TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

NGUYỄN THỊ NGUYỆT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH THÚ Y
Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện
Th.S BÙI THỊ LÊ MINH NGUYỄN THỊ NGUYỆT
MSSV: 3103042
Lớp: CN10Y4A1 – K36

KHẢO SÁT TỶ LỆ ESCHERICHIA COLI SINH
MEN BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG
VÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CTX-M TỪ
GÀ KHỎE TẠI TỈNH TRÀ VINH

Cần Thơ, 2014

i
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
Đề tài “Khảo sát tỷ lệ dƣơng tính E. coli sinh men beta-lactamase phổ rộng và
xác định kiểu gen CTX-M từ gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh” do sinh viên Nguyễn
Thị Nguyệt thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông
Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 8/2014 đến
tháng 12/2014. Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Cán bộ hƣớng dẫn

Nguyễn Thị Nguyệt

iii
TÓM LƢỢC

Qua việc lấy mẫu phân ở lỗ huyệt gà khỏe bằng kỹ thuật vô trùng tại năm địa điểm
của tỉnh Trà Vinh bao gồm huyện Cầu Kè, Tiểu Cần, Cầu Ngang, Càng Long và
TP. Trà Vinh, tổng số là 120 mẫu, đồng thời tiến hành khảo sát tỷ lệ dương tính E.
coli sinh men ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp và xác định kiểu gen CTX-M
bằng kỹ thuật PCR, từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2014. Kết quả ghi nhận được gà
thịt 1 tuần tuổi ở huyện Cầu Kè và Tiểu Cần có tỷ lệ dương tính E. coli ESBL là
83,33% cao hơn so với huyện Cầu Ngang là 16,67%. Tương tự như trên tiến hành
trên gà thịt 1 tháng tuổi, tỷ lệ dương tính E. coli ESBL ở các huyện Cầu Kè, Tiểu
Cần, Cầu Ngang, Càng Long và TP. Trà Vinh lần lượt là 33,33%, 16,67%, 66,67%,
50% và 50%, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Đối với gà đẻ
thì tỷ lệ gà dương tính E. coli ESBL ở huyện Tiểu Cần và TP. Trà Vinh cùng là
91,67% chiếm tỷ lệ cao hơn so với huyện Cầu Ngang với tỷ lệ là 50%. Khi so sánh
tỷ lệ dương tính E. coli ESBL giữa các loại gà thì gà đẻ chiếm tỷ lệ cao nhất là
73,33%, thấp nhất là gà thịt chiếm tỷ lệ là 50%. Đồng thời tiến hành xác định kiểu
gen CTX-M trên 30 chủng E. coli ESBL phân lập từ các loại gà, kết quả có 24/30
(80%) chủng E. coli mang gen CTX-M mã hóa ESBL.
2.2.2 Một số phương pháp phát hiện ESBL 8
2.3 Tình hình nghiên cứu E. Coli sinh men ESBL trên gà 9
2.4 Giới thiệu phương pháp PCR 11
2.4.1 Nguyên tắc chung 11
2.4.2 Thành phần phản ứng PCR 12
2.4.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR 12
2.4.4 Kiểm tra kết quả PCR 14
2.4.5 Ứng dụng của phương pháp PCR 15
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1 Phương tiện nghiên cứu 16
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 16

v
3.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 16
3.2 Phương pháp nghiên cứu 16
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 16
3.2.2 Phương pháp phân lập E. Coli sinh men ESBL 17
3.2.3 Phương pháp xác định gen CTX-M mã hóa ESBL 19
3.3 Phương pháp xử lý số liệu 20
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1
tuần tuổi 21
4.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1
tháng tuổi 22
4.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà đẻ 23
4.4 So sánh tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL giữa các loại gà 25
4.5 Kết quả xác định gen CTX-M mã hóa men beta-lactamase phổ rộng 26
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28
5.1 Kết luận 28
5.2 Đề nghị 28

Da Dalton
TBE Tris-borate-EDTA
TAE Tris-acetate-EDTA
PCR Polymerase chain reaction
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
TP Thành phố vii
DANH MỤC BẢNG

Bảng
Tựa bảng
Trang
2.1

2.2 Phản ứng PCR – bước biến tính 12
2.3 Phản ứng PCR – bước bắt cặp của các mồi vào sợi khuôn 13
2.4 Phản ứng PCR – bước kéo dài chuỗi 13
2.5 Phản ứng PCR – sản phẩm DNA sau một chu kỳ 13
2.6 Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR 13
3.1 Quy trình phân lập E.coli sinh men ESBL 18
4.1 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà đẻ tại
các huyện 24
4.2 Kết quả PCR của gen CTX-M trên gà thịt 1 tháng tuổi 27
1
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đối với Việt Nam, chăn nuôi gia cầm là một trong các ngành chăn nuôi quan trọng
góp phần vào sự tăng mạnh cơ cấu GDP. Theo kết quả điều tra sơ bộ tại thời điểm
1/4/2014 của Tổng cục Thống kê, tổng số gia cầm của cả nước là 314,4 triệu con và
có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất trong 15 năm qua. Việc phát triển đàn gà một cách

- Xác định kiểu gen CTX-M mã hóa men ESBL trên gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh.

2
CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Escherichia coli
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn Escherichia coli thuộc
lớp: Schyzomycetes, bộ: Eubacteriales, họ: Enterobacteriaceae, tộc: Escherichiae,
giống: Escherichia, loài: Escherichia coli.
Escherichia coli được gọi tắt là E.coli còn có tên là Bacterium coli commue được
ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em.
E.coli là trực khuẩn ruột già, vi khuẩn này có mặt trong ruột hầu hết động vật, ở
phần cuối ruột non hay ruột già, ít khi có ở dạ dày hay phần trước ruột non của các
loài động vật như: chó, mèo, heo, bò, ngựa, gia cầm và người.
Vi khuẩn thường theo phân ra ngoài nên ta thường thấy vi khuẩn trong đất, nước,
không khí. Trong tự nhiên vi khuẩn sống được vài tuần đến vài tháng. Động vật non
cảm nhiễm đặc biệt với E.coli.
2.1.1 Đặc điểm hình thái
E.coli là trực khuẩn ngắn, Gram âm, bắt màu hồng, có hình dạng đồng nhất, không
có khả năng hình thành nha bào, kích thước 2-3 x 0,6 µm, hai đầu tròn, đứng riêng
lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn di động, có giáp mô thỉnh thoảng thấy bắt màu
lưỡng cực ở hai đầu (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012).

trường, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt, đôi khi có màu xám, mùi trứng thúi.
Trên môi trường chuyên biệt Mac Conkey: vi khuẩn tạo khóm đỏ hồng nhờ vào sự
lên men đường lactose.
Trên môi trường Eosin methylen blue: tạo khuẩn lạc màu tím ánh kim.
Trên môi trường Kligler iron agar: lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng),
sinh hơi, không sinh khí H
2
S.
Môi trường Brilliant green agar tạo khóm xanh lá mạ.
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
E. coli lên men sinh hơi các loại đường glucose, maltose, galactose, levulose,
lactose, fruitose. Tất cả các E. coli đều lên men đường lactose nhanh và sinh hơi,
đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E. coli và Salmonella (Nguyễn Như Thanh,
1997).
E. coli không sinh H
2
S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên
Nitrate thành Nitrite.
Để phân biệt E. Coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử
nghiệm IMViC. Khi đó nếu là E. Coli thì sẽ cho kết quả là: Indol +, methylred +,
voges proskauer –, citrate – (FAO, 1992).
Trong đó, người ta sử dụng các loại môi trường như Trytone broth, MR-VP broth
và simmon‟s citrate agar để kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli này
(http://microbeonline.com/imvic-tests-principle-procedure-and-results/)

4
Môi trường Tryptone dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Sau khi nhỏ
thuốc thử Kovacs‟ vào môi trường này, nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng
đỏ thì phản ứng dương tính, ngược lại nếu vòng đỏ không xuất hiện thì phản ứng
âm tính.

Tính chất gây bệnh
Sở dĩ vi khuẩn E. coli từ vai trò cộng sinh thường trực trong đường ruột trở thành vi
khuẩn gây bệnh là vì trong quá trình sống cá thể, vi khuẩn tiếp nhận được các yếu tố
gây bệnh, đó là yếu tố gây dung huyết, yếu tố cạnh tranh, yếu tố bám dính, yếu tố
độc tố đường ruột, yếu tố kháng kháng sinh. Các yếu tố gây bệnh này không được
di truyền qua DNA của chromosome, mà di truyền bằng plasmid, qua hiện tượng
trao đổi di truyền tiếp hợp. Chính những yếu tố gây bệnh này, đã giúp cho vi khuẩn
bám dính vào được tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột, từ đây vi

