ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1
MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION
LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

Nguyễn Thị Nha Trang

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1
MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION
LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số : 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Tiếng Anh

TiếngViệt

Deoxyribonucleic

Acid deoxyribonucleic

Bp

Base pair

Cặp bazơ nitơ

CDS

Coding sequence

Trình tự mã hóa cho protein

CTAB Cetyl trimethylamoni bromide
dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic

Ethylen diamin tetraacetic acid



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 3
1.1.Vài nét sơ lƣợc về cây lúa ........................................................................ 3
1.2.Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật....................................... 5
1.2.1.Đất mặn .............................................................................................. 5
1.2.2.Cơ chế thích nghi stress mặn ở Thực vật................................... ........6
1.2.3.Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa...............................................7
1.3.Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở Thực
vật......................................................................................................................9
1.4. Protein HKT ở thực vật........................................................................... .10
1.4.1. Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật.......................... ... 10
1.4.2 Họ protein HKT ở lúa ...................................................................... 12
1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen..........13
1.6.Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1 ................................... 14
1.7.Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài ....................................... 15
1.7.1.Mục tiêu ........................................................................................... 15
1.7.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................... 15
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16
2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................ 16
2.1.1. Mẫu vật nghiên cứu ........................................................................ 16
2.1.2. Mồi phản ứng PCR ......................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất ......................................................................................... 17
2.1.3.1.Các hóa chất đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số........................18
2.1.3.2.Môi trƣờng trồng thủy canh...................................................18
2.1.3.3.Phản ứng PCR đƣợc thực hiện cùng với Taq DNA polymerase
2.1.3.4.Sản phẩm phản ứng PCR.......................................................19
2.1.4. Thiết bị ............................................................................................ 19
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 19



DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại chi Oryza[85]. ........................................................... 4
Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa ...... 5
Bảng 1.3. Danh sách các protein thuộc họ protein HKT ở lúa ................... 12
Bảng 2.1. Danh sách các giống lúa nghiên cứu ......................................... 16
Bảng 2.2. Các cặp mồi phản ứng PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ....... 17
Bảng 2.3. Môi trƣờng đa lƣợng ............................................................. 18
Bảng 2.4. Môi trƣờng vi lƣợng ....................................................................... 18
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa...20
Bảng 2.6. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển........ 21
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 23
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ....................................................... 23
Bảng 3.1Vị trí sai khác acid amin...................................................................41
Bảng 3.2.Bảng số liệu sau 3 ngày xử lý mặn..................................................60
Bảng 3.3.Bảng số liệu sau 7 ngày xử lý mặn..................................................62
Bảng 3.4.Bảng số liệu sau 14 ngày xử lý mặn................................................64

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cây lúa (Oryza sativa L.) ................................................................ 3
Hình 2. Cơ chế thích nghi stress chung ở Thực vật ..................................... 7
Hình 3. Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao.....................................................9
Hình 4.Chức năng vận chuyển của protein HKT........... ....................... 11
Hình 5. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thƣớc các đoạn exon, intron của chín gen
OsHKT ở lúa ........................................................................................ 13

Hình 29. So sánh trình tự vùng không mã hoá của gen giữa các giống lúa... 39
Hình 30. So sánh trình tự acid amin suy diễn từ trình tự nucleotide thu đƣợc
giữa các giống lúa ........................................................................................... 40
Hình 31. Cấu trúc protein xuyên màng ........................................................... 41

vi


MỞ ĐẦU
Lúa là một trong năm loại cây lƣơng thực chính trên thế giới, diện tích trồng
lúa và lƣợng tiêu thụ chủ yếu ở Đông Nam Á và Châu Phi... Hiện nay, lúa đƣợc
trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt
đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất cả các châu lục [4, 61 ].
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa với nền
văn minh lúa nƣớc có trên 4000 năm lịch sử. Việt Nam còn đƣợc xếp vào hàng
những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Sản lƣợng gạo xuất khẩu năm 2014
lên tới 44,5 triệu tấn lúa (27,8 triệu tấn gạo). Lúa gạo cung cấp nguồn lƣơng thực

chính cho chúng ta, tạo việc làm cho hàng triệu nông dân và đóng vai trò quan
trọng trong sự phát triển kinh tế của Việt Nam.
Tuy nhiên, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lƣơng thực, sự
khan hiếm về nƣớc tƣới phục vụ cho nông nghiệp đã đƣợc báo động trong
nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây. Lũ lụt và sự xâm nhập mặn sẽ
trở thành vấn đề then chốt trong những năm tới. Với tầm quan trọng nhƣ vậy,
ngƣời ta đã hoạch định một thứ tự ƣu tiên trong đầu tƣ nghiên cứu tính chống
chịu mặn và chống chịu hạn trên toàn thế giới, trong lĩnh vực cải tiến giống
cây trồng, sau đó là tính chống chịu lạnh, chống chịu ngập úng, chống chịu
đất có vấn đề (acid, thiếu P, ngộ độc Fe, ngộ độc Al, thiếu Zn, Mg, Mn và một
số chất vi lƣợng khác nhƣ Cu,…). Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự
nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần đƣợc quan tâm nghiên

Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza
glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là ngƣời đầu tiên đã
mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào dạng hạt tác giả đã phân chi
Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi
Oryza gồm tất cả 19 loài .
Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa
Quốc tế, Philippines năm 1994 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có
20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng[61].

3


Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New
Ginea là loài Oryza rhizomatis, đƣa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia
thành bốn nhóm genome [61]. Danh sách các loài, số lƣợng nhiễm sắc thể, bộ
gen của từng loài đƣợc ghi ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Phân loại chi Oryza[61]

Ngày nay, các nhà phân loại học đều thống nhất là chi Oryza có 23
loài, trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza
glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. [3,6]. Loài Oryza
glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa đƣợc
gieo trồng khắp thế giới và đƣợc chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica.
Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica
còn có nhiều loại hình trung gian nhƣ Javanica v.v..
Nghiên cứu biến đổi trình tự DNA của gen bằng phƣơng pháp địa lý thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng [2,7,8]. Kết quả cho thấy,
cây lúa trồng đã đƣợc thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau
4



-Hạt hầu nhƣ không
có đuôi

Hạt

-Trấu ít lông và lông
ngắn
-Hạt dễ rụng

Sinh học

-Tính quang cảm rất
thay đổi

-Lá rộng, cứng, xanh
nhạt
-Hạt to, dầy
-Hạt không có đuôi hoặc
có đuôi dài
-Trấu có lông dài
-Ít rụng hạt

-Tính quang cảm rất yếu

Lá hẹp, xanh đậm
-Hạt tròn, ngắn
-Hạt không đuôi tới
có đuôi dài
-Trấu có lông dài và
dầy

và đất thƣờng có pH cao [32].
1.2.2 Cơ chế thích nghi stress mặn ở thực vật
Nồng độ muối cao trong đất là nguyên nhân gây ra 2 vấn đề chính đối
với thực vật:
(1) giảm điện thế nƣớc trong đất gây khó khăn cho sự hấp thụ nƣớc, dẫn
đến tính trạng thiếu nƣớc;
(2) sự tích tụ hàm luợng Na+ và Cl- cao gây độc đối với tế bào thực vật
[10] và gián tiếp gây độc do khó hấp thụ các chất dinh duỡng cần thiết khác.
Khả năng chống chịu mặn của thực vật phụ thuộc vào sự thích nghi sinh
lý, sinh hóa và phân tử đƣợc kích hoạt bằng bộ gen để sống sót trong môi
truờng muối (Hình 2). Cơ chế thích ứng sẽ thiết lập lại sự vận chuyển nƣớc,
giới hạn hấp thụ Na+ và Cl- hoặc làm giảm nồng độ của chúng trong tế bào
chất và cho phép hấp thụ các ion cần thiết cho quá trình sinh trƣởng. Thực vật
cảm nhận stress mặn là do điện thế nƣớc trong môi trƣờng thấp,cây không thể
hút nƣớc và dẫn đến bị mất nuớc, kết quả là sự sinh trƣởng bị ức chế và dần bị
chậm lại. Vì thế, để có thể chống chịu với điều kiện điện thế nƣớc thấp do
stress mặn gây ra, thực vật phải điều chỉnh quá trình thoát hơi nƣớc, từ đó có
thể giới hạn sự mất nƣớc hoặc là tiến hành điều chỉnh điện thế thẩm thấu [19].
6


Stress
thẩm
thấu

Tình trạng
thiếu nƣớc

Độc tính
của Na+ và

tổng hợp sắc tố bị ức chế trong khi đó quá trình hô hấp lại tăng nhanh, các cơ
chất bị phân hủy lớn nhƣng hiệu quả năng lƣợng thấp, vì vậy thực vật không
bù đủ lƣợng vật chất do hô hấp phân hủy, chất dự trữ dần dần bị hao hụt, cây
không sinh trƣởng đƣợc, còi cọc, năng suất thấp, và nếu kéo dài sẽ dẫn đến bị
chết. Ðể có thể sinh trƣởng trên đất mặn, và hạn chế ảnh huởng của Na+ và
Cl-, thực vật đã phát triển cơ chế điều hòa với chiến lƣợc: giảm sự xâm nhập
và giảm nồng độ của Na+ trong tế bào chất bằng cách loại thải và khu trú ion
Na+ vào không bào, ƣu tiên hấp thụ K+(là ion đóng vai trò quyết định trong
việc đóng mở khí khổng, hoạt hóa enzyme, quang hợp và điều hòa áp suất
thẩm thấu) để duy trì tỉ lệ K+/Na+ trong chất nền [19] .

