LUẬN VĂN THẠC SĨ
Đại học Khoa học Tự nhiên

KHƢƠNG THỊ DOANH

Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây
viêm màng não tại bệnh viện Bạch Mai từ năm
2008 đến 2010

Chuyên ngành:

Vi sinh vật học

Hà Nội - 2012


LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
API

Analysis profile identification

ATCC

American Type Culture Collection

CDC

Center for Disease Control and Prevention (trung tâm
phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ

S

Sensitive (Nhạy cảm)

TM

Thạch máu

VMN

Viêm màng não

VK

Vi khuẩn

WHO

World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)


LUẬN VĂN THẠC SĨ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU………………………………………………………………...

1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN………………………………………………


1.3.1 Streptococcus suis…………………………………………...........

8

1.3.2 Streptococcus pneumoniae……………………………………….

10

1.3.3 Klebsiella pneumoniae…………………………………………...

12

1.3.4 Escherichia coli…………………………………………………..

13

1.3.5 Staphylococcus aureus…………………………………………..

15

1.3.6 Acinetobacter baumannii…………………………………………

16

1.3.7 Cryptococcus neoformans. ……………………………………....

17

Một số yếu tố liên quan đến tác nhân vi khuẩn và nấm gây
VMN ………………………......................................................

2.3 Vật liệu nghiên cứu …………………………………………………….

26

2.3.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và nấm gây bệnh….

26

2.3.2 Vật liệu trang thiết bị định danh ………………………………..

27

2.3.3 Vật liệu và sinh phẩm làm kháng sinh đồ……………………

27

2.3.4 Các dụng cụ hóa chất khác………………………………….

28

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu…….………………………..…………

29

2.4.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu……………………………………………..

29

2.4.2 Tiêu chuẩn loại trừ………………………………………………..


Chƣơng 3: KẾT QUẢ ………………………………………………………..

43

3.1 Kết quả nuôi cấy dịch não tủy ……………..………………………..

43

3.1.1 Phân bố độ đục DNT.............………………………….........

43

3.1.2 Kết quả nhuộm soi ...................………………………………….

44

3.1.3 Kết quả nuôi cấy dương tính…..………………………………..

47

3.1.4 Kết quả phân lập theo độ đục DNT..........………..................

48

3.1.5 Kết quả phân lập theo nhóm vi sinh vật gây bệnh……….....

50

3.1.6 Kết quả phân lập theo nhóm vi khuẩn gây bệnh…………


3.2.2 Cryptococcus neoformans………………………………………

62

Mức độ đề kháng kháng sinh của loài vi khuẩn gây VMN
thƣờng gặp………………………………………………............

64

KẾT LUẬN……………………………………………………………………

72

KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………

73

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………

74

PHỤ LỤC


LUẬN VĂN THẠC SĨ

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1

Phân bố theo độ đục dịch não tủy……………………..


51

Bảng 3.7

Tỷ lệ phân lập VK Gram dương …………….................

52

Bảng 3.8

Tỷ lệ phân lập VK Gram âm …………………...............

55

Bảng 3.9

Tỷ lệ phân lập các loài nấm .......................…………….

57

Bảng 3.10
Bảng 3.11

Tỷ lệ phân lập C. neoformans trên bệnh nhân nhiễm
HIV ………………………………………………….
Kết quả phân lập C. neoformans trên bệnh nhân nhiễm
HIV theo nhóm tuổi........................................................

62


65


LUẬN VĂN THẠC SĨ

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1

Ảnh chụp cắt lớp sọ não……………………………...

3

Hình 1.2

Hình ảnh tế bào S. suis ……………………………....

8

Hình 1.3

Hình ảnh tế bào S. pneumoniae ……..........................

10

Hình 1.4

Hình ảnh tế bào E. coli……………………................

13


Tế bào Cryptococcus trên tiêu bản mực tàu ở bệnh
phẩm 1670T
Giá đường AUX xác định C. neoformans ở bệnh
phẩm 1811T
Phân bố giá trị MIC penicillin G với chủng S. suis

58

59
65


LUẬN VĂN THẠC SĨ

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, đồng
nghiệp cùng bạn bè và gia đình
Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
tới:
PSG.TS. Đoàn Mai Phương, Trưởng khoa Vi sinh – Bệnh viện
Bạch Mai. Người thầy đã hướng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh
nghiệm cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau
đại học và các thầy cô giáo trong bộ môn vi sinh vật học – Trường Đại
học Khoa học tự nhiên đã giúp tôi trong suốt quá trình học tập.
Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc bệnh
viện Bạch Mai, các anh chị trong khoa Vi sinh – Bệnh viện Bạch Mai
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

lại những di chứng nặng nề, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và sự phát triển tâm
thần kinh ở người lớn và trẻ em
Căn nguyên gây viêm màng não rất đa dạng, có thể do vi khuẩn, virus,
vi nấm hoặc ký sinh trùng… Nhiều loài gây thành dịch, nhiều loài gây bệnh
không thành dịch, một số được coi căn nguyên gây bệnh thực sự, một số được
coi là căn nguyên gây nhiễm trùng cơ hội.
Ở cả người lớn và trẻ em, vấn đề xác định căn nguyên gây viêm màng
não rất cần thiết vì diễn biến lâm sàng đa dạng, tiến triển bệnh nhanh, cần
được điều trị kháng sinh sớm và hợp lý. Theo một báo cáo tại Mỹ tỷ lệ mắc
viêm màng não là 3-5/100.000 dân và mỗi năm có hơn 2000 trường hợp tử
vong. Ở nước ta, theo thống kê của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương, tỷ lệ
mắc và chết trong năm 1994 là 3,15 và 0,09/100.000 người dân mắc bệnh
dịch này [4]
Tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán viêm màng não do vi khuẩn hay nấm là
tìm thấy sự có mặt của căn nguyên gây bệnh trong dịch não tủy. Đây được coi
như một bệnh phẩm quan trọng trong chẩn đoán căn nguyên gây bệnh. Ở các
nguồn bệnh phẩm khác, không ở vị trí vô trùng như da, đờm, nước tiểu… khi
tìm ra căn nguyên vi khuẩn và nấm cũng chưa kết luận chắc chắn khả năng
gây bệnh thực sự của chúng, nhưng khi phân lập được vi khuẩn và nấm ở dịch
não tủy thì chắc chắn chúng là thủ phạm gây bệnh thực sự. Vì vậy, chẩn đoán


LUẬN VĂN THẠC SĨ
căn nguyên gây viêm màng não từ dịch não tủy có ý nghĩa quyết định.
Các đặc điểm dịch tễ học của viêm màng não thay đổi khác nhau theo
từng khu vực, từng giai đoạn cụ thể. Bởi vậy, nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ
học của viêm màng não cũng như cơ cấu căn nguyên, tình hình nhạy cảm và
kháng kháng sinh có ý nghĩa quan trọng trong công tác xây dựng chiến lược
điều trị và dự phòng hợp lý cho từng khu vực trong từng giai đoạn nhất định
giúp bác sỹ lâm sàng có thêm cơ sở đưa ra những quyết định sử dụng kháng

Màng não bao bọc não và tủy sống. Màng não có 3 lớp: ngoài cùng là
màng cứng, giữa là màng nhện, trong là màng nuôi nằm sát bề mặt não và tủy.
Giữa màng nhện và màng nuôi có chứa dịch não tủy.
Màng não và nước não tủy bảo vệ não và tủy sống khỏi bị các chấn
động, là hàng rào chắn các vật lạ (vi sinh vật, hóa chất…) không cho xâm
nhập vào não. Sẽ có viêm màng não khi hàng rào bảo vệ thất bại (màng có thể
bị rách, chấn thương, số lượng vi sinh vật quá nhiều…)
Viêm màng não đe dọa mạng sống. Nếu không được điều trị, viêm màng
não có thể dẫn đến phù não và gây ra liệt vĩnh viễn, hôn mê và có thể tử vong
Hình 1.1: Ảnh chụp cắt lớp sọ não