5
khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh của mình, là sản sinh độc tố gây ra các triệu
chứng, phá hủy tế bào niêm mạc ruột, gây dung huyết, nhiễm độc huyết (Đậu Ngọc
Hào, 2011).
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), dựa vào vị trí gây bệnh các
E. coli có khả năng gây bệnh ở gia cầm được chia thành hai nhóm chính: thứ nhất là
nhóm gây bệnh đường ruột hay E. coli gây tiêu chảy, thứ hai là nhóm gây bệnh
ngoài đường ruột.
Các loại E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) bao gồm:
E. coli độc tố ruột: Enterotoxigenic E. coli (ETEC).
E. coli gây bệnh tích ở ruột: Enteropathogenic E. coli (EPEC).
E. coli xâm lấn ruột: Enteroinvasive E. coli (EIEC).
E. coli ngưng tập ruột: Enteroaggregative E. coli (EAEC).
E. coli bám dính phân tán: Diffusely adherent E. coli (DAEC).
E. coli gây xuất huyết ruột: Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC).
Hai loại E. coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
E. coli gây viêm màng não: Meningitidis-associated E. coli (MAEC).
E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu: Uropathogenic E. coli (UPEC).
Và một số nhóm khác như: Vasotoxin E. coli hay verotoxin (VTEC), APEC.
Enterotoxigenic E. coli (ETEC): đây là độc tố được nói đến nhiều nhất và nó được
xem là nguyên nhân gây tiêu chảy thông thường trên thú non (độc tố đường ruột),

2
, formol trong 5 phút, có khả năng chịu đựng được các yếu tố lý hóa cao hơn
các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên,
2006).
Nơi cư trú chính của E. coli thường ở phần sau của ruột, chúng theo phân của người
hay gia súc, gia cầm đào thải ra ngoài. E. coli xuất hiện và sinh sống rất sớm ở
đường ruột người và động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại đến khi con vật
chết.
Theo Nguyễn Như Thanh (2001) các chủng E. coli không gây bệnh mà chỉ khi các
điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém và trên cơ sở mắc kế phát sau
các bệnh ký sinh trùng, bệnh virus, bệnh CRD dẫn đến sức chống đỡ của con vật
suy giảm thì vi khuẩn E. coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh.
Theo Lê Văn Năm (2010) thời gian nung bệnh có thể từ vài ngày tới vài tuần tùy
thuộc vào độc lực và số vi khuẩn gây nhiễm, sức đề kháng, điều kiện chuồng trại,
thức ăn, nước uống. Trường hợp gà bị CRD kết hợp với E. coli thì sẽ gây viêm túi
khí nặng, fibrin hoặc fibrin mủ, viêm màng bao tim và màng quanh gan, trên gà đẻ
thì có casein bao phủ lên buồng trứng ( Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010).
2.2 E. coli sinh men beta-lactamase phổ rộng
E. coli là vi khuẩn phổ biến nhất trong hệ vi khuẩn Enterobacteria và nó cũng là vi
khuẩn sinh men ESBL nhiều nhất ở người cũng như động vật. Bên cạnh đó, có
nhiều báo cáo về E. coli ESBL được phân lập từ người và những thức ăn có nguồn
gốc từ động vật đã được công bố ở khắp nơi trên thế giới (Mesa et al., 2006).
2.2.1 Men beta-lactamase phổ rộng

7
Men beta-lactamase phổ rộng (ESBL) được tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại Đức,
thường gặp trong các chủng đường ruột đặc biệt là Klebsiella spp, E. coli…khi các
chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các
kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin. Việc sử dụng kháng sinh trong chăn
nuôi đã tác động vào tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Tại Bắc Mỹ và