7


1.2.3 Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa
Tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các
giai đoạn sinh trƣởng khác nhau đối với cây lúa. Cơ chế chống chịu mặn của
cây đƣợc biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [55]. Mặn
ảnh hƣởng đến hoạt động sinh trƣởng của cây lúa dƣới những mức độ thiệt
hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trƣởng phát triển khác nhau[56,57].
Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở giai đoạn hạt
nẩy mầm, sau đó trở nên rất mẫn cảm trong giai đoạn mạ (tuổi lá 2-3), rồi trở
nên chống chịu trong giai đoạn tăng trƣởng, kế đến nhiễm trong thời kỳ thụ
phấn và thụ tinh, cuối cùng thể hiện phản ứng chống chịu trong thời kỳ hạt
chín[57,59].Tuy nhiên, một vài nghiên cứu ghi nhận ở giai đoạn lúa trổ, nó
không mẫn cảm với stress do mặn. Do đó, ngƣời ta phải chia ra nhiều giai
đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ cơ chế chống chịu mặn của cây trồng.
Theo [62], những thay đổi sinh lý của cây lúa liên quan đến tính chống
chịu mặn đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
• Hiện tƣợng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lƣợng muối dƣ

channels ( NSCCs ), kênh đồng vận chuyển cation- Cl- - cation-Cl−cotransporter (CCC), kênh vận chuyển cation ái lực thấp - low-affinity cation
transporter (LCT) salt overly sensitive 1 (SOS1) , Na+ / H+ antiporter NHX1
và kênh vận chuyển K+ ái lực cao - high affinity potassium transporter (HKT /
HAK). Tế bào rễ thực vật hấp thụ Na+ / K+ từ đất thông qua một vài kênh
nhƣ (NSCCs, AKT1, LCT1 và CCC), transporter (KUP / HAK / KT và HKT)
và apoplastic. Kênh thẩm thấu-Permeations Channel và apoplastic là những
con đƣờng chính để hấp thụ Na+ dƣới tress muối. Con đƣờng SOS trung gian
loại bỏ Na+ qua màng tế bào ra ngoài dung dịch đất hoặc apoplast. NHX1
phân vùng Na+ trong không bào và điều hòa nồng độ Na+ trong cytosol.
AtHKT1; 1, OsHKT1; 5, TaHKT1; 5 và TmHKT1; 4/5 đƣợc chứng minh có
vai trò lấy Na+ từ xylem vào các tế bào nhu mô xylem và ngăn chặn Na+ tích
lũy trong chồi. Có giả thuyết cho rằng AtHKT1; 1 gián tiếp phục hồi Na+ từ
chồi tới rễ thông qua việc loại bỏ các Na+ từ xylem và chuyên chở Na + vào .
Các quá trình này đảm bảo cân bằng K+ / Na+ nội bào và cũng duy trì tỉ lệ K+ /
Na+ cao để giúp thực vật duy trì sự sống khi bị stress muối[39].
9


Hình 3. Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao[39].
1.4 Protein HKT ở thực vật
1.4.1 Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật
Vai trò quan trọng của protein HKT trong việc giúp cho thực vật có
thể tồn tại trong điều kiện đất nhiễm mặn đã đƣợc khẳng định trong các thí
nghiệm loại gen trực tiếp làm cây mẫn cảm với muối và thông qua biểu hiện
biến đổi gen của các gen trong họ gen HKT ở các loài thực vật khác, ví dụ:
biểu hiện của các gen: OsHKT1(hình bầu dục màu tím), OsHKT 8(hình bầu
dục màu cam), AtHKT1(hình bầu dục màu hồng) ở thực vật cho phép chúng
phát triển tốt hơn trong điều kiện mặn.(Hình 4)

