắng lá ………
64
3.27 Sản phẩm nested-PCR đã được cắt bằng các enzyme giới hạn 65
3.28 Trình tự gen 16SrRNA của Phytoplasma gây bệnh trắng lá
mía tại Bình Dương…………………………………………
66
3.29 Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-
joining ……………………………………………………….
69
3.30 Cây phả hệ thể hiện mối tương quan giữa các Phytoplasma
gây bệnh trên mía và cỏ dựa trên trình tự gen SecA ………
71
3.31 Cây phả hệ thể hiện mối tương quan giữa các Phytoplasma
gây bệnh trên mía và cỏ dựa trên trình tự gen 16SrRNA ……
72 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1

MỞ ðẦU
1. Tính cấp thiết của ñề tài
Mía (Saccharum officinarum L.) là cây công nghiệp quan trọng nhất cho
ngành sản xuất mía đường tại Việt Nam. Tuy nhiên những năm gần đây xuất
hiện một số loại bệnh nguy hiểm do Phytoplasma gây ra. Phytoplasma thuộc họ
Acholeplasmataceae, loài Candidatus Phytoplasma (Ca. Phytoplasma) đã trở
thành một trong những đối tượng gây hại nghiêm trọng nhất đối với cây trồng
nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam trong những năm gần đây.
Trên cây mía có hai bệnh nguy hiểm do Phytoplasma gây ra đó là bệnh
chồi cỏ mía và bệnh trắng lá mía (Sdoodee et al., 1999). Năm 2009 bệnh chồi cỏ

mía, mô tả được triệu chứng bệnh do các Phytoplasma gây ra trên mía.
- Phát hiện và chụp được ảnh hình thái của Phytoplasma gây hại trên mía bằng
kính hiển vi điện tử.
- Xây dựng được kỹ thuật sinh học phân tử có hiệu quả nhất trong chẩn đoán,
xác định Phytoplasma gây hại trên cây mía.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
- Cung cấp dẫn liệu khoa học về bệnh Phytoplasma gây hại trên cây mía.
- Xác định được phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác Phytoplasma gây
hại trên cây mía cũng như xác định được sự đa dạng di truyền của các
Phytoplasma gây bệnh trên mía.
4. ðối tượng, phạm vi và ñịa ñiểm nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Phytoplasma gây bệnh trên mía. Một số giống mía trồng
trong sản xuất.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu và phát triển kỹ thuật phân tử chẩn đoán,
giám định Phytoplasma gây ra trên mía ở Nghệ An, Bình Dương.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện Bảo vệ thực vật, tỉnh Nghệ An và tỉnh Bình Dương.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Cơ sở khoa học của ñề tài
Phytoplasma là tác nhân gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác

Trong đó tăng nhiều nhất là vùng Nam Mỹ, tiếp đến là Châu Á, trong khi đó sản
lượng mía ở Châu Âu năm 2012 lại có xu hướng giảm xuống so với năm 1961.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất mía trên thế giới
Năm

Diện tích
(ha)
Năng suất
(tấn/ha)
Sản lượng mía
(tấn)
2008

24.085.416

72,0

1. 734.998.524

2009

23.693.573

71,5

1.693.545.000

2010

23.784.059


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6

trung là 285.100 ha, tăng hơn vụ trước 14.139 ha và được phân chia khá đồng
đều giữa 3 miền. Về chất lượng, do chăm sóc tốt, chất lượng mía vụ 2012-2013
tốt hơn vụ trước, trữ lượng đường bình quân của mía đưa vào nhà máy chế biến
khoảng 9,8 CCS, cao hơn vụ trước 0,2 CCS.
1.2.3. Nguồn gốc và lịch sử phát triển của cây mía
Mía có nguồn gốc ở vùng quần đảo Ghinê, nam Thái Bình Dương. Cây
mía có thể đã xuất hiện từ hàng vạn năm về trước, khi mà lục địa Á - Úc còn
dính liền nhau. Người ta đã tìm thấy những loài cây dại thuộc chi Saccharum
phân bố rộng khắp ở Ấn Độ, Trung Quốc, các quần đảo ở nam Thái Bình Dương
(Philippin, Indonesia, Australia). Ở Trung Quốc và Ấn Độ, nghề trồng mía làm
đường đã có cách đây hơn 2.000 năm. Từ hai nước này, nghề trồng mía được
phổ biến rộng khắp vùng Đông Nam Á trong đó có Việt Nam
(
1.2.4. Vị trí phân loại
Cây mía thuộc giới thực vật, bộ Poales, họ Poaceae, chi Saccharum L.
(
1.2.5. ðặc ñiểm sinh trưởng
1.2.5.1. Nhiệt ñộ
Nhiệt độ bình quân thích hợp cho sự sinh trưởng của cây mía là 15-26
0
C.
Giống mía nhiệt đới sinh trưởng chậm khi nhiệt độ dưới 21
0
C và ngừng sinh
trưởng khi nhiệt độ 13
0

