TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

“Nghiên cứu tạo sunfate beta-glucan từ nấm mem
saccharomyces serevisae làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều
trị ung thư”
Sinh viên thực hiện
Ngành
Giảng viên hướng dẫn

: Trần Thị Hồng
: Công nghệ sinh học
: TS. Lã Thị Huyền
Trưởng phòng công nghệ TB động vật
Viện Công nghệ sinh học
TS. Nguyễn Hữu Đức
Khoa Công nghệ sinh học
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

“Khóa luận đệ trình khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông
nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ
sinh học, năm học 2015 – 2016.”

HÀ NỘI, 2016
1


nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
ThS. Nguyễn Thị Hạnh, kĩ thuật viên phòng Công nghệ TB động vật – Viện Công
nghệ sinh học, người cô, người chị đã trực tiếp hướng dẫn, luôn theo sát thí
nghiệm của tôi để đưa ra những lời khuyên bổ íchvà các cán bộ phòng Công nghệ
tế bào thực vật đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về chuyên môn.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Đức – Phó
trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học động vật –
Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã luôn bên
cạnh, chỉ bảo, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa
luận.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh học,
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá
trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ và toàn thể những
người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích tôi
trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Trần Thị Hồng




Phần I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

công bố một phát minh sáng chế số CN102633903A nêu ra một phương pháp khác
tạo sulfate beta-glucan.
Nhận thấy đây là một hướng đi hoàn toàn mới ở Việt Nam và có khả năng ứng
dụng rất cao nên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tạo sunfate beta-glucan từ nấm mem saccharomyces serevisae
làm nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư”

1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu.
1.2.1. Mục đích
- Tách chiết thành công beta-glucan từ thành tế bào nấm men bia
- Tạo thành công sunfate beta-glucan từ beta-glucan, đồng thời tìm phương
-

pháp xác định hàm lượng sunfate hóa sau phản ứng.
Kiểm tra sự tác động của sunfate beta-glucan tới sự phát triển của tế bào
ung thu nhằm góp phần tạo nguồn nguyên liệu cho điều trị ung thư hiện
nay.

1.2.2. Nội dung
- Tách chiết hợp chất beta-glucan từ nấm men bia sacchromyces serevise.
- Sunfate hóa beta-glucan tạo sunfate beta-glucan.
- Nuôi cấy tế bào ung thư dạ dày, ung thư vú
- Bổ sung hợp chất sunfate beta-glucan với các nồng độ khác nhau vào môi
trường nuôi cấy tế bào ung thư để theo dõi sự tác động.

Phần II. Tổng quan tài liệu


2.1. Giới thiệu về chủng nấm men sacchromyces cerevisiae.
2.1.1. Định nghĩa

Căn cứ vào vị trí của H và OH ở C bất đối mang số thứ tự lớn nhất (nhóm
OH ở bên tay phải là cấu hình D). Các đường D-glucose trong dung dịch
chúng tồn tại chủ yếu là cấu trúc vòng, cấu trúc này hình thành do phản ứng
giữa nhóm aldehyt (C-1) với nhóm OH ở vị trí C5 tạo thành vòng 6 cạnh.
Khi tạo vòng, ở vị trí C-1 của glucose có thêm 1 nhóm OH, gọi là OH
glucosid, C này trở thành cacbon bất đối, do đó có thêm 2 đồng phân mới là
α và β. Gọi là α nếu OH-glucosid ở phía dưới vòng (cùng phía với OH của
C-5), gọi là β nếu OH-glucosid ở phía trên vòng (khác phía với OH của C5) (Hình 2). Nhóm OH-β-glucosid của C-1 kết hợp với OH của các C-3/C4/C-6 ở phân tử β-D-glucose khác tạo nên các liên kết β-D-1,3/1,4/1,6glycosid (Hình 3).

Hình 2. Cấu trúc của các dạng đồng phân Glucose


A

B
Hình 3. Cấu tạo của β-glucan
A: Cấu tạo của các (1,3/1,4) β-Glucan, các glucan này tìm thấy ở vỏ ngũ cốc, lúa
mỳ, yến mạch. B: Cấu tạo của các (1,3/1,6) β-Glucan, loại glucan này có nhiều ở
nấm men và các loại nấm ăn.

