hướng dẫn đọc toàn văn báo cáo KQNC

!
!

Bạn muốn đọc nhanh
những thông tin cần thiết ?
Hy đọc qua Mục lục bên tay trái bạn trước khi
đọc báo cáo ( với Acrobat 4.0 trở lên, cho trỏ chuột vào
mỗi đề mục để đọc toàn bộ dòng bị che khuất )

! Chọn đề mục muốn đọc và nháy chuột vào đó
!
!

Bạn muốn phóng to hay thu nhỏ
trang báo cáo trên màn hình ?
Chọn, nháy chuột vào 1 trong 3 kích th
thưước
có sẵn trên thanh Menu

, hoặc

! Mở View trên thanh Menu, Chọn Zoom to
! Chọn tỷ lệ có sẵn trong hộp kích th
thưước
muốn,, Nhấn OK
hoặc tự điền tỷ lệ theo ý muốn

Chúc bạn hài lòng
với những thông tin đđưược cung cấp



protein/enzyme và công nghệ DNA tái tổ hợp đã thể hiện một vai trò ngày càng
quan trọng.
Nhiều loại loại protein/enzyme được sản xuất trong các hỗn hợp nội bào
phức tạp đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình tinh sạch chúng. Những
protein/enzyme được tinh sạch này thường được sản xuất để sử dụng trong trị
liệu, do đó phải cố gắng hướng tới các tiêu chuẩn tinh sạch rất cao và để có được
điều này người ta cần phải phát triển các quy trình tinh sạch phức tạp.
Vì những lý do đó tôi chọn đề tài: "Nghiên cứu lý thuyết về phương pháp
tách chiết hợp chất protit".
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm hiểu về protit, cấu tạo, tính chất và phân loại protit.
- Các phương pháp tách chiết, tinh sạch protit.
3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Cơ sở lí thuyết, phương pháp tách chiết protit.
- Phạm vi nghiên cứu: Các phương pháp tách chiết protit.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong khóa luận này nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
- Nghiên cứu tài liệu, giáo trình liên quan đến phương pháp tách chiết
protit.
- Nghiên cứu ví dụ cho phương pháp tách chiết, tinh sạch protit.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nghiên cứu lí luận: Đọc các giáo trình, tài liệu tham khảo
liên quan đến phương pháp tách chiết protit và ví dụ về phương pháp tách chiết
protit.
- Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia: Lấy ý kiến của giáo viên trực tiếp
hướng dẫn và các giáo viên khác trong lĩnh vực đề tài để hoàn thiện nội dung và
hình thức của khóa luận này.


tổng hợp ra protit.
Khi thủy phân đến cùng sẽ tạo thành các α-aminoaxit, thường protit có khối
lượng phân tử khoảng 104 đến 107.
1.2. Phân loại protit
Protit được chia ra làm hai loại chính: protein và proteit:
1.2.1. Protein
Protein là loại protit đơn giản, cấu trúc chỉ từ những α-aminoaxit khác
nhau. Các α-aminoaxit kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết
peptit (gọi là chuỗi polypeptit).
H
|
(gốc hữu cơ R) R – C – COOH (nhóm cácbôxylic)
|
NH2 (nhóm amin)
Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các
bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
Protein bao gồm hai loại chủ yếu: Protein tan trong nước và protein
không tan trong nước.
1.2.1.1. Protein tan trong nước
Protein tan trong nước thường kết tủa khi đun nóng, khó kết tủa trong
dung dịch muối.

4


 Albumin là protein đơn giản phổ biến nhất. Nó được tìm thấy ở trong
máu, dịch tế bào, dịch tuỷ sống. Anbumin có trong lòng trắng trứng, mô bắp thịt,
sữa. Anbumin chứa trong sữa cùng với protit khác gọi là cazein, bọt nổi lên khi
đun sôi sữa chủ yếu là anbumin. Albumin hoà tan trong nước và các dung dịch
muối. Anbumin trung tính, tương đối khó kết tủa trong dung dịch muối, vón lại

yếu là arginin và lysin (20-30%). Histon được Koccel tìm thấy trong nhân
tế bào, trong thành phần của nucleoprotein và các protein phức tạp khác. Điểm
đẳng điện của histon nằm trong khoảng 9,0 - 11,0.
 Protamin có tính bazơ mạnh, không chứa S, có trong cá nhà táng được
coi là chất protit đơn giản nhất trong protit, cho muối kết tinh. Protamin được
Miser và Koccel tìm thấy trong thành phần của nucleoprotein của tế bào sinh
dục cá. Sau đó còn phát hiện ở lách, tuyến điều và các cơ quan khác.
Protamin có trọng lượng phân tử thấp (2.000-8.000), thành phần chứa ít axit
amin (6 - 8), trong đó chủ yếu là axit amin điamin (tới 80% arginin). Khi đun
protamin không đông và không sa lắng, nó chỉ sa lắng bởi muối kim loại nặng.
Điểm đẳng điện của protamin nằm trong khoảng 10,5 - 12,0.
 Prolamin có trong ngũ cốc, tan trong rượu 80%. Chất tiêu biểu là glyadin,
là thành phần chính của gluten. Gluten (protit dính, tách được khi lọc tinh bột) là
hỗn hợp protit, ưu tiên có glyadin tan trong rượu còn các protit khác không tan
trong rượu. Prolamin có nhiều ở các hạt thảo. Đặc điểm của prolamin là tính hoà
tan trong cồn 70% và không tan trong nước. Khi thuỷ phân prolamin thường cho
nhiều thoăn và axit glutamic (43%).
 Keratin là chất chủ yếu của tóc, lông, sừng, móng, lớp thượng bì...hoàn
toàn không tan, kể cả trong dung dịch axit, kiềm. Khi thuỷ phân cho nhiều cystin
(7 - 12%) và axit glutamic (4 - 17%).
 Colagen (và procolagen) là protein của sợi mô liên kết ở gân, ở da, ở
dưới da, có trong cơ bắp, xương, … Nó không hoà tan trong nước, nhưng khi tác
động lâu của nhiệt sẽ trở thành dạng hoà tan là gelatin. Keo dán chế ở da trâu
chính là colagen. Hàm lượng glycin của colagen khá cao (25%), nhưng về nhiều
axit amin không thay thế được thì lại thiếu.
6


1.2.2. Proteit
Proteit là loại protit phức tạp, ngoài thành phần protein còn có các thành

1.3.1. Cấu trúc bậc nhất
Protit

là

một

chuỗi

aminoaxit kết hợp với nhau
bằng liên kết peptit tạo nên một
chuỗi mạch dài polypeptit gọi
là cấu trúc bậc nhất.
Cấu trúc bậc nhất được
thiết lập bằng phương pháp
phân tích nhóm cuối.
Trong mạch peptit, ngoài liên kết bình thường trong mạch còn có liên kết
sunfua giữa các phần của mạch, gọi là liên kết sunfua nội phân tử, thường là
giữa hai gốc cystein trong cùng mạch.
Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các axit
amin trên chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi
polypeptit, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính

8


chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit
amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.
1.3.2. Cấu trúc bậc hai
Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptit trong không gian. Chuỗi

Hình 1.3. Cấu trúc vòng xoắn α
1.2.3.2. Cấu trúc nếp gấp β
Trong dạng cấu trúc polypeptit này không có dạng xoắn ốc, thay vì thế, nó
có dạng zigzag hơn là xoắn α.

10


Các chuỗi polypeptit zigzag có thể được sắp xếp kế tiếp nhau tạo thành cấu
trúc một loạt các nếp gấp gọi là phiến (sheet); liên kết hiđro được tạo bởi các
đoạn kề nhau của chuỗi polypeptit. Các chuỗi polypeptit trong một phiến có thể
song song hoặc đối song (cùng hoặc ngược hướng amino – carboxyl tương ứng).
Cấu trúc này khá giống nhau, mặc dù đoạn lặp lại ở cấu trúc song song là ngắn
o

o

hơn (6.5 A , ở cấu trúc đối song là 7 A ) và kiểu liên kết hiđro khác nhau.
Phiến β song song ít xoắn hơn dạng đối song và luôn bị chôn vùi. Ngược
lại, phiến đối song có thể thấy sự xoắn rõ rệt hơn và dễ hòa tan hơn.

Hình 1.4. Cấu trúc nếp gấp β
1.3.3. Cấu trúc bậc ba
Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có
hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein.
Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức
năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R
trong các mạch polypeptit.
Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfua (-S-S-), nhóm
-R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định

- Các amino axit kiềm: trong cấu trúc có 2 nhóm NH2, trong đó một
nhóm tạo liên kết peptit còn một nhóm hình thành NH 3 .

Như vậy, phân tử protein vừa có khả năng phân ly như một axit tạo COOvừa có khả năng phân ly như một chất kiềm tạo NH 3 nên mang tính lưỡng tính.
1.4.2. Phản ứng màu
Protit cũng có phản ứng màu, như phản ứng biure, milon, xangtoproteit,
ninhidrin.
 Phản ứng biure: protein phản ứng với CuSO 4 trong môi trường kiềm cho
dung dịch màu xanh tím. Phản ứng Biure giúp nhận ra liên kết peptit.
 Phản ứng xangtoproteit: Protein phản ứng với HNO 3 đặc tạo ra kết tủa
màu vàng. Thực chất đây là phản ứng nitro hóa nhân thơm có trong protein như
phenylalanin, tyrosin, tryptophan.
 Phản ứng ninhidrin: protein tác dụng với dung dịch ninhidrin trong nước
cho dung dịch màu xanh. Phản ứng này đặc trung cho α-amino axit có trong
phân tử protein.

13


1.4.3. Tính tan
Tính tan của protit thay đổi phụ thuộc vào khối lượng phân tử, trật tự kết
hợp giữa các phân tử, tương tác giữa các phân tử, nhất là sự hình thành liên kết
hiđro và đisunfua và còn phụ thuộc vào dung môi, môi trường, nhiệt độ...
Các protein hình sợi như keratin (của móng, tóc, sừng), fibroin (của tơ tằm)
hoàn toàn không tan trong nước. Protein hình cầu của anbumin, globulin của sữa
và của máu có thể tan trong nước tạo thành dung dịch keo vì trên bề mặt phân tử
có nhiều nhóm nguyên tử phân cực tích điện, các phân tử lưỡng cực của nước bị
hấp thụ bởi các nhóm nguyên tử nêu trên, tạo thành màng nước bao quanh phân
tử protein gọi là lớp vỏ hiđrat hóa.
Tại điểm đẳng nhiệt protein tan kém nhất, nếu thêm axit hoặc kiềm có thể

- Các muối của kim loại nặng: HgCl2, CuSO4, (CH3COO)2Pb,
(CH3COO)2Zn.
- Các axit: HNO 3 , axit axetic, axit tricloaxetic.
- Các dung môi hữu cơ: Ancol etylic, axeton, ancol metylic.
Có hai loại kết tủa: Kết tủa thuận nghịch và kết tủa bất thuận nghịch.
Kết tủa thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây ra
kết tủa, protein lại tan trong nước tạo thành dung dịch keo như trước và vẫn giữ
nguyên tính chất của chúng. Kết tủa thuận nghịch không làm thay đổi tính chất
của protein.
Ví dụ như cho dung dịch (NH4)2SO4 vào dung dịch lòng trắng trứng sẽ xuất
hiện kết tủa bông của globulin. Khi loại bỏ (NH4)2SO4, kết tủa globulin lại tan
trở lại trong nước tạo thành dung dịch keo.
Kết tủa bất thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây
kết tủa, protein mất khả năng tạo dung dịch keo bền. Kết tủa bất thuận nghịch
làm thay đổi tính chất của protein.
Khi đun nóng trứng hoặc sữa, thì sau khi đun chúng không thể trở về dạng
đồng thể như ban đầu. Kết tủa bất thuận nghịch cũng xảy ra trong trường hợp có
mặt của muối kim loại nặng như Fe, Cu, Hg, Pb. Các tác nhân này thường làm
thay đổi lớp vỏ hiđrat hóa và lớp vỏ điện tích.

15


1.4.6. Hoạt tính sinh lý
Protein cũng như polypeptit có vai trò rất quan trọng và rất đa dạng trong
sự sống của sinh vật. Để đơn giản và vắn tắt, có thể nói vai trò chủ yếu của
protein là vai trò cấu trúc hóa. Chẳng hạn; α-keratin là cấu tử cấu trúc nên tóc,
da lông, móng. Collagen là nguyên liệu cấu thành các mô liên kết như xương,
sụn, gân. Fibroin là tơ của các mạng nhện và của kén…
Một số protein là nguồn dự trữ. Ovalbumin có bản chất làm nguồn thức ăn

Sự ổn định của protein phụ thuộc vào độ phân cực hay lực ion, pH, sự có
mặt hay vắng mặt của ion kim loại, sự oxy hóa, protease nội bào và nhiệt độ.
Thông dụng nhất là sử dụng giá trị pH sinh lý hoặc đệm Tris và phosphate. Các
ion Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ thường làm tăng sự ổn định của protein, trong khi
các ion kim loại nặng Ag  , Cu 2 , Pb 2 , Hg 2 thường làm biến tính protein, đặc
biệt protein chứa nhóm -SH.
Để tránh nhiễm bẩn bởi ion kim loại nặng, nên chuẩn bị đệm từ hóa chất
sạch trong dụng cụ thủy tinh hoặc dùng tác nhân EDTA 10 -4 M bổ sung vào
đệm. Để giảm thiểu tác động của quá trình oxy hóa (đặc biệt với các phân tử
protein chứa nhóm –SH) cần bổ sung thêm mecaptoetanol, cystein và
dithiotheitol 10-3 M vào đệm.

17


Để giảm thiểu tác động của protease nội bào cùng giải phóng cần bổ sung
chất ức chế protease như phenyl metyl sufonyl florua. Tốt nhất là dịch thô được
bảo quản ở nhiệt độ thấp.
2.3. Các phương pháp tủa protein
Có 5 phương pháp lắng tủa protein: tủa bằng muối, lắng tủa bằng dung môi
hữu cơ, lắng tủa điểm đẳng điện, lắng tủa bằng polyme không mang điện và lắng
tủa bằng các chất đa điện phân.
2.3.1. Tủa bằng muối Sunfat ở các nồng độ khác nhau.
Để tinh sạch protein ở mức độ phòng thí nghiệm, tủa bằng amonium sulfat
thường được sử dụng bước đầu trong quy trính tách chiết và tinh sạch protein. Ở
các nồng độ muối cao protein sẽ tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính.
Khi cho thêm muối vào protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion,
chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy các phân tử
protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Khi đủ một
lượng muối vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này được thực hiện

2.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch protein
Sau khi nhận được dịch tủa protein, công việc tiếp theo sẽ là chiết tách, tinh
sạch để nhận được các phân đoạn protein khác nhau.
2.4.1. Mục tiêu
Mục tiêu của quy trình tinh sạch là nhằm thu được một lượng protein tối
đa dựa trên lượng hoạt tính thu được so với hoạt tính tổng của protein trong dịch
chiết ban đầu. Hơn nữa sản phẩm protein nhận được cũng phải đạt hoạt tính tối
đa, có nghĩa là protein không bị mất hoạt tính trong quá trình bảo quản, không bị
phân giải, và độ tinh sạch cũng phải đạt tối đa, nghĩa là không có sự hiện diện
của các protein hay các đại phân tử sinh học khác.
Không có cách nào để dự đoán hoạt tính của một protein đã được tinh
sạch trong một số điều kiện nhất định nào đó, vì vậy quá trình tinh sạch được
tiến hành cho đến khi nào hoạt tính đặc hiệu của protein (Unit/mg) tăng đến một
giá trị không đổi sau một vài công đoạn của quy trình tinh sạch.

19


2.4.2. Sơ đồ tinh sạch protein
Sơ đồ chung cho quá trình tinh sạch protein có thể được biểu diễn như
sau:

Nguồn
(nguyên liệu)

a)

Nghiền
sơ bộ,
tách các

gồm: (a) Nguồn nguyên liệu, (b) Phương pháp nghiền, (c) Phương pháp tinh
sạch.

20


2.4.2. Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein.
Bảng 2.1. Các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein
Đặc tính
Phương pháp
Kích thước hay khối  Ly tâm
lượng
 Sắc ký lọc gel
 Thẩm tích, siêu ly tâm
Độ phân cực
(a) Điện tích
 Sắc ký trao đổi ion
 Sắc ký tập trung
 Điện di
 Điện di điểm đẳng điện
(b) Tính kỵ nước
 Sắc ký tương tác kỵ nước
Tính tan
 Thay đổi pH
 Thay đổi lực ion
 Thay đổi hằng số điện môi
Tâm bám đặc hiệu  Sắc ký ái lực hấp phụ
hay các tương tác  Sắc ký với ion kim loại cố định
cấu trúc đặc hiệu
trên giá thể

sạch khác nhau, cần phải xác định một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các
phương pháp tinh sạch và trình tự của các phương pháp này trong quy trình tinh
sạch. Trong thực tế cần phải nhấn mạnh rằng rất ít khi chỉ cần một hay phối hợp
của hai phương pháp mà có thể tinh sạch được protein. Quy trình tinh sạch cụ
thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
 Qui mô và hiệu suất tinh sạch.
 Thời gian cần thiết cho quá trình tinh sạch.
 Trang thiết bị hiện có.
Ngày nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thực sự có hiệu quả trong
việc làm sạch protein. Do đó, việc làm sạch protein thật sự chỉ có hiệu quả khi ta
21


biết lựa chọn các phương pháp riêng kết hợp với nhau, tạo ra phương pháp nối
tiếp nhau một cách hài hòa nhất.
2.4.4. Tinh sạch protein
Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein còn có chất cao phân tử khác
như polysaccharid, axit nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các
chất lipid, muối khoáng,...
Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử
lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay
đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết
hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng
của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối
trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di.
Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân
tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử
dụng ngay cho việc định lượng và định danh.
Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy

+ + -+
+ + -+
+- +
+
++ +
+ +

+-+
+
- +
+ +-

+- + +
+
+ +

+
++ +
+ +
+
++ +
+ +
+
++ +
+ +

-

+
++ +

+ +
-

Cân bằng

Nạp mẫu

Hấp thu mẫu

-

-

+
++ +
+ +
+
++ +
+ +

-+ ++ +
+ + -+
+ + -+
+- +
+
++ +
+ +

++
- + +

23


2.4.4.1.1. Kỹ thuật trong sắc ký trao đổi ion
 Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột
- Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột.
- Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa
và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra
những bọt khí nằm giữa các hạt nhựa.
- Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung
dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống.
- Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng cách cho dung dịch đệm
chảy qua cột, cuối cùng kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột.
 Nạp mẫu chất lên đầu cột
- Dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cột, lọc bằng tờ
giấy lọc hay ngang qua một lớp celite.
- Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa.
Điều quan trọng nhất là làm sao để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu
chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của
mẫu.
- Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát
mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại, dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu
cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột.
- Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa
2.4.4.2. Sắc ký lọc gel
Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cơ sở đặc điểm khác
nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước. Khác với trong kỹ thuật
sắc ký trao đổi ion, các hạt được sử dụng để nhồi cột trong kỹ thuật này không
mang các nhóm tích điện mà thay vào đó là mang các lỗ có kích thước khác
nhau. Các phân tử protein càng nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất