ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1
MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION
LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1
MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION
LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số : 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Tiếng Anh

TiếngViệt

Deoxyribonucleic

Acid deoxyribonucleic

Bp

Base pair

Cặp bazơ nitơ

CDS

Coding sequence

Trình tự mã hóa cho protein

CTAB Cetyl trimethylamoni bromide
dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic

Ethylen diamin tetraacetic acid



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 3
1.1.Vài nét sơ lƣợc về cây lúa ........................................................................ 3
1.2.Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật....................................... 5
1.2.1.Đất mặn .............................................................................................. 5
1.2.2.Cơ chế thích nghi stress mặn ở Thực vật................................... ........6
1.2.3.Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa...............................................7
1.3.Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở Thực
vật......................................................................................................................9
1.4. Protein HKT ở thực vật........................................................................... .10
1.4.1. Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật.......................... ... 10
1.4.2 Họ protein HKT ở lúa ...................................................................... 12
1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen..........13
1.6.Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1 ................................... 14
1.7.Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài ....................................... 15
1.7.1.Mục tiêu ........................................................................................... 15
1.7.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................... 15
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16
2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................ 16
2.1.1. Mẫu vật nghiên cứu ........................................................................ 16
2.1.2. Mồi phản ứng PCR ......................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất ......................................................................................... 17
2.1.3.1.Các hóa chất đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số........................18
2.1.3.2.Môi trƣờng trồng thủy canh...................................................18
2.1.3.3.Phản ứng PCR đƣợc thực hiện cùng với Taq DNA polymerase
2.1.3.4.Sản phẩm phản ứng PCR.......................................................19
2.1.4. Thiết bị ............................................................................................ 19
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 19



DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại chi Oryza[85]. ........................................................... 4
Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa ...... 5
Bảng 1.3. Danh sách các protein thuộc họ protein HKT ở lúa ................... 12
Bảng 2.1. Danh sách các giống lúa nghiên cứu ......................................... 16
Bảng 2.2. Các cặp mồi phản ứng PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ....... 17
Bảng 2.3. Môi trƣờng đa lƣợng ............................................................. 18
Bảng 2.4. Môi trƣờng vi lƣợng ....................................................................... 18
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa...20
Bảng 2.6. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển........ 21
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 23
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ....................................................... 23
Bảng 3.1Vị trí sai khác acid amin...................................................................41
Bảng 3.2.Bảng số liệu sau 3 ngày xử lý mặn..................................................60
Bảng 3.3.Bảng số liệu sau 7 ngày xử lý mặn..................................................62
Bảng 3.4.Bảng số liệu sau 14 ngày xử lý mặn................................................64

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cây lúa (Oryza sativa L.) ................................................................ 3
Hình 2. Cơ chế thích nghi stress chung ở Thực vật ..................................... 7
Hình 3. Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao.....................................................9
Hình 4.Chức năng vận chuyển của protein HKT........... ....................... 11
Hình 5. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thƣớc các đoạn exon, intron của chín gen
OsHKT ở lúa ........................................................................................ 13

Hình 29. So sánh trình tự vùng không mã hoá của gen giữa các giống lúa... 39
Hình 30. So sánh trình tự acid amin suy diễn từ trình tự nucleotide thu đƣợc
giữa các giống lúa ........................................................................................... 40
Hình 31. Cấu trúc protein xuyên màng ........................................................... 41

vi


MỞ ĐẦU
Lúa là một trong năm loại cây lƣơng thực chính trên thế giới, diện tích trồng
lúa và lƣợng tiêu thụ chủ yếu ở Đông Nam Á và Châu Phi... Hiện nay, lúa đƣợc
trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt
đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất cả các châu lục [4, 61 ].
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa với nền
văn minh lúa nƣớc có trên 4000 năm lịch sử. Việt Nam còn đƣợc xếp vào hàng
những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Sản lƣợng gạo xuất khẩu năm 2014
lên tới 44,5 triệu tấn lúa (27,8 triệu tấn gạo). Lúa gạo cung cấp nguồn lƣơng thực

chính cho chúng ta, tạo việc làm cho hàng triệu nông dân và đóng vai trò quan
trọng trong sự phát triển kinh tế của Việt Nam.
Tuy nhiên, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lƣơng thực, sự
khan hiếm về nƣớc tƣới phục vụ cho nông nghiệp đã đƣợc báo động trong
nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây. Lũ lụt và sự xâm nhập mặn sẽ
trở thành vấn đề then chốt trong những năm tới. Với tầm quan trọng nhƣ vậy,
ngƣời ta đã hoạch định một thứ tự ƣu tiên trong đầu tƣ nghiên cứu tính chống
chịu mặn và chống chịu hạn trên toàn thế giới, trong lĩnh vực cải tiến giống
cây trồng, sau đó là tính chống chịu lạnh, chống chịu ngập úng, chống chịu
đất có vấn đề (acid, thiếu P, ngộ độc Fe, ngộ độc Al, thiếu Zn, Mg, Mn và
một số chất vi lƣợng khác nhƣ Cu,…). Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại
của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần đƣợc quan tâm

nghiệp Việt Nam.
7.Trần Danh Sửu, Lƣu Ngọc Trình (2001), “Sử dụng chỉ thị ADN để nghiên
cứu quan hệ di truyền tiến hoá của lúa địa phƣơng các vùng Tây Bắc và
Tây Nam nƣớc ta”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng,số1/2001. Tr.
25-29, Viện Di truyền nông nghiệp.
8.Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa và cộng sự (2010). “Nghiên cứu đa
dạng di truyền lúa nếp địa phƣơng ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ bằng chỉ
thị SSR”. Kết quả nghiên cứu Khoa học và Công nghệ 2006 – 2010. Viện
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

26


Tài liệu Tiếng Anh
9.Apse, M.P., Aharon, G.S., Snedden, W.A. & Blumwald, E. 1999.
“Salt

tolerance conferred

by overexpression of a vacuolar

Na+/H+antiport in Arabidopsis”. Venice 285, 1256-1258.
10.Amtmann, A. & Sanders, D. 1999. “ Mechanisms of Na+ uptake by
plant cells”. Advance botanical research 29, 75-112.
11.Babourina, O., Shabala, S. & Newman, I. 2000. “Verapamil-induced
kinetics of ion flux in oat seedlings”. Australian journal of plant
physiology 27, 1031–1040.
12.Berthomieu, P., Conejero, G., Nublat, A., Brackenbury, W.J., Lambert, C.,
Savio, C., Uozumi, N., Oiki, S., Yamada, K., Cellier, F., Gosti, F.,
Simonneau, T., Essah, P.A., Tester, M., Very, A.A., Sentenac, H., &

integration in the control of ion channels for stomatal movement”.
Journal of experimental botany 48, 529-537.
17.Blumwald, E. 2000. “ Sodium transport and salt tolerance in
plants”.Current opinion in cell biology 12, 431-434.
18.Bush, D.R. 1993. “ Proton-coupled sugar and amino-acid transporters
in plants”. Annual review of plant physiology and plant molecular
biology 44, 513–542.
19. Calliste Jérémie Diédhiou. 2006. “ Adaptive response mechanism salt
stress in plants”. Plant physiology 131, 676-683.
20.Chauhan, S., Forsthoefel, N., Ran, Y., Quigley, F.,Nelson, D.E. & Bohnert,
H.J. 2000. “ Na+/myo-inositol symporters and Na+/H+-antiport in
Mesembryanthemum crystallium”. The plant journal 24, 511-522.
21.Colmer, T.D., Flowers, T.J. & Munns, R. 2006. “Use of wild relatives to
improve salt tolerance in wheat”.Journal of experimental botany 57, 10591078.
22.Cramer, G.R. & Jones, R.L. 1996. “ Osmotic stress and abscisic acid
reduce cytosolic calcium activities in roots of

Arabidopsis thaliana”.

Plant, cell and environment 19, 1291-1298.
23.Davenport, R.J. & Tester, M. 2000. “ A weakly voltage-dependent,
nonselective cation channel mediates toxic sodium influx in wheat”. Plant
physiology 122, 823-834.
24.Demidchik, V., Davenport, R.J. & Tester, M. 2002. “ Nonselective cation
channels in plants”. Annual review of plant physiology and plant
molecular biology 53, 67-107.
25.Demidchik,

V.


and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+ antiporter
from rice”. Plant and cell physiology 45, 146-159.
31.Fukuda, A., Yazaki, Y., Ishikawa, T., Koike, S. & Tanaka, Y. 1998.
“Na+/H+antiporter in tonoplast vesicles from rice roots”. Plant and cell
physiology 39, 196-201.
32.Gao, D., Knight, M.R., Trewavas, A.J., Sattelmacher, B. & Plieth, C. 2004.
“Selfreporting Arabidopsis expressing pH and [Ca2+] indicators unveil
ion dynamics in the cytoplasm and in the apoplast under abiotic
stress”. Plant physiology 134, 898-908.
33.Gárbarino, J. & Dupon, F.M. 1988. “NaCl Induces a Na+/H+Antiport in
Tonoplast Vesicles from Barley Roots”. Plant physiology 86, 231-236.
34.Garciadeblás, B., Senn, M.E., Banuelos, M.A. & Rodriguez-Navarro,
A. 2003. “ Sodium transport and HKT transporters: the rice model”. The
plant journal 34, 788–801.
35.Gelli, A. & Blumwald, E. 1993. “ Calcium retrieval from vacuolar
pools (characterisation

of

a

vacuolar

physiology 102, 1139–1146.

29

calcium

channel)”.

tissue specific”. Plant

physiology 125, 1643–1654.
41.Golldack, D., Quigley, F., Michalowski, C.B., Kamasani, U.R. &
Bohnert, H.J. 2003. “ Salinity stress-tolerant and -sensitive rice (Oryza
sativa L.)

regulate AKT1-type

potassium

channel

transcripts

differently”. Plant molecular biology 51, 71-81.
42.Golldack, D., Su, H., Quigley, F., Kamasani, U.R., Munoz-Garay, C.,
Balderas, E., Popova, O.V., Bennett, J., Bohnert, H.J. & Pantoja, O.
2002. “Characterization of a HKT-type transporter in rice as a general
alkali cation transporter”. The plant journal 31, 529-542.
43.Greenway, H. & Munns, R. 1980. “Mechanisms of salt tolerance in non
halophytes”.Annual review of plant physiology 31, 149–190.
44.Greenway, H. & Osmond, C.B. 1972. “ Salt responses of enzymes
from species differing in salt tolerance”. Plant physiology 49, 256–259.

30


45.Gruwel, M.L.H., Rauw, V.L., Loewen, M. & Abrams, S.R. 2001.
“Effects of sodium chloride on plant cells; a 31P and 23Na NMR

World Bank. Washington, D. C.
54.Horie, T., Yoshida, K., Nakayama, H., Yamada, K., Oiki, S. & Shinmyo,
A. 2001. “ Two types of HKT transporters with different properties of
Na+ and K+ transport in Oryza sativa”. The plant journal 27, 129-138.
54.Knight,

H.,

Trewavas,

A.J.

&

Knight,

M.R.

1997.

“Calcium

signalling in Arabidopsis thalianaresponding to drought and salinity”.
The plant journal 12, 1067–1078.
55..Mäser, P., Gierth, M. & Schroeder, J.I. 2002. “Molecular mechanisms of
potassium and sodium uptake in plants”. Plant and soil 247, 43–54.
56.Plant physiology 134, 1514-1526. Pardo, J.M., Cubero, B., Leidi, E.O.
& Quintero, F.J. 2006. “Alkali cation exchangers: roles in cellular
homeostasis and stress tolerance”. Journal of experimental botany 57,
1181-1199.

Manila,

The

Philippines,137p.
61.Yeo, A.R., Flowers, S.A., Rao, G., Welfare, K., Senanayake, N. & Flowers,
T.J. 1999. “ Silicon reduces sodium uptake in rice (Oryza sativa L.) in

32


saline conditions and this is accounted for by a reduction in the
transpirational bypass flow”. Plant, cell and environment 22, 559-565.
62. />
33