Hình 4. Các dạng cấu trúc khác nhau của β-glucan
Hình 4. Tổng hợp các dạng cấu trúc glucan khác nhau: bao gồm β-(1,3)-D-glucan
mạch thẳng, β-(1,3;1,4)-D-glucan mạch thẳng, mạch nhánh β-(1,3;1,2)-D-glucan,
mạch nhánh β-(1,4;1,6)-D-glucan, mạch nhánh β-(1,3;1,6)-D-glucan, mạch nhánh


trên nhánh β-(1,3;1,6)-D-glucan, β-(1,2)-D-glucan mạch vòng, β-(1,3;1,6)-Dglucan mạch vòng (Laura Barsanti et al., 2011). Beta glucan từ nấm men và các
nấm dược liệu được chú ý vì khả năng kích thích tăng cường miễn dịch của chúng.
2.2.2. Cấu tạo và chức năng của β-glucan thành tế bào nấm men
a. Cấu tạo của hợp chất beta-glucan.

nhiều quy trình công nghệ tách chiết khác nhau. Do β-glucan định vị ở thành tế
bào nấm men nên để tách chiết β-glucan bước đầu tiên cần phải ly giải tế bào để
tách phần thành tế bào không hòa tan khỏi tế bào chất; bước thứ hai là tách chiết
β-glucan từ thành tế bào không hòa tan. Có một vài phương pháp để phân giải tế
bào nấm men bao gồm phương pháp hóa học, vật lý và phương pháp sử dụng
enzyme. Các chất hóa học thường được sử dụng là NaOH, HCl, acetic acid, citric
acid… Hầu hết các trường hợp sử dụng chất hóa học đều được xử lý ở nhiệt độ
cao (Pelizon et al., 2005; Hunter et al., 2002). Phương pháp vật lý được sử dụng là
siêu âm, đồng nhất với áp suất cao… (Shokri et al., 2008; Boonraeng et al.,
2000). Nhóm phương pháp cuối cùng để phá hủy tế bào nấm men là sử dụng
enzyme tự nhiên, các enzyme phá hủy thành tế bào nấm men, vì vậy mà phần hòa
tan của tế bào chất sẽ chui qua các lỗ hổng trên bề mặt tế bào. Phương pháp sử
dụng enzyme được chia làm 2 nhóm: thứ nhất là tự phân giải thông qua hoạt động
của enzyme nội sinh, quá trình này là sự thủy phân của các polymer sinh học nội
bào dưới tác dụng của các enzyme thủy phân liên quan đến sự chết của tế bào. Quá
trình tự phân giải được bắt đầu khi các lysosome giải phóng enzyme phân cắt vào
tế bào chất, và kéo dài trong vài ngày (Vosti et al., 1954). Thứ hai là dùng các vi
sinh vật có khả năng sử dụng polymer sinh học của thành tế bào nấm men như là
nguồn cung cấp dinh dưỡng, đồng thời chúng cũng sản xuất ra các enzyme để
đồng hóa thành tế bào nấm men (Ferrer, 2006; Adamisch et al., 2003). Arturas
Javmen và cộng sự (2012) đã sử dụng dịch nuôi cấy của chủng Actinomyces


rutgersensis 88 tạo ra phức hợp các enzyme để phân giải thành tế bào. Trong dịch
nuôi cấy Actinomyces rutgersensis 88 có các enzymes laminarinase (β-1,3),
licheninase (β-1,3; 1,4), gentibiosinase (β-1,6), β-glucanase (β-1,3; 1,6),
mannanase (α-1,6; 1,2; 1,3), galactomannanase (β-1,4), chitinase (β-1,4),
proteinase (-CO-NH-) (Гуреева, 1983).
Cụ thể, Hojjatollah Shokri và cộng sự (2008) đã phát triển một quy trình tối
ưu để tách chiết và tinh chế beta-glucan. Lúc đầu, các tế bào nấm men đã được

Beta glucan được phân tách từ các tế bào Saccharomyces cerevisiae như trên đã
trình bày chúng có rất nhiều tác dụng có lợi trong việc điều trị các bệnh do vi
khuẩn, virus và nấm gây ra. Glucan cũng đã được chứng minh có khả năng điều
hòa miễn dịch và thay đổi sự tiến triển của bệnh ung thư thực nghiệm. Những
quan sát này đã kích thích nghiên cứu các ứng dụng y sinh học tiềm năng của
polymer beta glucan. Một trở ngại lớn cho việc sử dụng lâm sàng của beta glucan
là khả năng hòa tan trong nước. Các hạt beta glucan từ nấm men không hòa tan
trong nước. Do đó năm 1991, William D.L và cộng sự đã công bố một phương
pháp phosphoryl hóa glucan tạo ra glucan hòa tan trong nước với hiệu suất gắn
nhóm phosphate 70%. Năm 1992, chính ông đã công bố trên tạp chí
Carbonhydrate research về phương pháp tạo sulfate glucan hòa tan với hiệu suất
đạt 98%. Sau đó rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của sulfate glucan áp
dụng phương pháp tạo sulfate glucan của Williams (được liệt kê dưới đây). Năm
2012, các nhà khoa học Trung Quốc công bố một phát minh sáng chế số
CN102633903A nêu ra một phương pháp khác tạo sulfate beta-glucan.
Vậy sulfate glucan là gì và có tác dụng như thế nào?
Sulfate beta-glucan là các (1,3/1,6)-β-D-glucan được gắn thêm nhóm sulfate vào
các vị trí C2, C4, C6 (Hình 6). Sau khi gắn nhóm sulfate chúng trở nên hòa tan
trong nước và thể hiện các hoạt tính riêng.