8
 TEM (A): là các đột biến TEM penicilinase, có nguồn gốc không rõ, chúng có
trên 100 biến thể.
 SHV (A): các đột biến penicilinase, ở Klebsiella pneumoniae thì xuất phát từ
nhiễm sắc thể, chúng có trên 50 biến thể.
 CTX-M: có 40 biến thể trong 5 phân lớp, các phân lớp đều xuất phát từ nhiễm
sắc thể rồi chuyển động nhờ các trình tự chèn.
 VEB, PER, OXA-15 là những lớp ít gặp hơn và có rất ít biến thể < 3 biến thể.
Trong đó, CTX-M là loại gen phổ biến nhất, là nhóm mới của ESBL, được tìm thấy
lần đầu tiên tại Nam Mỹ, Đức và Pháp, nó có cơ chế kháng lại cefotaxime, trong khi
TEM và SHV lại kháng với ceftazidime hơn là cefotaxime (Spyros et al., 2004;
Rossolini et al., 2008).
Các gen mã hóa ESBL được nằm trên plasmid, chúng có thể dễ dàng truyền giữa
các chủng với nhau, mang thêm sự đề kháng đối với những kháng sinh khác như là
fluoroquinolone, aminoglucoside và sulfonamide, góp phần vào kiểu hình đa kháng
ở vi khuẩn (Lucianne et al., 2013).
2.2.2 Một số phƣơng pháp phát hiện ESBL
Theo Nguyễn Sâm (2009) đánh giá về một số phương pháp phát hiện beta-
lactamase phổ rộng, bao gồm một số phương pháp sau đây:
ChromID ESBL agar
Môi trường ChromID ESBL do hãng Bio-Merieux (Pháp) sản xuất, đã được nhiều
nước trên thế giới sử dụng. Đây là môi trường được khuyến cáo thông dụng để sàng
lọc các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sinh ESBL. Việc xác định vi khuẩn
sinh ESBL đặc biệt quan trọng trong việc phòng và giám sát dịch tễ bệnh nhiễm
khuẩn. Sử dụng môi trường ChromID ESBL giúp nhanh chống sàng lọc các vi
khuẩn sinh ESBL.
Nguyên lý: Môi trường chứa kháng sinh Cefpodoxime. Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ
kháng với Cefpodoxime và có khả năng phát triển trên môi trường ChromID ESBL
tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, đặc trưng cho một số loài vi khuẩn.

biến nhất, cụ thể là:
Một nghiên cứu của Daniela et al. (2009) về việc xác định tỷ lệ E. coli sinh men
ESBL trên mẫu phân gà thịt khỏe tại Bồ Đào Nha, kết quả thu được có 42,1%
(32/76mẫu) dương tính với E. coli sinh men ESBL.
Theo Dhanji, Murphy et al. (2010) đã phân lập E. coli sinh men ESBL trên thịt gà
sống nhập khẩu từ Nam Mỹ vào nước Anh. Kết quả có 62/210 mẫu dương tính với
E. coli sinh men ESBL, trong đó thu được 141 chủng E. coli. Trong số các chủng
này có 30% sản sinh nhóm 2 CTX-M ESBLs, 27% sản sinh nhóm 8 CTX-M
ESBLs, 42% sản sinh CMY-type AmpC enzymes và 1% sản xuất một nhóm 2
CTX-M cùng với một enzyme CMY; không có E. coli nào sản xuất CTX-M-15
ESBL và dòng vô tính ST131.

10
Overdevest et al. (2011) đã xác định tỷ lệ và những đặc tính các gen beta lactamase
phổ rộng của vi khuẩn E. coli ở người và thịt gà bán lẻ tại Netherlands. Kết quả cho
thấy những gen ESBL phổ rộng được tìm thấy ở thịt gà chiếm một tỷ lệ cao là
79.8% (71/89 mẫu). Phân tích di truyền cho thấy rằng những gen ESBL trên thịt gà
và người là giống nhau. Những phát hiện này đưa ra rằng sự có mặt phong phú của
các gen ESBL ở chuỗi thức ăn có thể có một ảnh hưởng sâu rộng vào sự chọn lọc
cho việc điều trị nhiễm khuẩn trong tương lai được gây ra bởi vi khuẩn gam âm nói
chung và vi khuẩn E. coli nói riêng.
Để cung cấp dữ liệu về sự nguy hiểm đến sức khỏe cộng đồng của vi khuẩn
Salmonella và E. coli ở trong thực phẩm, Maria et al. (2013) đã nghiên cứu thấy sự
xuất hiện và đặc tính của E. coli và Salmonella sinh men ESBL/pAmpC trong 430
mẫu thịt bò, thịt heo và thịt gà được nhập khẩu vào Thụy Điển. Trong đó kết quả về
tỷ lệ xuất hiện của E. coli sinh men ESBL trên thịt gà tại Nam Mỹ, Châu Âu và Đan
Mạch lần lượt là 95% (41/43 mẫu), 61% (27/44 mẫu) và 15% (7/46 mẫu); gen
CTX-M-2 và CTX-M-8 là các gen trội ở E. coli có trong thịt gà Nam Mỹ, trong khi
gen CMY-2 và CTX-M-1 chiếm ưu thế hơn ở Châu Âu. Qua kết quả nghiên cứu
cho thấy thịt nhập khẩu vào Thụy Điển, đặc biệt là thịt gà là một nguồn thực phẩm