1.1.2. Triệu chứng viêm màng não
 Triệu chứng điển hình
- Nhức đầu
- Cổ cứng


LUẬN VĂN THẠC SĨ
- Sốt và ớn lạnh
- Nôn
- Sợ ánh sáng
- Co giật (xảy ra ở 1/3 bệnh nhân viêm màng não)
- Các triệu chứng của viêm đường hô hấp trên (lạnh, xổ mũi, hắt xì,
ho, đau họng).
 Triệu chứng không điển hình
- Đau và sưng 1 hay nhiều khớp
- Bị nổi ban trông như những vết bầm
1.1.3. Phân loại viêm màng não [1], [16]
1.1.3.1. Phân loại theo căn nguyên
- Viêm màng não do vi khuẩn (VMN mủ): nhiều loại vi khuẩn có thể gây

chọc ống sống thắt lưng.
- Khi dịch não tủy màu vàng chanh: có thể là viêm màng não mủ có xuất
huyết, hồng cầu thoái hóa hoặc do lao màng não…
1.1.3.3. Phân loại theo loại tế bào chiếm đa số trong dịch não tủy
- Viêm màng não tăng bạch cầu đa nhân (neutrophil – gặp trong viêm
màng não do vi khuẩn)
- Viêm màng não tăng tế bào lympho (gặp trong viêm màng não do lao,
viêm màng não do virus, viêm màng não do vi khuẩn đã điều trị…)
- Viêm màng não tăng tế bào ái toan (eosinophil).
1.1.3.4. Phân loại bệnh theo cơ chế bệnh sinh
- Viêm màng não tiên phát: Thường do N. meningitidis hoặc H.
influenzae xâm nhập trực tiếp vào màng não qua xương sàng.
- Viêm màng não thứ phát:
+ Vi khuẩn từ ổ viêm gần màng não, màng tủy xâm nhập vào, như ổ
viêm tai, viêm xương chũm, viêm xương sọ, viêm xoang, viêm hốc


LUẬN VĂN THẠC SĨ
mắt, viêm cơ dọc theo cột sống…Mầm bệnh thường là H. influenzae,
phế cầu, tụ cầu, liên cầu…xâm nhập vào màng não qua tiếp cận hoặc
qua đường bạch huyết.
+ Vi khuẩn từ một ổ viêm ở xa (như ổ đinh râu, viêm phổi, viêm nội
tâm mạc, nhiễm khuẩn tử cung, nhiễm khuẩn ruột, nhiễm khuẩn tiết
niệu…) gây nhiễm khuẩn huyết và vi khuẩn vượt qua hàng rào mạch
máu – màng não vào màng não. Mầm bệnh ở những trường hợp này
thường là: S. pneumoniae, H. influenzae, tụ cầu, liên cầu, trực khuẩn
mủ xanh, E. coli, Salmonella…
+ Do vết thương hoặc phẫu thuật vùng sọ não, cột sống…hoặc do thủ
thuật chọc ống sống gây nhiễm khuẩn. Mầm bệnh thường gặp là: tụ
cầu, liên cầu, trực khuẩn mủ xanh…

Cryptococcus neoformans vẫn còn khá cao từ 10-30% ngay cả ở những nước
đang phát triển. Trên 95% các nhiễm nấm Cryptococcus gây tổn thương màng
não và não [21], [80].
Tại Việt Nam, trong thời gian dài viêm màng não do các căn nguyên vi
khuẩn thường gặp là N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae [4]…Song
những năm gần đây căn nguyên gây bệnh đã thay đổi rất đa dạng bao gồm cả
nấm và vi khuẩn là:
 Streptococcus suis
 Streptococcus pneumoniae
 Klebsiella pneumoniae
 Escherichia coli
 Staphylococcus aureus
 Acinetobacter baumannii
 Cryptococcus neoformans
 Pseudomonas earuginosa


LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.3. Các loại vi khuẩn và nấm gây viêm màng não thƣờng gặp
1.3.1 Liên cầu lợn (Streptococcus suis - S. suis)
Streptococcus suis thuộc nhóm cầu khuẩn Gram dương, xếp đôi hoặc
xếp chuỗi, không di động, đường kính 2 µm. S. suis thuộc liên cầu tan máu α.
Hiện nay, Streptococcus suis được xác định với 35 typ huyết thanh dựa vào
cấu trúc kháng nguyên vỏ từ typ 1 đến typ 34 và typ ½, trong đó typ 2 là phổ
biến nhất và hay gây bệnh trên cả người và lợn.
Streptococcus suis phát triển được trên môi trường giàu chất dinh
dưỡng. Liên cầu phát triển thuận lợi trong khí trường có oxy hoặc có một
phần CO2, nhiệt độ thích hợp là 370C. Trên môi trường thạch máu, liên cầu có
thể gây tan máu α (tan máu không hoàn toàn, xung quanh khuẩn lạc có vòng

Đông Nam Á [51].
Nhiễm S. suis từ lợn đã được báo cáo trên toàn thế giới, từ Bắc Mỹ (Mỹ
và Canada) đến Nam Mỹ (Brazil), châu Âu (Vương quốc Anh, Hà Lan, Pháp,
Đan Mạch, Na Uy, Tây Ban Nha, và Đức), châu Á (Trung Quốc,Thái Lan,
Việt Nam và Nhật Bản), Australia, và New Zealand [51]
Tại Việt Nam, S. suis được phát hiện năm 1997 nhưng mãi đến năm
2007, S. suis mới trở thành căn nguyên phổ biến.


LUẬN VĂN THẠC SĨ
Theo nghiên cứu tại phía nam nước ta trong vòng 10 năm 11/19966/2005, căn nguyên S. suis gây viêm màng não là tác nhân phổ biến nhất
chiếm tỷ lệ 33,6% (151ca). Trong 151 ca đó, 33,1% bệnh nhân tiếp xúc trực
tiếp với lợn hoặc thịt lợn. Tỷ lệ vong 2,6% [67]. Theo báo cáo khác của viện
lâm sàng nhiệt đới Quốc gia, 50 ca đã được phát hiện năm 2007, trong đó 26
(52%) ca đã bình phục hoàn toàn, 21 (42%) ca để lại di chứng, 3 ca đã tử
vong và giảm thính lực 38% [70].
1.3.2 Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)
S. pneumoniae được phân lập lần đầu bởi L. Paster ở Pháp năm 1881,
đồng thời với Stenberg, Hoa Kỳ. Mười năm sau đó, người ta thấy nó liên quan
đến những những nhiễm trùng nặng: viêm phổi thùy, viêm màng não, nhiễm
khuẩn huyết, viêm xoang…
S. pneumoniae là những cầu khuẩn Gram dương dạng ngọn nến,
thường xếp đôi, ít khi đứng riêng lẻ, đường kính khoảng 0,5-1,25 µm.
S. pneumoniae bắt Gram dương, không di động, không sinh nha bào, trong
bệnh phẩm hay trong môi trường nhiều albumin thì có vỏ [2], [14], [22].
Hình 1.3: Hình ảnh tế bào S. pneumoniae

Vi khuẩn này là tác nhân phổ biến gây bệnh viêm phổi nên thường gọi
là phế cầu (Pneumococcus). Trong môi trường lỏng, thường xếp thành chuỗi
ngắn nên được xếp vào chi Streptococcus.



LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hàng năm, có hàng ngàn trường hợp viêm màng não do phế cầu khuẩn
ở Mỹ và một triệu trường hợp trên toàn thế giới, tỷ lệ tử vong thay đổi từ 30
đến 80%, tùy thuộc vào độ tuổi và tình trạng sức khỏe của bệnh nhân [73].
Theo báo cáo của một số nhà nghiên cứu tại Lazio - Italy trong 5 năm 20012005, có tới 89% viêm màng não do căn nguyên vi khuẩn từ phế cầu. Ngoài
ra, bảy triệu trường hợp viêm tai giữa cũng do căn nguyên vi khuẩn này gây
bệnh mỗi năm [69]. Tại Nhật Bản, theo nghiên cứu của Hiroshi Sakata và
cộng sự, từ tháng 4/2004 đến tháng 1/2007, căn nguyên Streptococuss
pneumoniae gây viêm màng não chiếm 49% tương đương 35 ca trong tổng số
464 ca trong thời gian nghiên cứu [52].
Ở Việt Nam, trước đây viêm màng não do phế cầu cũng là căn nguyên
phổ biến, những năm gần đây căn nguyên này đã giảm đi đáng kể. Tại viện
lâm sàng nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh từ năm 1996-2005 viêm màng não
do căn nguyên phế cầu chiếm 11,1% đứng thứ hai sau căn nguyên S. suis
[67].
1.3.3 Klebsiella pneumoniae
Klebsiella là chi quan trọng của họ vi khuẩn đường ruột, được đặt tên
theo nhà vi khuẩn học người Đức, Edwin Klebs (1834-1913). Klebsiella
pneumoniae là đại diện điển hình nhất của chi.
Klebsiella pneumoniae là loài vi khuẩn phân bố rộng rãi trong thiên
nhiên, là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm khuẩn, viêm phổi, nhiễm khuẩn
huyết, viêm màng não, nhiễm khuẩn tiết niệu nhưng hay gặp ở đường hô hấp,
bệnh thường gặp ở trẻ sơ sinh, tỷ lệ tử vong rất cao nếu không được điều trị
sớm. Viêm màng não do Klebsiella pneumoniae là biến chứng của viêm tai
giữa, viêm phế quản…
Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, thường đứng thành
đôi, kích thước trung bình 0,3-1µm x0,6-6 µm. Không có lông, không di động
[2], [22].

có thể phát triển trên môi trường nghèo dinh dưỡng. Trong điều kiện thích
hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20-30 phút. Cấy
vào môi trường lỏng (canh thang) sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường,
sau 24giờ làm đục đều, sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng. Những
ngày sau dưới đáy có thể thấy cặn.
E. coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết
đều lên men lactose và sinh hơi trừ E. coli trơ (trong đó có EIEC) không hoặc
lên men chậm. E. coli có khả năng sinh Indol, không sinh H2S. Không sử
dụng được nguồn carbon của citrate trong môi trường simmons có
decarboxylase. Vì vậy, có khả năng khử carboxyl của lysin, orthinin, arginin
và acid glutamic. Thử nghiệm Voges-Prokauer (VP) sau 24h âm tính, sau 48h
có thể dương tính. Thử nghiêm này nhằm xác định sản phẩm chuyển hóa cuối
cùng là acetyl methyl carbinol, bằng thuốc thử KOH 40% (nếu có màu hồng
VP (+), nếu không có màu hồng VP (-).
Dựa vào tính chất gây bệnh E. coli có khả năng gây bệnh ở người được
chia thành 2 nhóm
+ Thứ nhất là E. coli gây bệnh đường ruột được biết đến bao gồm:
EPEC (Enterophathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột
EIEC (Enterotoinvasive E. coli): E. coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroahenrent E. coli): E. coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E. coli): E. coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây xuất huyết ruột
+ Thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột
MAEC (Meningitis – associated E. coli): E. coli gây viêm màng não


LUẬN VĂN THẠC SĨ
UPEC (Uropathogenic E. coli): E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết
niệu