Hình 6. Cấu trúc của β-glucantrong thành tế bào nấm men (Godfrey C.C. et al.,
2009)
2.3.2. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của sulfate betaglucan
a. Hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng huyết khối
Sulfate beta-glucan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính
chống đông máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất.Hoạt tính chống huyết khối
của sulfate beta-glucan cũng đã được thử nghiệm in vivo theo mô hình nghẽn tĩnh
mạch và động mạch ở động vật thí nghiệm (Alban S và cộng sự, 1995). Sulfate
-1,3-glucan thể hiện hoạt tính chống đông máu thấp hơn heparin trên một số thử

thử nghiệm in vitro của sulfate (1,3)-β-D-glucan đã được nghiên cứu. (1,3)-β-Dglucan, được sulfate bởi acid piperidin-N-sulfonic trong dimethyl sulfoxide cho
sulfate (1,3)-β-D-glucan với nhiều kích thước phân tử và các nhóm lưu huỳnh
khác nhau. Sulfate (1,3)-β-D-glucan với hàm lượng lưu huỳnh trong 14,4% ức chế
hoàn toàn việc lây nhiễm HIV trong một nồng độ thuốc thấp 3,3 µg/ml. Nhóm
sulfate được đưa vào vị trí C6, C4 và C2 tương ứng. Đây là một trong những
polysaccharide chống virus AIDS mạnh nhất (Takashi Yoshida và cộng sự, 1990).


Ngoài ra, sulfate beta-glucan có khả năng ức chế sinh sản của virus H1N1 SIV và
hoạt động của neuraminidase(Sun Ying-feng và cộng sự, 2015)
c. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch
Hoạt tính kháng u của nhiều polysacaride đã được công bố trong những năm gần
đây. Những thử nghiệm in vitro và in vivo đối với sulfate (1,3)-beta-D-glucan của
Poria cocos cho thấy dẫn xuất này có tác dụng chống u báng 180 (S-180) và làm
biến dạng tế bào ung thư biểu mô dạ dày (MKN-45 và SGC-7901), trong khi tác
dụng kháng u này không xuất hiện ở (1,3)-beta-D-glucan tự nhiên (Wang Y và
cộng sự, 2004). Sulfate glucan có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB231 ngăn kết dính với các tiểu cầu, tác dụng này có ý nghĩa quan trọng trong quá
trình di căn khối u.
Khả năng phục hồi các chức năng miễn dịch của sulfate glucan đã được thử
nghiệm in vivo. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sulfate glucan từ S.cerevisia có thể
kích thích sự tăng sinh tủy xương của chuột sau khi tiêm tĩnh mạch (Williams DL
và cộng sự, 1992). Ngoài rasulfate glucanở liều thích hợp có thể thúc đẩy đáng kể
các tế bào lympho tăng sinh, tăng cường kháng thể, làm tăng khả năng sản xuất
interleukin-2 (IL-2) và interferon-γ (IFN-γ) trong huyết thanh gà, cải thiện đáng kể
hiệu quả miễn dịch của vắc-xin, phòng bệnh Newcastle, và sẽ là ứng cử viên
chocác tá dược miễn dịch (Mi Wang và cộng sự, 2014). Sulfate glucantăng cường
các chức năng của tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào, tế bào giết tự nhiên
(NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại với tế bào hồng cầu máu
cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo.
d. Hoạt tính chống oxy hóa

pyroli (một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày), bảo vệ tế bào gan và ức chế sự
tăng sinh tế bào gan hình sao.
Những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số lượng lớn bằng
chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của Sulfate beta-glucan, Nghiên cứu về
hoạt tính sinh học của Sulfate beta-glucan đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho


ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm
chức năng, dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác
dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ
dày, tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, sản phẩm thuốc
kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch… Như vậy có thể thấy, Sulfate
betaglucan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng
hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự
quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới.

2.2.3. Phương pháp tạo sunfate beta-glucan từ beta-glucan nấm men
Phương pháp của D.L. Wiliams 1991, quá trình tạo sulfate glucan hòa tan đã được
chuẩn bị như sau: 2,4 g của vi hạt glucans nấm men được hòa tan trong 200 ml
dimethyl sulfoxide (DMSO) chứa 6 M urea. 32 ml axit sulfuric đậm đặc được nhỏ
dần dần vào dung dịch.Dung dịch được đun nóng đến 100 ° C trong 6 h. Một tinh
thể kết tủa (ammonium sulfate?) hình thành ở 90 phút. Sau đó, dung dịch được
làm lạnh đến nhiệt độ môi trường xung quanh và pha loãng trong 4 l nước tinh
khiết, Pyrogen-miễn phí, nước khử ion thu được từ một hệ thống lọc nước
(Millipore, Bedford, MA).


Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm thực tập
Thời gian