Brazil thì phát hiện các gen CTX-M-2 và CTX-M-8. Qua đó cho thấy gen CTX-M
rất phổ biến và chúng đã lan tỏa ra nhiều nơi trên thế giới.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về E.coli sinh ESBL cũng đã thực hiện, tuy nhiên
cũng chưa thật nhiều nghiên cứu về vấn đề này trên gà, chủ yếu tiến hành trên
người như nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Minh (2008) tìm thấy tì lệ vi khuẩn sinh
ESBL gây nhiễm khuẩn hô hấp ở bệnh nhân thở máy là 20,63% trong đó E.coli
chiếm 5,48% và chúng kháng 100% với kháng sinh nhóm Cephalosporin; theo
nghiên cứu của Phạm Ngọc Kiếu et al. (2012) đã phân lập được 148 chủng vi khuẩn
từ các mẫu bệnh phẩm (mủ, nước tiểu, máu, phân, đàm, dịch khác) thì tỷ lệ vi khuẩn
Gram âm sinh ESBL là 33,1%, trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là E.coli và
Enterobacter. Như vậy, việc tiến hành nghiên cứu trên gà về chủng E.coli sinh men
ESBL là việc cần thiết nên làm trong tương lai để cho thấy tỷ lệ E.coli sinh ESBL ở
Việt Nam so với các quốc gia trên thế giới cũng như những ảnh hưởng của chúng
đối với sức khỏe con người.
2.4 Giới thiệu phƣơng pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) được phát minh bởi K.Mullis và cộng sự vào năm 1985. Đây là kỹ
thuật invitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời
gian ngắn. Đoạn DNA được khuếch đại được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu
thường có chiều dài khoảng 18 – 30 nucleotide (Chu Hoàng Mậu, 2005).
2.4.1 Nguyên tắc chung
PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu invitro do sự xúc tác
của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình
nhiệt lặp lại (có thể từ 30 – 40 lần) gồm đun nóng (95
0
C), làm nguội (60 – 65
0
C), và
ủ dài ở 72
0

Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp:
Sau khi hai sợi DNA tách ra, nhiệt độ sẽ được hạ đến 45
0
C – 65
0
C là nhiệt độ thích
hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của đoạn DNA đích.

Hình 2.2. Phản ứng PCR – bước biến tính (theo Chu Hoàng Mậu, 2005)
„

„
\
„
„
„
5’
3’
3’
5’

13
Hình 2.5. Phản ứng PCR – sản
phẩm DNA sau một chu kỳ (theo
Chu Hoàng Mậu, 2005)
Hình 2.6. Sản phẩm cuối cùng của
phản ứng PCR (theo Chu Hoàng
Mậu, 2005) 14
2.4.4 Kiểm tra kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc chung
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của
điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA,
protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng.
Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển về
cực dương hoặc cực âm tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích thực hoặc
âm hoặc dương, còn acid nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy chúng có thể
dịch chuyển qua bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác dụng của điện trường.
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn
đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc
polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch
đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân tử và
các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử protein và các
phân tử DNA có chiều dài <1kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử
DNA hoặc RNA có kích thước từ 20bp-20kb.
Nguyên lý của việc điện di DNA: là khi ở trong điện trường do tích điện âm nên các
phân tử DNA dịch chuyển về phía anode và với tốc độ dịch chuyển của chúng khác

vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phòng xạ tự ghi. Tùy thuộc kích
thước DNA mà người ta chọn loại gel, nồng độ gel, loại đệm (TBE hay TAE) (Lò
Thanh Sơn, 2009).
Bảng 2.1: Các thông số điện di DNA bằng agarose gel (Phạm Hồng Sơn, 2006).
2.5.6 Ứng dụng của phƣơng pháp PCR
Phương pháp PCR có giá trị ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực như: khảo cổ
học, sinh học, pháp y, y học, nông nghiệp,… Trong chăn nuôi phương pháp PCR
dùng phát hiện các gen có ưu thế về giống tốt, về năng suất sinh sản hoặc xác định
giới tính khi truyền cấy phôi… Riêng trong lĩnh vực thú y, PCR được ứng dụng rất
nhiều trong chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, virus,… và kỹ thuật
PCR còn phục vụ lĩnh vực nghiên cứu điều chế vaccine.
Hàm lượng agarose (%) trong gel
Kích thước DNA mạch thẳng (kb) sử
dụng có hiệu quả
0,3
60-5
0,6
20-1
0,7
10-0,8
0,9
7-0,5
1,2
6-0,4
1,5
4-0,2
2,0