nhiệt đới và á nhiệt đới mía vươn cao mạnh nhất khi bắt đầu vào mùa hè có độ
dài ngày tăng lên.
1.2.5.3. ðộ ẩm
Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại không chịu được úng nước. Mía có
thể phát triển tốt ở những vùng có lượng mưa từ 1500mm/năm.Giai đoạn sinh
trưởng mía yêu cầu lượng mưa từ 100-170mm/tháng. Khi chín cần khô ráo, mía
thu hoạch sau một thời gian khô ráo khoảng 2 tháng sẽ cho tỉ lệ đường cao.
1.2.5.4. ðộ cao
Độ cao có liên quan đến cường độ chiếu sáng cũng như mức chênh lệch
nhiệt độ giữa ngày và đêm, do đó ảnh hưởng đến khả năng tích tụ đường trong
mía, các khâu trong qui trình chế biến. Giới hạn về độ cao ảnh hưởng đến hoạt
động sinh trưởng và phát triển của cây mía, điều kiện tốt nhất vùng xích đạo là
1600m, ở vùng nhiệt đới là 700-800 m.
1.2.5.5. ðất trồng
Mía là loại cây công nghiệp khoẻ, dễ tính, không kén đất, có thể trồng mía
trên nhiều loại đất khác nhau, từ đất có tỷ lệ sét tới 70% cho tới các loại đất có
đất chứa 70% cát. Đất thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển của mía là
những loại đất xốp, tầng canh tác sâu, có độ phì cao, giữ ẩm tốt và dễ thoát nước.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

Mía có thể phát triển ở đất có độ pH trong khoảng 4-9, nhưng độ pH thích hợp là
5,5-7,5. Độ dốc địa hình không vượt quá 15 độ, đất không ngập úng thường
xuyên. Những vùng đất đai bằng phẳng cơ giới vận tải tương đối thuận lợi đều
có thể bố trí trồng mía. Ngoài ra người ta có thể canh tác mía ở cả những vùng
gò đồi có độ dốc không lớn lắm ở vùng trung du miền núi.
1.2.6. Giá trị kinh tế
Mía là cây nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp chế biến
đường. Đường là một loại thực phẩm cần có trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của

của nhiều bệnh biến vàng trên cây trồng. Đến năm 1994, tên gọi Phytoplasma đã
được công nhận tại hội nghị lần thứ 10 của tổ chức quốc tế về ngành
Mycoplasma học thay cho tên gọi “mycoplasma like organism” hay MLOs (Lee
et al., 2000).
1.3.2. Hình thái Phytoplasma
Phytoplasma là một dạng vi khuẩn thiếu vách tế bào nên không có hình
dạng cố định, tế bào của chúng được bao bọc bởi một lớp màng nhầy có tính đàn
hồi dày từ 75-100 A
0
(Angstron). Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử chúng
có dạng hình cầu, hình ovan, có thể có dạng hình sợi ngắn, dạng hình tròn với
đường kính trung bình từ 200-800 µm (Doi et al., 1967; Kirkpatrick, 1987). Bên
trong lớp màng nhầy có tế bào chất, ribosome và nhân ở dạng trần. Kích thước
bộ gen của Phytoplasma thay đổi từ 530 kilobases tới 1130 kilobases (Lee et al.,
2000). Phytoplasma là nhóm ký sinh bắt buộc trong mô libe thực vật, và trong
một số loài côn trùng thuộc nhóm chích hút (Doi et al., 1967), nó không thể nuôi
cấy trên môi trường nhân tạo.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

1.3.3. Tầm quan trọng của bệnh do Phytoplasma trên thực vật
Phytoplasma gây bệnh cho hàng trăm loại cây trồng khác nhau ở vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới với các triệu chứng biến vàng, lùn cây, hoá xanh vỏ quả,
chổi rồng vv (Bertaccini, 2007). Loài Ca. Phytopalsma oryzae gây bệnh vàng
lùn lúa; hai loài Ca. Phytoplasma asteris và Ca. Phytoplasma japonicum gây
bệnh vàng cây cúc tây; Ca. Phytoplasma aurantifolia gây bệnh chổi rồng trên lạc;
ba loài Ca. Phytoplasma palmae, Ca. Phytoplasma castaneae và Ca.
Phytoplasma cocosnigeriae gây bệnh chết vàng cây dừa cạn; Ca. Phytoplasma
brasiliense gây bệnh chổi rồng hoa dâm bụt.

(AYWB)
NC_007716 Bai et al., 2006
I-A Tomato big bud (BB) L33760 Lee et al. 1992
I-B Onion yellows mild strain (OY-M) NC_005303 Oshima et al., 2004
I-B ‘Ca. P. asteris’, aster yellows (MAY) M30790 Lee et al., 2004a
I-C Clover phyllody (CPh) AF222065 Lee et al., 2004a
I-D Paulownia witches’ broom (PaWB) AY265206 Lee et al., 2004a
I-E Blueberry stunt (BBS3) AY265213 Lee et al., 2004a
I-F Aster yellows apricot – Spain
(A-AY)
X68338
AY265211
Kison, 1992*
Lee et al., 2004a
I-I Strawberry witches’ broom
(STRAWB1)
U96614 Jomantiene et al.,
1998
I-K Strawberry witches’ broom
(STRAWB2)
U96616 Jomantiene et al.,
1998
I-L Aster yellows (AV2192) AY180957 Lee et al., 2003
I-M Aster yellows (AVUT) AY265209 Lee et al., 2004a
I-N Aster yellows (IoWB) AY265205 Lee et al., 2004a
I-O Soybean purple stem (SPS) AF268405 Lee et al., 2002
I-P Aster yellows from Populus (PopAY) AF503568 Šeruga et al., 2003
I-Q Cherry little leaf (ChLL) - Valiunas et al., 2006

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Davis, 1999
III-I Virginia grapevine yellows (VGYIII) AF060875 Davis et al., 1998
III-J Chayote witches’ broom AF147706 Montano et al., 2000

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

III-K Strawberry leafy fruit (SLF) AF1477067 Jomantiene & Davis,
2000
III-L Cassava frog skin disease (CFSD) EU346761 Alvarez et al., 2009
III-P Dandelion virescence (DanV) AF370119 Jomantiene & Davis,
2001
III-Q Black raspberry witches’ broom AF302841 Davis et al., 2001
III-T Sweet and sour cherry (ChD) FJ231728 Valiunas et al., 2009
III-U Cirsium white leaf AF373105 Jomantiene et al.,
2002b
16SrIV: Coconut lethal yellows
IV-A Coconut lethal yellowing (LYJ-C8) AF498307 Harrison et al., 2002
IV-B Yucatan coconut lethal decline
(LDY)
U18753 Harrison et al., 1994
IV-C Tanzanian coconut lethal decline
(LDT)
X80117 Harrison et al., 1994
16SrV: Elm yellows
V-A ‘Ca. P. ulmi’, elm yellows (EY) AY197655 Lee et al., 2004b
V-B ‘Ca. P. ziziphi’, jujube witches’
broom, (JWB-G1)
AB052876 Jung et al., 2003a
V-C Alder yellows (ALY882) AY197642 Lee et al., 2004b

AJ542544 Seemüller &
Schneider, 2004
X-C ‘Ca. P. pyri’, pear decline (PD) AJ542543 Seemüller &
Schneider, 2004
X-D ‘Ca. P. spartii’, spartium witches’
broom (SpaWB)
X92869 Marcone et al., 2004a
X-E Black alder witches’ broom (BAWB)

X76431 Seemüller et al., 1994
16SrXI: Rice yellow dwarf
XI-A ‘Ca. P. oryzae’, rice yellow dwarf
(RYD)
AB052873 Jung et al., 2003b

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 15

XI-B Sugarcane white leaf (SCWL) X76432 Lee et al., 1997
XI-C Leafhopper-borne (BVK) X76429 Seemüller et al., 1994
16SrXII: Stolbur
XII-A Stolbur (STOL) X76427 Seemüller et al., 1994
XII-B ‘Ca. P. australiense’, Australian
grapevine yellows (AUSGY)
L76865

Davis et al., 1997

16SrXIII: Mexican periwinkle virescence
XIII-A Mexican periwinkle virescence