BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
-------------------------

Nguyễn Thị Hà

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM
SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME
CHITINASE CAO
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
- Luận văn này là công trình nghiên cứu khoa học của tôi
- Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố

Tác giả luận văn


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy là giảng viên khoa sinh học trường
Đại học su phạm TP HCM, người đã định hướng đề tài cho tôi, quan tâm, giúp đỡ và thông cảm cho


T
5
1

DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................................................... 8
15T

15T

MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................. 1
15T

T
5
1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................. 2
15T

15T

1.1. NS trong hệ sinh thái RNM ...................................................................................................... 2
15T

15T

1.1.1. Giới thiệu về RNM ............................................................................................................. 2
T
5

1

T
5
1

1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi ......................................................................................... 7
T
5
1

T
5
1

1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM ........................................................................ 9
T
5
1

1.2.

T
5
1

Chitin và chitinase ................................................................................................................ 10

15T


1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase: .................................................................. 14
T
5
1

T
5
1

1.2.2.4. Tính chất sinh hóa của chitinase ................................................................................. 14
T
5
1

T
5
1

1.2.2.5. Phân loại chitinase ..................................................................................................... 15
T
5
1

15T

1.2.2.6. Ứng dụng của chitinase .............................................................................................. 16
T
5
1


1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitinase trong và ngoài nước ............................................ 21
15T

T
5
1

1.3.1. Ngoài nước...................................................................................................................... 21
T
5
1

15T

1.3.2. Trong nước....................................................................................................................... 24
T
5
1

15T

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................................. 25
15T

T
5
1

2.1. Vật liệu .................................................................................................................................... 25
15T


15T

2.2.1. Phương pháp kích hoạt giống .......................................................................................... 27
T
5
1

T
5
1

2.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi ...................................................................................... 27
T
5
1

T
5
1

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS .............................................................. 28
T
5
1

T
5
1


1

T
5
1

2.2.8. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường
T
5
1

kính vòng phân giải ................................................................................................................... 30
15T

2.2.9. Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu ................ 30
T
5
1

T
5
1

2.2.10. Phương pháp định lượng protein [8] ............................................................................. 33
T
5
1

T
5

T
5
1

15T

2.2.11.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ....................................................................................... 36
T
5
1

T
5
1

2.2.11.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl .................................................................... 36
T
5
1

T
5
1

2.2.11.6. Khảo sát hàm lượng cơ chất chitin ........................................................................... 36
T
5
1

T

5
1

T
5
1

2.2.13.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của chitinase ..................................................... 39
T
5
1

T
5
1

2.2.14. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani của
T
5
1

chế phẩm enzyme chitinase [4], [20] .......................................................................................... 40
T
5
1

2.2.15. Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm
T
5
1


3.2.2. Chủng nấm số 10 ............................................................................................................. 45
T
5
1

15T

3.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2
15T

chủng NS P. citrinum và A. protuberus ......................................................................................... 47
T
5
1

3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn C trong MT nuôi cấy ................................................................... 47
T
5
1

T
5
1

3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .................................................................................. 48
T
5
1


1

năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P. citrinum ................................................................ 55
T
5
1

3.4. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum ........................................ 58
15T

T
5
1

3.4.1. Thu nhận CP chitinase thô bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 ......................................................... 58
T
5
1

R

R

R

R

R

R1

5
1

T
5
1

3.5.2. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm 64
T
5
1

T
5
1

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 66
15T

T
5
1

4.1. Kết luận ................................................................................................................................... 66
15T

T
5
1


5
1

PHỤ LỤC 3. CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM ............................................................................... 76
15T

T
5
1

PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH ................................................................................................ 77
15T

15T

PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG NS NGHIÊN CỨU .......................................... 79
15T

T
5
1


DANH MỤC VIẾT TẮT

BT: bào tử
BSA: Bovine serum albumin
CPE: chế phẩm enzyme
DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit
HT: hoạt tính

Trong vitro những thí nghiệm thử HT kháng nấm bằng cách sử dụng Trichderma harzianum đã làm
phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides.
Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn một số chủng NS từ RNM Cần
Giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao”

