MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những
nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người

. Hiện nay tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao

được xác đị nh là chiếm 1/3 dân số thế giới . Có khoảng 9 triệu người mắc lao
mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm . Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt
37% số bệnh nhân ước tí nh . Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được
chữa trị và đang tiếp tục làm lây lan bệnh cho c ộng đồng.
Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với đặc trưng là kháng
đa thuốc. Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là
điều trị thất bại cao , dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao

kháng đa

thuốc mà còn chưa tì m ra được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý , trong
khi các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung co5́ thuốc.
Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rấ

t

khó điều trị. Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc
sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao .
Để ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc

, hiện nay các cơ sở trong

nước vẫn phải dựa vào nuôi cấ y vi khuẩn và làm kháng sinh đồ
chuẩn đoán lao kháng thuốc cần í t nhất

đó kháng isoniazid .
Xuất phát từ những lý do trên , chúng tôi tiến hành đề tài : "Xác định
các đột biến trên gen katG liên quan đến tí nh kháng thuốc i soniazid của
một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam".
2. Mục tiêu nghiên cứu
1. Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu.
2. Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở
các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu.
3. Nội dung nghiên cƣ́u
- Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu .
- Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn
E. coli.
- Tách dòng gen katG.
- Giải trình tự gen katG.
- Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG liên quan đến tí nh kháng
thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu .

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình bệnh lao
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm
nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực
nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao [1]. Do sự

Số BN (nghìn)
Khu vực
Các thể

Châu Phi
Châu Mỹ
Trung Đông

Châu Âu
Đông nam Châu Á
Tây Thái Bình Dương
Toàn cầu

2354
(26%)
370
(4%)
622
(7%)
472
(5%)
2890
(33%)
2090
(24%)
8797
(100%)

Tỷ lệ/100 000


43

19

53

6

279

124

55

143

28

211

54

24

73

8

1294


cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm
20-30% thu nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm
vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập. Bệnh lao đã tác động mạnh

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm
sút, năng suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ không tham gia được.
Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của
ngân hàng thế giới ở Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ
trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao
là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự
phát triển kinh tế xã hội [22].
Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh trong cộng đồng có
điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém. Trên
95% số bệnh nhân lao, 98% số chết do lao trên toàn cầu thuộc các nước có
thu nhập vừa và thấp, 75% số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14-55, là
tuổi làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời [1, 22].
Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm
cho bệnh lao phát triển.
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Việt
Nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu
(TCYTTG, 2004). Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ
ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng
như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [1].

Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh
nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu
của TCYTTG. Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá
cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997,
TCYTTG và hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế cùng phối hợp với
CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao
cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt
Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4].
Vì là một trong số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống
lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội
chống lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành
lập tổ chức này.
Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống
lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một
trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia
và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao
được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của
TCYTTG và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [4].
Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở
các tỉnh phía nam là 2%, ở các tỉnh phía bắc là 1%).
Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có một s ố lượng
lớn người bị mắc lao mới . Số lư ợng người mắc lao mới được thể h iện qua
bảng 1.2.

Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của
TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện
nay ở mức cao chưa từng có. Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa
thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca
nhiễm lao hàng năm. Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc
cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [5].
Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu,
đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc. Bệnh lao kháng thuốc xuất
hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao,
nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc
điều trị được quy định của chương trì nh chống lao , một nguyên nhân khác
hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng do không phối hợp đầy đủ các
thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không
đúng cách, điều trị không đủ thời gian...
Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là
đối với bệnh nhân kháng đa thuốc. Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa
thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí
không điều trị được ở một số trường hợp.
Tỷ lệ kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới ở khu vực Tây Thái
Bình Dương dao động trong khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu
trong khu vực) [4].
Dự án nghiên cứu kháng t huốc lao trên cơ sở toàn c ầu được thực hiện
từ năm 1995 với mục tiêu là xác đị nh được tổng số bệnh nhân lao kháng
thuốc trên thế giới bằng những phương pháp thống nhất thử độ nhạy với thuốc
lao của vi khuẩn . Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tì nh hì nh
vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới [6].
Theo công bố này , tỷ lệ kháng thuốc tiê n phát trung bì nh với riêng từ ng
loại thuốc có khác nhau , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%,
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

, đe dọa công cuộc

phòng chống lao trên toàn cầu , vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay
đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc

. Trong khi các thuốc

chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì các thuốc chống lao loại hai lại
thường có độc tí nh cao và giá thành đắt [5].
Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm .
Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h và cộng sự đã công bố t ỷ lệ kháng thuốc mắc
phải v ới isoniazid là

53 %, với paraminosalicylic acid là 26 %, với

steptomycin là 59 % [6].
Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tì nh hì nh kháng thuốc của vi
khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại

. Tỷ lệ kháng thuốc tiên

phát là 32,5 % đứng thứ tư trong khảo sát của TCYTTG sau Latvia

(34%),

Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%). Qua các nghiên cứu đã
cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc
cao trên thế giới [6].

9

người [6,7].
1.2.2. Đặc điểm hình thể
Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước 2 – 4 μm, rộng 0,3 – 1,5
μm. Trực khuẩn thanh mảnh , đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hì nh chữ N , Y, V
hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây .
Vi khuẩn lao không di động , không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc
nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào [7].
1.2.3. Khả năng gây bệnh
Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế
giới. Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh
nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ
vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn
cho sức khỏe cộng đồng. Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân
gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ chế này tạo nên độc
lực của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và
gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé
nhỏ này [7].
Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor”

(trehalose –

6,6’ – dimycolate ) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu , gây nên
những u hạt mãn tí nh . Miễn dị ch trong bệ nh lao ngày nay được xác đị nh là

1.3. Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao
Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc
thể của vi khuẩn lao và chị u trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase

-

peroxidase. Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng
isoniazid có đột biến trên gen này [28].
Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase. Enzyme này hoạt
hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành
phức hệ axyl isonicotinic-NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme
ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất
enoyl-AcpM. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho
thành tế bào vi khuẩn lao. Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có
liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô
nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và 463 (S315T) của gen katG
mã hóa catalase-peroxidase. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại
codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm
giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase-peroxidase do đó M.
tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [51]. Do đó phát hiện sự thay
đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc
nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M. tuberculosis kháng
isoniazid.
1.4. Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid
Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp

chẩn

đoán kiểu gen. Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác
đị nh đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng .


biến là codon 315 [34].
Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC
hoặc AGC  ACA) [34].
Để giải trì nh tự gen katG, hiện nay người ta có thể thực hiện trực tiếp
từ sản phẩm PCR . Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho
việc phân tí ch kết quả thì có thể thực hiện giải trì nh
giải trình tự thông

tự trực tiếp . Cũng có thể

qua tách dòng , gắn đoạn gen katG cần nghiên cứu vào

vector. Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp được nhân lên trong tế bào E.coli.
Khi giải trì nh tự gen , cả đoạn gen katG và 1 phần vector đề u được xác đị nh
trình tự . Giải trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng khi sản phẩm PCR
không được tốt , đặc biệt là trong các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm
chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu h iện gen [6].

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis được cung cấp bởi Học viện
Quân y.


ĐA5

TB06-28

HSRE

ĐA6

TB06-31

HSRE

ĐA7

TB06-33

HSRE

ĐA8

TB06-35

HSR

ĐA9

TB06-36

HSRE


14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.2. Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiê n cƣ́u
2.2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính
Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất chính
Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1. H/c dùng trong PCR
Tris base

Applied BioSciences (Mỹ)

Lysozyme

Fermentas (Mỹ)

Proteinase K

Sigma (Mỹ)

Agarose

Sigma (Mỹ)

Ampicilin

Fermentas (Mỹ)

X-gal

Fermentas (Mỹ)

IPTG

Fermentas (Mỹ)

Accuprep plasmid Mini Extraction Kit

Fermentas (Mỹ)

EcoRI

Fermentas (Mỹ)

pBT

Fermentas (Mỹ)

3. H/c phục vụ giải trì nh tƣ̣ gene
Big Dye Terminator V3.1

Applied BioSciences (Mỹ)

HiDi Formamid


Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Heraeus (Mỹ)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Thommas Scientific (Mỹ)

Máy chụp ảnh Gel-Doc

Dolphin (Mỹ)

Tủ lạnh -200C, -800C

Nuaire (Mỹ)

Lò vi sóng

Sanyo (Nhật Bản)

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Nuaire (Mỹ)

Bể ổn nhiệt

Memmert (Đức)

Máy lắc Gyromax 737R

2.3.1. Thiết kế nghiên cƣ́u
Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp :
- Dịch tễ học mô tả, điều tra cắt ngang, có đối chứng.
- Thực nghiệm labo có đối chứng .
Sơ đồ nghiên cƣ́u
DNA (Tách từ vi khuẩn
lao đã đƣợc xác đị nh tí nh
kháng thuốc)

Nhân bản đoạn gen katG
sƣ̉ dụng mồi đặc hiệu

Sản phẩm gen KatG

Tách dòng gen KatG

Sản phẩm vector có đoạn
gen KatG

Xác định đột biến liên
quan đến tí nh kháng INH

Giải trình tự gen KatG

17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên







Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR

Thể tí ch (µl)

Nước

Nồng độ

10,25

MgCl2 (25 mM)

2,5

2 mM

PCR bufer (10X)

2,5

1X

dNTP mix (5mM)

2,5

0,2 mM

3. Chu trì nh nhiệt như sau :
35 chu kỳ
950C
5 phút

950C
1 phút

720C
1 phút

720C
4 phút

560C
45 giây
40C
60 phút
4. Điện di sản phẩm PCR trên a garose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide
và đọc kết quả trên máy Gel - Doc.

19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.3.2.2. Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen
katG
Sơ đồ qui trì nh tách dòng

bày ở bảng 2.5.

20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên