Bộ khoa học và công nghệ
Viện ứng dụng Công nghệ
Trung tâm sinh học thực nghiệm
C6 - Thanh Xuân Bắc, Hà Nội
___________________________________________________
Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài
Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống
và nuôi trồng cây giống của hai loài
Lan Hài Việt Nam
PGS. TS Đặng Xuyến Nh
6124
25/9/2006
Hà Nội, 1- 2006
Bản quyền 2006 thuộc TTSHTN
Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Giám đốc TTSHTN trừ
trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu
BKHVCN
TTSHTN
BKHVCN
TTSHTN
BKHVCN
TTSHTN
ThS Vũ Thị Lan
CN Phạm Mỹ Phơng
1
Nh÷ng ch÷ ®−îc viÕt t¾t trong b¸o c¸o
BAP:
6- Benzylaminopurine
NAA:
α- Naphthaleneacetic Acid
TDZ:
Thidiazuron
VW:
Vacin & Went
HY:
Hyponex
MS:
Murashige & Skoog
Phơng pháp gieo hạt in vitro ............................................................................... 31
1.1 Tạo vật liệu khởi đầu ............................................................................................ 31
1.2 Giai đoạn nhân nhanh .......................................................................................... 33
1.3. Giai đoạn tạo cây hon chỉnh.............................................................................. 36
2.
Nhân giống vô tính bằng cách tách mầm (in vivo) ............................................... 37
2.1. Nhân giống bằng cách tách mầm có kèm theo thân chính .................................. 37
2.2. Nhân giống bằng cách tách mầm riêng lẻ ........................................................... 37
3.
Chăm sóc cây trong vờn ơm ............................................................................. 40
3.1. Chăm sóc cây in vitro .......................................................................................... 40
3.2. Chăm sóc cây in vivo........................................................................................... 42
4.
Theo dõi nhiệt độ v ánh sáng trong vờn ơm:................................................... 43
5.
Theo dõi sâu bệnh v cách phòng chống .............................................................. 43
III. Điều tra hiện trạng hai loi Lan Hi đợc nghiên cứu ............................................ 43
Phần c - Kết quả v thảo luận .................................................................................44
I.Nhân giống bằng phơng pháp gieo hạt in vitro ........................................................... 44
1. Tạo nguyên liệu ban đầu ............................................................................................. 44
1.1. ảnh hởng của môi trờng khoáng đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt P.
hangianum v P. gratrixianum từ nuôi cấy in vitro đa ra vờn ơm. ...................... 73
1.2. ảnh hởng của chế độ bón phân đến cây P. hangianum v P.
gratrixianum in vitro đa ra vờn ơm ...................................................................... 74
2.
Chăm sóc cây tách mầm (in vivo) P. hangianum v P. gratrixianum trong
vờn ơm......................................................................................................................... 77
2.1. Chăm sóc cây đợc tách mầm có kèm thân chính ............................................... 77
2.2. Chăm sóc cây theo cách nhân giống tách mầm riêng lẻ...................................... 79
3.
Theo dõi nhiệt độ v ánh sáng trong vờn ơm.................................................... 83
3.1. Điều chỉnh ánh sáng trong vờn ơm bằng hệ thống lới theo mùa ................... 83
3.2. Theo dõi nhiệt độ trung bình trong mùa hè v mùa đông trong vờn ơm ......... 83
4.
Theo dõi sâu bệnh v cách phòng chống .............................................................. 83
IV. Vi nét về hiện trạng hai loi P. hangianum v P. gratrixianum............................. 85
Phần D - Kết luận..............................................................................................................89
Kiến nghị...............................................................................................................................96
Ti liệu tham khảo .........................................................................................................97
4
Danh môc b¶ng
Bảng 1: Tỉ lệ nẩy mầm của hạt Lan Hài trên các môi trường khoáng khác nhau ....................46
Bảng 2: Sự nảy mầm của hạt Lan Hài ở độ tuổi khác nhau......................................................49
Danh môc biÓu ®å
Biểu đồ 1: Tỉ lệ nảy mầm của P. hangianum và P. gratrixianum trên các môi trường khác
nhau
47
Biểu đồ 2: Tỉ lệ nẩy mầm của hạt sau 3 tháng gieo
49
Biểu đồ 3: Tỉ lệ nẩy mầm của P. gratrixianum sau 3 tháng gieo cấy
51
Biểu đồ 4: Hệ số nhân ở các môi trường khoáng khác nhau
54
Biểu đồ 5: Ảnh hưởng của pH tới hệ số nhân
55
Biểu đồ 6: Ảnh hưởng của kinetin tới giai đoạn nhân nhanh
56
Biểu đồ 7: Ảnh hưởng của pepton tới nhân nhanh Lan Hài
57
Hình 15: Mầm riêng lẻ được tách từ P. hangianum..................................................................39
Hình 16: Mầm kèm thân chính của P.gratrixianum..................................................................39
Hình 17: Mầm riêng lẻ được tách từ P. gratrixianum ..............................................................40
Hình 18: Các loại giá thể trồng Lan .........................................................................................41
Hình 19: Tiến hành thụ phấn P. hangianum .............................................................................44
Hình 20: Cây P. hangianum mang quả trong vườn ươm ..........................................................45
Hình 21: Quả P. hangianum .....................................................................................................45
Hình 22: Quả P. gratrixianum ..................................................................................................45
Hình 23: Nảy mầm của hạt P. hangianum trên môi trường RE ...............................................48
Hình 24: Nảy mầm của hạt P. gratrixianum trên môi trường RE.............................................48
Hình 25: Lan Hài giai đoạn nhân nhanh ..................................................................................53
Hình 26: Ảnh hưởng của dịch chuối tới nhân nhanh P. gratrixianum......................................59
Hình 27: Lan Hài ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh....................................................................64
Hình 28: P. gratrixianum tách mầm..........................................................................................69
Hình 29: P. gratrixianum tách mầm riêng lẻ ............................................................................69
Hình 30: Cây P. hangianum đưa ra vườn ươm.........................................................................72
Hình 31: Cây P. gratrixianum đưa ra vườn ươm......................................................................72
Hình 32: P. gratrixianum in vitro trồng trên các giá thể khác nhau ở vườn ươm ....................76
Hình 33: P. hangianum và P. gratrixianum in vitro ở vườn ươm .............................................76
Hình 34: P. hangianum tách mầm trên các giá thể khác nhau .................................................80
Hình 35: Cây P. gratrixianum tách mầm được 3 tháng ............................................................82
Hình 36: Cây P. gratrixianum tách mầm được 1 năm ..............................................................82
Hình 37: Khu hệ tự nhiên của P. hangianum - Tuyên Quang ...................................................86
Hình 38: P. hangianum trong tự nhiên......................................................................................86
Hình 39: P. gratrixianum trong tự nhiên (Ảnh L. Averyanov) ..................................................87
7
Phần a: tổng quan tI liệu
chiếc hi nằm ở vị trí thấp nhất của hoa - do đó nó trở thnh tên chung của nhóm
Lan ny.
Chi Lan Hi Paphiopedilum có nguồn gốc châu á nhiệt đới, đợc phân bố
trải di từ đông ấn Độ, Nepal, Bhutan, Miến Điện qua Nam Trung Hoa đến
Đông Nam á, quần đảo Malay, Philippin, Tân Ghinê v quần đảo Solomons. Có
lẽ từ vùng châu á nhiệt đới, Lan Hi đã di chuyển dần về phía Đông tới tận
Sulawesi, Tân Ghinê v quần đảo Solomons trên Thái Bình Dơng nhờ các hạt
giống nhẹ đợc phát tán.
8
Hỡnh 1: Bn phõn b Lan Hi trờn th gii (vựng mu xanh)
Lan Hi l những cây có dạng thân thảo thờng sống trên những lớp mùn,
lá mục hoặc rêu ở trên cây, trên đất hoặc trên đá với những rễ dạng sợi mọc từ
thân rễ. Loi Lan ny đợc phát hiện vo khoảng hơn 100 năm trớc v hấp dẫn
ngời yêu hoa bởi vẻ đẹp riêng biệt của nó.
Lan Hi Paphiopedilum đợc Pfitzer mô tả lần đầu tiên vo năm 1886,
cho đến năm 1903 Pfitzer đã ghi nhận đợc 47 loi Lan Hi. Đối với các nh
thực vật học, việc nghiên cứu về phân loại v tiến hoá của Paphiopedilum l một
đề ti hấp dẫn. Tuy Lan hi l một nhánh nhỏ từ dòng tiến hoá chung của Lan
nhng rất đợc chú ý. Do sự phân bố địa lý v một số đặc điểm của Lan hi m
ngời ta đã xếp nó vo nhóm Lan nguyên thuỷ. Nhờ những mẫu liệu sống phong
phú của tập đon Lan hi, các nh khoa học đã xây dựng đợc bảng phân loại
ngy cng tốt hơn v hiểu biết rõ hơn mối quan hệ tiến hoá của giống Lan ny.
Tuy vậy, việc phân loại Paphiopedilum khá phức tạp v thờng bị lẫn lộn. Sự
phát triển những kỹ thuật dựa trên phân tích gen có thể giúp đánh giá tốt hơn sự
biến đổi của cả bên trong loi v giữa các loi cũng nh mối quan hệ của chúng.
Theo Cribb (1998) chi Lan Hi Paphiopedilum có 3 chi phụ l:
9
Paphiopedilum đợc thụ phấn nhờ côn trùng nh các con ong nhỏ v bọ có cánh,
ruồi. Do cấu tạo của hoa (Hình 1) sự tự thụ phấn hầu nh không có v thụ phấn
chéo l phổ biến ở loi Lan ny. Trong tự nhiên đã thu đợc một số dẫn chứng
dẫu rằng ít ỏi về quá trình lai tự nhiên v có thể nói rằng quá trình ny tơng đối
có tính đặc hiệu loi. Tuy nhiên không tránh khỏi có thể có những côn trùng
khác với loại côn trùng thờng thụ phấn cho hoa bị mắc vo trong hoa. Khả năng
ny cũng xảy ra khi các loi sống gần nhau có cùng thời gian ra hoa. Nhiều tác
giả đã mô tả các loi Lan Hi lai trong tự nhiên nh: Rolfe, Pfitzer (1903), De
Wildeman (1906), Pradhan (1976), Braem (1988).
Kể từ khi đợc phát hiện trong tự nhiên, Lan Hi đã sớm đợc đa về châu
Âu. Vo cuối thế kỷ 19 đã có 40 loi Lan Hi đợc trồng ở châu Âu. Tại đây đã
có nhiều công trình nghiên cứu nhằm lai các loi Lan Hi để tạo nên những loi
lai với những bông hoa có vẻ đẹp phong phú hơn. Các loi nhiệt đới châu á của
chi Paphiopedilum đã đợc lai giống để trồng rất phổ biến ở các nớc âu Mỹ
trong khoảng từ 140 năm nay. Cây Lan Hi lai nhân tạo nở hoa lần đầu tiên ở
vờn ơm của Messrs Veitch năm 1869, đó l cây lai của hai loi P. villosum v
P. barbatum. Hiện nay đã có hơn 10.000 loi Lan Hi lai l kết quả lai tạo đợc
thực hiện ở các nớc châu Âu, Mỹ, Nhật
ở Đi Loan, Hội Lan Hi đã đợc thnh lập để xúc tiến việc nuôi trồng v
nhân giống Lan Hi trên hòn đảo ny. trong những năm gần đây, Đi loan đã
thu đợc nhiều thnh tựu trong việc nhân giống v nuôi trồng lan Hi, họ hy
vọng sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp Lan hi ra thị trờng thế
giới. Phần lớn Lan hi đợc đa vo Đi loan khoảng đầu những năm 90 của thế
kỷ trớc, những ngời lm vờn ở đây gặp nhiều khó khăn trong bớc đầu nhân
giống nhng đến năm 2000 họ đã xuất khẩu đợc hơn 20.000 cây giống v năm
2003 đã xuất khẩu đợc khoảng 86.000 cây Lan hi trị giá 1.1 triệu USD. Mỹ l
thị trờng chủ yếu nhập khẩu Lan Hi từ Đi loan.
Quốc. Các loi Lan Hi mới đợc phát hiện v phân loại ở Việt Nam l P.
helenae (1996), P. tranlienianum (1998), P. hangianum (1999), P. vietnamense
(1999). Số lợng các Lan Hi đặc hữu của Việt Nam khá nhiều: P. coccineum, P.
hangianum, P. helenae, P. hermanii, P. jackii, P. jackii var. hiepii, P.
tranlienianum, P. delenatii, P. dalatense, P. vietnamense
13
Hỡnh 3: Lan Hi Hng Lan P.
emersonii
Averyanov, Cribb, Phan Kế Lộc v Nguyễn Tiến Hiệp (2003) đã có một
công trình chuyên khảo có giá trị về Lan Hi Việt Nam bao gồm những nghiên
cứu về hình thái giải phẫu, sự lai giống, sinh thái, phân bố địa lý v phân loại các
loi Lan Hi ở nớc ta. Theo các tác giả ny đến năm 2003 đã xác định đợc 18
loi Lan Hi ở Việt Nam, đồng thời cũng phát hiện đợc 4 loi lai tự nhiên. Có
rất nhiều loi lan Hi Việt Nam có giá trị bởi tính đặc hữu hoặc bởi vẻ đẹp của
nó: P. vietnamense, P. hangianum, P. delenatii, P. gratrixianum, P.
tranlienianum
P. hangianum v P. gratrixianum - hai loi Lan Hi đợc phát hiện ở miền
Bắc Việt Nam, l hai loi Lan Hi đẹp v đang có nguy cơ bị tiêu diệt.
P. hangianum (Hi Hằng) đợc Perner v Gruss mô tả, phân loại lần đầu
tiên vo năm 1999. Loi Lan Hi ny thờng sống trên các kẽ đá phủ rêu trên
vùng núi đá vôi ở độ cao khoảng 450-750 m của miền Bắc Việt Nam. P.
hangianum nở hoa trong tự nhiên từ tháng 4 đến tháng 5, bông hoa khá to, có
mu vng nhạt với mùi thơm ngọt ngo. Đây l loi Lan đặc hữu của Việt Nam.
14
cho đến năm 2003, tất cả các quần thể P. gratrixianum trong tự nhiên ở vùng ny
hầu nh đã bị suy kiệt hon ton.
III. Nuôi trồng Lan Hi
Nói chung Paphiopedilum mọc rất chậm, nhng nếu đợc cung cấp những
điều kiện tốt, chúng vẫn có thể phát triển dù cho không có rễ. Những điều kiện
tốt đó l: nhiệt độ, độ ẩm v che bóng thích hợp. Paphiopedilum cần 3 nguyên tố
đa lợng N, P, K v những yếu tố vi lợng khác.
Các giá thể thờng dùng để trồng Lan Hi l: rêu, đá, gỗ vụn, vỏ cây
Thông thờng rất khó xác định Lan Hi thực tế mọc tốt hay kém, cách tốt nhất
để biết l kiểm tra xem rễ có phát triển không. Trong một số trờng hợp chúng
có thể ngừng sinh trởng cả năm. Có tác giả cho rằng có thể trồng
Paphiopedilum trong giá thể bất kỳ miễn l có kỹ thuật trồng đúng.
17
ánh sáng thích hợp cho Lan Hi phụ thuộc vo từng loi, nói chung độ
che bóng cần thiết cho Lan Hi vo mùa hè l 50 - 70%, vo mùa đông l 30 50%.
Nhiệt độ thích hợp cũng phụ thuộc vo từng loi, phụ thuộc vo địa điểm
phát sinh của chúng. Một số loi có thể thích ứng dễ với điều kiện nh lới. Nói
chung nhiệt độ thích hợp cho Lan Hi nằm trong khoảng 15 - 28C, ở nhiệt độ
cao hơn cần tạo sự thông gió tốt trong vờn ơm.
Việc nuôi trồng Lan Hi ở các nớc châu Âu v Mỹ có lẽ đã đi trớc các
nớc khác một bớc nếu nhìn vo quá trình lâu di v kỹ thuật nuôi trồng Lan
Hi ở những nớc ny. Gần đây Nhật v Đi loan đã nổi lên nh l những nơi bắt
đầu phát triển nuôi trồng Lan Hi, theo Yu-Ching Tsai v J. J Chen (2004) Bắc
Mỹ luôn luôn l trị trờng nhập khẩu Lan Hi chủ yếu từ Đi Loan trong 4 năm
vừa qua, sau đó đến Hồng Kông, Canada, Nhật cũng l những thị trờng lớn. Kỹ
thuật nuôi trồng Lan Hi tại các nớc ny phát triển khá tốt đáp ứng đợc nhu
cầu buôn bán v thởng ngoạn loi Lan ny.
Có thể nhận thấy nhiều môi trờng dinh dỡng khác nhau đã đợc mô tả cho các
chi v các loi Lan khác nhau. Nếu chọn đợc môi trờng dinh dỡng thích hợp
thì hầu nh tất cả các hạt Lan có thể nẩy mầm in vitro, điều ny đợc biết nh sự
nẩy mầm không có sự cộng sinh.
Có nhiều yếu tố ảnh hởng đến nẩy mầm v sinh trởng của Lan, chúng
phụ thuộc rất nhiều vo thnh phần loi. Hadley cho rằng hạt của các Lan biểu
sinh nẩy mầm nhanh hơn so với Lan sống trên đất.
Nói chung hạt cha chín khó nẩy mầm hơn so với hạt đã chín hon ton.
Theo nhiều nh nghiên cứu, hạt Lan có thể nẩy mầm trớc khi quả chín. Luke
(1971) cho rằng về nguyên tắc hạt Lan có thể gieo khi hạt mới đợc 1/ 2 giai
đoạn chín nhng ông vẫn khuyên rằng không nên gieo trớc khi quả đạt đợc 2/
3 giai đoạn chín.
Giai đoạn cây nằm trong ống nghiệm hoặc bình tam giác thờng khác
nhau: khoảng từ 6 tháng đến 2 năm.
19
Hạt thờng nẩy mầm ở nhiệt độ 20 - 25C. Giai đoạn nẩy mầm thờng cần
độ chiếu sáng thấp hoặc che tối hon ton, độ di ngy khoảng 12 16 giờ với
sự chiếu sáng của đèn huỳnh quang.
Môi trờng dinh dỡng thờng đợc khuyến cáo có nồng độ thạch l 0,6 0,8%, trong môi trờng cần có cả yếu tố đa lợng v vi lợng, mặc dù cũng có
nghiên cứu sử dụng môi trờng không có yếu tố vi lợng. Lan thờng đòi hỏi có
sắt để nẩy mầm v rất có thể cũng cần cả mangan.
Các môi trờng khoáng thờng đợc sử dụng để nẩy mầm v sinh trởng
Lan l: Knudson C (1946), Vacin & Went (1949), Thomale GDI (1957), Burgeff
- 3f (1957). Có những nghiên cứu cho rằng mặc dù môi trờng Thomale GDI
không chứa canxi nhng môi trờng ny vẫn phù hợp với Lan Hi (Pierik,1987).
Đối với những cây nẩy mầm trong bóng tối, đờng cực kỳ quan trọng vì
lúc ny chúng hon ton sinh trởng dị dỡng. Nói chung hm lợng đờng sử
dụng trong nảy mầm Lan thờng ở nồng độ 1-3%, sacharose thờng đợc sử
nhân tạo Lan Hi vẫn luôn l một thách thức.
Việc nghiên cứu nhân giống vô tính Lan Hi mới chỉ đạt những kết quả
bớc đầu, cha thấy có thông báo về việc nhân nhanh với số lợng lớn Lan Hi
bằng phơng pháp nuôi cấy mô.
Năm 1973, Bubeck đã có những nghiên cứu đặt nền móng cho nuôi cấy
đỉnh sinh trởng của Lan Hi, sau đó Stewart v Button (1975) cũng đã tiếp tục
nghiên cứu vấn đề ny. Tuy vậy, các nghiên cứu ny vẫn cha thực sự thnh
công.
Koshiro Kawase ở trờng Đại học Tổng hợp Kyoto đã nhân giống vô tính
Lan Hi bằng phơng pháp nuôi cấy mô các bộ phận bầu, cuống hoa v mầm
hoa cha phát triển. Kết quả cho thấy: với việc sử dụng môi trờng Vacin &
Went, từ bầu hoa cha nở v từ mầm hoa cha phát triển có sự phát triển tuy còn
21
chậm của phần mô giống nh callus. Nhng từ cuống hoa không quan sát đợc
sự phát triển của chồi.
Năm 2004, Chen v các cộng sự đã nghiên cứu nhân giống hai loi Lan
Hi P. philippinense lai trên cơ sở gây vết thơng trên lá. Kết quả đã tạo đợc
các chồi trên vết thơng sau một tháng nuôi cấy trên môi trờng tối. Việc bổ
sung TDZ đã lm tăng số chồi trên các lá đã bị gây vết thơng đối với cả hai loi
Hi lai.
Hiện nay Lan Hi chủ yếu đợc nhân giống bằng phơng pháp gieo hạt in
vitro. Có thể nói kỹ thuật nuôi cấy Lan Hi bằng cách gieo hạt in vitro trong
những thập kỷ qua đã trở nên có thể đạt đợc. Nói chung các hạt Lan Hi có thể
nẩy mầm trên môi trờng chứa đờng, thạch v một số yếu tố vi lợng. Hiện nay
có rất nhiều môi trờng với các công thức khác nhau, có những môi trờng dùng
cho một số loi riêng biệt, một số môi trờng có thể dùng gieo hạt Lan nói
chung, có ngời còn có công thức riêng của mình v giữ bí mật.
Tuy vậy, Tanaka cho rằng sự nẩy mầm nhân tạo Lan Hi cũng không đơn
P. delenatii
:
P. philippinense :
P. bellatulum :
5 tháng
4 tháng
4 tháng 10 ngy
Các môi trờng thích hợp cho sự nẩy mầm các loi đợc nghiên cứu trên
đây l: Thomale GD, 1/ 4 MS v 1/ 8 MS.
Gần đây việc nghiên cứu sử dụng thidiazuron (TDZ) có tác dụng nh một
loại cytokinin trong nuôi cấy mô đã đa ra triển vọng mới để nhân nhanh các
loi Lan Hi. Lin v các cộng sự (2000) đã thnh công trong việc tạo ra v duy
trì protcorm cũng nh chồi từ mô sẹo của một loi Lan Hi lai. Các tác giả đã
khẳng định mô sẹo tiềm năng đợc tạo ra từ hạt nảy mầm trên môi trờng MS có
bổ sung TDZ có thể sinh trởng tốt hoặc phân hóa trên cùng môi trờng. Huang
v cộng sự (2001) cũng nghiên cứu tìm ra đợc môi trờng nhân nhanh một số
loi Lan Hi lai khác.
23
Copyright: Tài liệu đại học ©