10

đến là một gen mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na + , góp phần vào
khả năng chịu mặn ở thực vật bằng cách duy trì cân bằng nồng độ K+ [60] .
Do đó, họ gen HKT ở lúa có vai trò quan trọng đối với cân bằng nồng độ ion
ở thực vật nhờ việc hạn chế ion Na+ đƣa vào tế bào trong điều kiện đất
nhiễm mặn [13].
Bảng 1.3 Danh sách họ gen HKT ở lúa[34,42 ]
TênProtein
HKT

Nucleotide

Locus

Protein

OsHKT1

AB061311

Os06g48810

BAB61789

OsHKT2

AB06611313

OsHKT3

AJ491820


CAD37197

OsHKT8

AK108663

Os01g20160

BAB93392

OsHKT9

AJ491855

Os06g48800

CAD37199

BAB661791

Và vị trí, kích thƣớc các đoạn exon , intron của 9 genesOsHKT đƣợc
biểu thị trên hình sau:

12


Hình 5. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thƣớc các đoạn exon, intron của chín
gen OsHKT ở lúa[34,42,61 ]
Các thanh màu đen đại diện cho khung đọc mở, và các vị trí và độ dài của intron

và OsVHA đã đƣợc nghiên cứu nhờ kỹ thuật RT-PCR và insitu PCR.
Gần đây, một gen OsHKT từ giống lúa chịu mặn Nona Bokra đã đƣợc
cô lập. Gen này có vùng 5' tƣơng ứng với gen OsHKT2, nhƣng vùng 3' tƣơng
ứng với các OsHKT1. Gen mới này đƣợc gọi là OsHKT1-2 và nó là kết quả
của đột biến mất đoạn 15 kb trên nhiễm sắc thể số 6 của Nona Bokra, dẫn đến
một liên kết giữa đầu 5' gen OsHKT2 và đầu 3' gen OsHKT1 [54] .
Biểu hiện của OsHKT1-2 trong tế bào trứng ếch hoặc tế bào nấm
men cho thấy rằng OsHKT1-2 cho phép hấp thu cả Na+ và K+ qua màng tế
bào ngay cả khi nồng độ Na+ bên ngoài cao. Hoạt động của protein OsHKT12 là tƣơng tự với OsHKT2. Nhƣ OsHKT1 và OsHKT2, protein OsHKT1-2
đƣợc biểu hiện trong rễ cho phép vận chuyển ion K + qua màng tế bào. Trái
ngƣợc với OsHKT1, biểu hiện của OsHKT1-2 giảm xuống trong điều kiện
mặn nhƣng chức năng không bị mất đi. Hơn nữa, mức giảm biểu hiện này
trong OsHKT1-2 là ít nghiêm trọng hơn so với việc giảm biểu hiện của gen
OsHKT1 và OsHKT2. Điều này cho thấy OsHKT1-2 đóng một vai trò quan
trọng trong việc vận chuyển ion K+ khi cây gặp điều kiện mặn [54] .
Một nghiên cứu tiếp theo trên đối tƣợng gen OsHKT1 là nghiên cứu
đột biến định hƣớng đƣợc thực hiện trên cDNA gen OsHKT1của giống lúa
Nipponbare (Ni-OsHKT1) để xác định biến thể trên gen. Gen Ni-OsHKT1
đƣợc biểu hiện trong tế bào trứng ếch và đƣợc nghiên cứu chức năng khi đƣợc
biểu hiện ở tế bào trứng. Ni- OsHKT1, khi biểu hiện trong tế bào trứng, giống
nhƣ một Na+-K+ symport ở nồng độ Na+ và K+ rất thấp, và nhƣ là một Na+
Uniport với nồng độ Na+ trong khoảng millimolar [19,20]. Ni- OsHKT1 đƣợc
14


chứng minh vận chuyển cả Na+ và K+ ở nồng độ thấp khi thay đổi điện tích điện áp (I- V) .Ở nồng độ Na+ cao, OsHKT1không tiếp tục vận chuyển K+ nữa.
Một đặc tính đặc trƣng của OsHKT1 là có ái lực cao với K+. Các tính chất
chức năng của protein mã hóa bởi gen Ni- OsHKT1 ở lúa đƣợc so sánh với
biến thể OsHKT1 biểu hiện trong tế bào trứng ếch và nhận thấy không có sự
khác biệt về tính thấm Na+ và K+ cũng nhƣ cho thấy tính chất chức năng

2
3
4
5
6
7

Tên Giống
Hom Râu
Nếp ốc
Nếp nõn tre
Ngoi
Nƣớc mặn dạng 2
Dâu Ấn độ
Nếp vải

STT
8
9
10
11
12
13
14

Tên Giống
Chiêm cũ
Ré nƣớc
IR-29(Chuẩn nhiễm)
Pokkali(Chuẩn kháng)