Mục tiêu của đề tài:
Góp phần tìm hiểu đặc điểm và vai trò của enzyme chitinase từ các chủng NS có nguồn gốc từ
RNM Cần Giờ làm cơ sở cho việc ứng dụng trong thực tiễn
Nhiệm vụ của đề tài
1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có
trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM. Chọn ra 2 chủng có khả
năng sinh enzyme chitinase cao
2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài 2 chủng thu được


3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 chủng NS đã
chọn. Chọn ra 1 chủng NS có HT enzyme chitinase cao để tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch
thực nghiệm.
4. Thu nhận và nghiên cứu một số đặc điểm của CPE chitinase thô
5. Bước đầu thử nghiệm tác dụng chế phẩm chitinase thô trong phòng trừ nấm bệnh hại cây
trồng
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu nội dung 1 tại PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM
Nghiên cứu nội dung 2 tại Phòng Xét Nghiệm NK – Biotek, quận 7, Tp. HCM
Nghiên cứu nội dung 3,4,5 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại
học Cần Thơ
Đề tài được tiến hành trong thời gian từ tháng 4 năm 2011 đến tháng 9 năm 2011

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NS trong hệ sinh thái RNM

Hệ sinh vật: thực vật trên 150 loài, động vật thủy sinh không xương sống trên 700 loài, cá trên
137 loài, động vật có xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài động vật có vú,
chim có khoảng 130 loài.
Vi sinh vật gồm nấm men, NS, vi khuẩn, xạ khuẩn… vi sinh vật có vai trò hết sức quan trọng
đối với hệ sinh thái RNM. Vi sinh vật phân bố rộng rãi và có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Nhiều vi
sinh vật có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích
của con người. Tuy nhiên cho đến nay những nghiên cứu về vi sinh vật ở RNM còn rất ít, chưa tương
xứng với qui mô và tiềm năng của hệ vi sinh vật RNM
1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
NS là nhóm có cấu tạo tế bào nhân chuẩn, cấu trúc tế bào tính từ ngoài vào trong gồm: thành tế
bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh và nhân phân hóa. Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài
nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng gọi là neocercosporin
Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên
cơ quan sinh sản, đó chính là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành BT là một tế bào sinh
sản, thường có dạng hình cầu. Mỗi loài nấm có hình dạng BT và màu sắc BT có khác nhau. Chính màu
sắc của BT đã tạo nên màu sắc của các KL và màu sắc đặc trưng của các chi và loài nấm.
Sợi nấm có đường kính trung bình 5-10µm, đôi khi rất lớn tới 25µm nhưng cũng có khi rất nhỏ
chỉ 1-2µm. Chiều dài sợi nấm có thể đạt vài chục centimet. Sợi nấm có thể có vách ngăn tạo thành
dạng đa bào, tuy nhiên do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào có thể có một, hai nhiều nhân
hay chẳng có nhân nào. Sợi nấm cũng có thể không có vách ngăn, bên trong sợi nấm chứa nhiều nhân
được gọi là các tế bào đa nhân, gặp ở các lớp Trichomycetes, Oomycetes


Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên
cơ quan sinh sản là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành nên các BT. BT là một tế bào sinh
sản, thường có dạng hình cầu. Khi BT được phân tán từ cơ thể mẹ đến nguồn cơ chất thích hợp nó sẽ
nảy mầm, phát triển theo cả 3 chiều tạo thành hệ sợi nấm mới. Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên
rất nhiều tạo thành một đám, ta có thể quan sát bằng mắt thường. Hệ sợi nấm phát triển đến giai này
được gọi là KL. Tùy theo loài mà KL có các hình dạng khác nhau nhưng thường có hình cầu. Sau một


P

P

pH: là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của NS, NS phát triển tốt ở MT hơi axit (pH
= 4 – 6). Tuy nhiên cũng có một số loài phát triển ở pH < 3 hay pH < 9 (Ingold, 1967). pH làm thay đổi
tính chất của màng tế bào và làm ảnh hưởng đến sự phân ly của các cấu tử thức ăn trong MT. Do đó, sự
hấp thu các loại thức ăn vào trong tế bào bị thay đổi. MT có pH quá cao hay quá thấp đều làm cho sự
sinh trưởng của NS yếu đi.


Ánh sáng: ánh sáng không cần cho quá trình sinh trưởng của hầu hết các loài NS, nhưng ánh
sáng lại ảnh hưởng đến sự hình thành BT của một số loài nấm
Khí oxi: nồng độ oxi rất cần cho hoạt động sống của NS vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc.
Nguồn C: cơ thể nấm không có diệp lục nên không có khả năng tự dưỡng và phải sống kí sinh,
hoại sinh hay cộng sinh. Chúng là những VSV dị dưỡng hóa năng hữu cơ. NS có khả năng đồng hóa
nhiều nguồn C khác nhau, ngoài những đường đơn dễ hấp thụ như glucose chúng cũng sử dụng trực
tiếp các đường như mantose, saccarose…
Nguồn N: N đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia thành phần cấu tạo của các protein và
đặc biệt là enzyme. NS có khả năng đồng hóa cả nguồn N hữu cơ lẫn vô cơ, các chủng NS khác nhau
có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn N.
Độ mặn: Đa số các NS ở RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng
độ muối từ 2% - 20%. Thậm chí một số NS ở RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30%. Đây
là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM.

- Sinh hóa [1]
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển NS tiết ra MT ngoài nhiều sản phẩm như các sắc tố,
các chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm, trong đó nhiều chất có HT sinh học có ý nghĩa quan trọng
đối với con người cũng như hệ sinh thái như các các enzyme, kích thích tố tăng trưởng, vitamin, kháng

galacturonic, galactose, methanol….được ứng dụng trong sản xuất nước quả, rượu vang, hoặc trong sản
xuất cà phê hòa tan, chế biến đay gai…Những NS có khả năng sinh pectinase cao được chú ý là
P.glaucum, Asp.awamori, P.citrinum…
Chitinase: Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucoszamine liên kết với
nhau bởi mối liên kết β - 1,4 – glucosid. Hàng năm trong tự nhiên có thể tạo 1010 – 1014 tấn chitin.
P

P

P

P

Chitinase bị VSV (chủ yếu là NS) phân giải liên kết β - 1, 4 – glucosid tạo ra các N-acetylglucoszamine. Hệ chitinase mạnh còn giúp các NS (Trichoderma spp., Glyocladium spp., Chaetomium
spp.) tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh (Fusarium oxysporium, Botritiscinerea,
Pyricularia oryzae… có thành tế bào là chitin) và các loài nấm B. bassiana, M. anisopliae, P.
fumosoroseus… chống các loài côn trùng có vỏ chitin. Các NS này được sử dụng làm tác nhân kiểm
soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng trong nông – lâm nghiệp.


VSV nói chung và NS nói riêng thường không có khả năng tạo được tỉ lệ cân đối giữa các
enzyme, có loài tạo được nhiều enzyme này, loài khác lại tạo nhiều enzyme khác. Các loài nấm thường
có HT amylase và chitinase rất mạnh [6][7]
HT sinh các chất kháng sinh:
Chất kháng sinh là một trong số những sản phẩm trao đổi chất bậc hai do NS sản xuất ra. Hiện
có rất nhiều công trình nghiên cứu vai trò của chất kháng sinh đối với đời sống. Tuy nhiên, hiện có hai
giả thiết về vai trò của chất kháng sinh được nhiều nhà khoa học ủng hộ hơn cả. Giả thuyết thứ nhất
cho rằng việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo khả năng sống sót cao cho
chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là với các loài có BT. Người ta đã xác định được
một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sự nảy mầm của BT chính chủng sinh ra chất kháng sinh đó.

* Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Đây là phương pháp kỹ thuật rất hiện đại và tương đối mới mẻ. Các thao tác cơ bản được sử
dụng là kĩ thuật thu nhận DNA, chạy PCR và giải trình tự axit nucleic.
Thu nhận DNA
Yêu cầu của kỹ thuật này là phải thu được các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị
phân hủy bởi tác nhân hóa học và cơ học. Ba bước cơ bản của kĩ thuật DNA :
Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA,
đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform
(hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. Thu nhận axit nucleic.
Làm kết tủa axit nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu nhận các axit nucleic dạng cô
đặc, dễ bảo quản.
Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên tắc
Khuếch đại một trình tự DNA lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1 (biến tính)
Trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm của phân tử, thường là 940C – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút.
P

P

P

P


Bước 2 (lai)
Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động trong khoảng từ

1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM
Với đặc điểm riêng của NS ở RNM, chúng đã mang lại nhiều vai trò mang tính quyết định đối
với hệ sinh thái RNM.
Trong điều kiện của RNM – nơi mà nguồn dinh dưỡng chủ yếu là các biopolymer của sinh khối
thực vật RNM và động vật biển thì các NS chính là tác nhân tham gia tích cực vào quá trình phân giải
các hợp chất hữu cơ phức tạp này, là mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và tham gia khép kín chu
trình sinh địa hóa của RNM. Cụ thể hơn, nhờ hệ thống các enzyme ngoại bào mạnh như amylase,
cellulase, protease,…chúng phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan, cung cấp chất


dinh dưỡng và năng lượng cho cả hệ sinh thái. Các chức năng trên có thể kể đến như việc NS ở RNM
phân hủy mùn bã hữu cơ thành nguồn thức ăn khoáng để nuôi dưỡng cây ngập mặn và tảo phù du, phân
hủy các phần rơi rụng của cây ngập mặn thành mùn bã hữu cơ tạo nguồn thức ăn cho các động vật tiêu
thụ cấp 1.
Bản thân NS ở RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ và ấu
trùng của một số loài (Odum, 1980; Alogi, 1989). NS ở RNM cũng là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng
cho các VSV hóa dị dưỡng khác, từ đó làm giàu quần thể VSV [6].
NS ở RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống với việc phân giải các chất độc hại
trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng. Bên cạnh vai trò làm sạch MT sống
nói chung, NS ở RNM còn có vai trò làm sạch MT sinh vật với chức năng là tác nhân kiểm soát sinh
học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái.
NS ở RNM chỉ có mặt ở những lá đang phân hủy khi còn tiếp xúc trực tiếp được với oxi tự do.
Vì vậy, rất có thể vai trò của nấm trong quá trình phân hủy các sản phẩm rơi rụng của RNM chỉ tồn tại
khi các sản phẩm này còn trôi nổi trên mặt nước hoặc gần với lớp bùn đất bề mặt RNM [6], [7]. NS có
khả năng biến đổi cơ chất, điều chỉnh MT cho các cơ thể khác sử dụng [6]
Tuy nhiên, các hoạt động sống của NS ở RNM lại làm giảm lượng oxi trong đất, bùn RNM do
quá trình hô hấp, gây bệnh cho động thực vật hoặc thải vào MT một số chất độc như: ammoniac,
sunfuahidro… [6], [7].
Kết luận: NS ở RNM có vai trò vô cùng quan trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ
sinh thái RNM, có vai trò bảo vệ MT sinh thái nói chung và MT sinh thái RNM nói riêng, cũng như có


R

R

R

trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm acetyl amin (-NHCOCH 3 ) (cấu trúc
R

R

I). Như vậy chitin là poly (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các
liên kết β-(1-4) glycoside. Trong đó các đơn phân của chitin cũng được đánh số như của glucose. Cấu
trúc của chitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine). Hơn nữa chitin tồn tại rất
hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn trong liên kết cộng hóa trị (covalent bond) với các protein,
CaCO 3 và các hợp chất hữu cơ khác.
R

R

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử chitin
Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu
hình: α, β, γ – chitin. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi đơn phân
(N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi đơn phân này bằng mũi tên sao cho phần


đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH 2 OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH 3 , thì các cấu trúc α, β, γ- chitin
R


rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các
sản phẩm này.
Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là
chitin hoặc chitosan. Glucosamine được cơ thể dùng để sản xuất ra các proteoglycan. Glucosamin chủ
yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp.