ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................d
MỞ ĐẦU......................................................................................................................1
Chương 1- TỔNG QUAN............................................................................................3
1.1. TY THỂ.............................................................................................................3
1.1.1. Hệ genome ty thể........................................................................................3
1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể...........................................................5
1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư.......................................................7
1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG....................................................................10
1.2.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng.........................................................10
1.2.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng.................................................11
1.2.3. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học..........................12
1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20]........................15
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG....16
1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể........................................................17
1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể....................................................18
1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh....21
1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nước.........................................................24
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..............................................26
2.1. NGUYÊN LIỆU..............................................................................................26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................26
2.1.2. Hóa chất....................................................................................................26
2.1.3. Thiết bị......................................................................................................27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................27
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô................................................................28
2.2.2. Khuếch đại đoạn gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR..29


2.2.3. Phân tích RFLP.........................................................................................30
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn.32
2.2.5. Tinh sạch ADN.........................................................................................35


bp

Base pair (cặp bazơ)

CPEO

Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ
ngoài tiến triển mãn)

cs

Cộng sự

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

KSS

Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre)

LHON

Leber hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác

PCR

Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism
(Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn)

ROS

Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

a


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

TBE




Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]............................................................4
Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]..........................................6
Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19]........................9
Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76]..........................................................................11
Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77]..............................15
Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59]......................................17
Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô..........................................37
Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243..................................................37
Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII............................39
Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398..............................................40
Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI...........................42
Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G........................43
Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN
chuẩn của ty thể..........................................................................................................44
Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G...................................44
Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty
thể................................................................................................................................45
Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô......................................48
Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính......................................49
Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi.............................................49
Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u.................................50
Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thước u...............................51
Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch.......................................52

giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới.
Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm
khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thư đại trực
tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường
tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày. Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh
nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày
nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể,

1


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng”
với mục đích:
− Phát hiện đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân
ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
− Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty
thể với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở người
Việt Nam.
Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2

Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng
riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ,
có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số

3


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng trong mô [60]. Hệ
gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không
mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc
mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen
ty thể không tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố
quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi
vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi
polypeptide được mã hóa trong ty thể [41].

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75].
Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có intron, không có histon bảo vệ,
lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra
trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN
ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51]. Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên
phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến,
tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy). ADN ty thể có thể ở dạng
đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là như nhau.
Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện



Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]
Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở người
được phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc
đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra, nhiều đột
biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một người có
thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57]. Các nghiên cứu cho thấy đột
biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột
biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới
các bệnh ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và
ngoại biên. Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]:
Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm
gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,
G11778A và T14484C. Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô
hấp. Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác

6


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

chung giảm kèm chứng loạn màu sắc.
Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột

Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

protein nội bào. Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố
gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51]. Đột biến ADN ty thể
có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển
điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận
chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa. Khi chuỗi vận chuyển điện
tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS,
làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa
protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào. Như vậy biến đổi của hệ gen ty
thể có liên quan đến bệnh ung thư [27]. Một số đột biến ADN ty thể đã được xác
định trong nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư vú, đại trực tràng, buồng
trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở
vùng ghi mã và vùng không ghi mã [19] (hình 3). Cho đến nay nhiều dạng biến đổi
ADN ty thể đã được xác định trong ung thư. Các biến đổi này bao gồm: đột biến
điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao ADN ty
thể.

8


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19]
Đột biến điểm
Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú, Tan và cs (2002) đã giải

Thêm đoạn
Wu và cs đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp)
trong vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của 1 bệnh nhân ung thư dạ
dày [72]. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung
thư. Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung
thư đại trực tràng [44]. Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác
định thấy ở bệnh ung thư vú [63], ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng
trứng [69]. Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung
thư.
Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể
phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong
vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy. Mặt
khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl
hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, như là một cách để đáp ứng lại sự mất
chức năng của ty thể [38].
1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.2.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng hay còn gọi là ung thư ruột kết (colon cancer) bao gồm
ung thư đại tràng và ung thư trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao
gồm các đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang (transverse colon) và đoạn
xuống (descending colon). Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối
giữa đại tràng và hậu môn (hình 4). Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại
tràng và trực tràng, thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể

10


Luận văn Cao học

lại cho rằng nguy cơ mắc ung thư trực tràng tăng lên ở một số gia đình nhiều thành
viên là do ảnh hưởng của dạng polyp không phải khối u [33]. Các nhà khoa học chỉ ra
rằng có rất nhiều nguyên nhân hình thành ung thư đại trực tràng và tất cả đều dẫn đến
việc biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống
kê cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này đó là:
− Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thư, bất hoạt các gen ức chế khối
u, sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền gia đình.
− Yếu tố không di truyền: các tác nhân vật lí, hóa học; quá trình lão hóa, chế
độ ăn uống ít xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá
thường xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng,
gây viêm loét đại tràng.
Ngoài 2 nhóm nguyên nhân chính trên còn có các nguyên nhân khác như tuổi,
giới tính, chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng
[33].
1.2.3. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học
Theo phân loại mô học của Tổ chức Y tế thế giới năm 2000, các u biểu mô đại
trực tràng gồm các dạng: u tuyến, ung thư biểu mô, carcinoid (u nội tiết biệt hóa
cao), ung thư biểu mô tuyến – carcinoid kết hợp. Ngoài ra, một số dạng hiếm gặp
khác như sacom (gồm các sacom cơ trơn, sacom mạch máu, sacom mỡ với tổn
thương dạng khối lớn), u hắc tố ác tính, ung thư biểu mô tế bào hình thoi (xuất hiện
riêng lẻ hay kết hợp với ung thư biểu mô tuyến hoặc ung thư biểu mô vảy và được
gọi là ung thư biểu mô – sacom), ung thư biểu mô tế bào sáng (xuất hiện riêng lẻ hay
kết hợp với một loại khác của ung thư đại trực tràng), ung thư biểu mô vảy đơn
thuần…Trong các dạng này thì ung thư biểu mô tuyến là dạng rất hay gặp, chiếm
đến 95% trong tổng số các dạng ung thư đại trực tràng. Đây là dạng ung thư xuất
phát từ niêm mạc ruột với tổn thương ban đầu có dạng nốt nhỏ, gồ cao, khi có phát

12



13


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

quanh đại tràng và trực tràng không có phúc mạc
T4 – U xâm nhập trực tiếp các cơ quan khác hoặc cấu trúc và/ hoặc gây thủng phúc mạc
tạng
N – Hạch lympho
Nx – Hạch bạch huyết vùng không được đánh giá
N0 – Không di căn hạch bạch huyết vùng
N1 – Di căn 1 đến 3 hạch bạch huyết vùng
N2 – Di căn 4 đến nhiều hơn hạch bạch huyết vùng
M – Di căn xa
Mx – Di căn xa không được đánh giá
M0 – Không có di căn xa
M1 – Di căn xa

Nói chung, ung thư đại trực tràng được chia làm các giai đoạn (hình 5) [29]:
• Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thường được tìm thấy trong các lớp
trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thường có thể trở thành ung thư và
lây lan vào các mô bình thường gần đó. Giai đoạn 0 cũng được gọi là ung thư biểu
mô tại chỗ.
• Giai đoạn I: Ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên trong.
• Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc trực
tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.
• Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến những
phần xa của cơ thể.

Giai đoạn II−A
Giai đoạn II−B
Giai đoạn III−A
Giai đoạn III−B
Giai đoạn III−C
Giai đoạn IV

TNM
Tis N0 M0
T1−2N0M0
T3N0M0
T4N0M0
T1−2N1M0
T3−4N1M0
T bất kỳ, N2M0
T bất kỳ, N bất kỳ, M1

Khả năng sống sót sau 5 năm
100%
80−95%
72−75%
65−66%
55−60%
35−42%
25−27%
0−7%

1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20]
Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các kỹ
thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đoán, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi

27%, khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa mô thường và mô bệnh [49].
Alonso và cs (1997) xác định sự có mặt của đột biến ADN ty thể (23%) trên
vùng D-Loop. Những đột biến này là đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp,
và đột biến thêm 2 bp [9]. Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên
cứu về đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thấy rằng
88,6% đột biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin (A, G) hoặc giữa các
pyrimidine (C, T), 11,4% còn lại là đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một
purin với một pyrimidine). Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA.
60% đột biến nằm trên các gen mã hóa cho protein, trong đó 85% số đột biến này
làm thay đổi acid amin [56]. Trong luận văn này chúng tôi muốn đi sâu vào đột biến

16