Header Page 1 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

M CL C
DANH M C T

VI T T T

DANH M C B NG BI U
DANH M C HÌNH VẼ
M

Đ U …………………………………………………………………..

Ch

ng 1 - T NG QUAN ……………………………………………….

1.1. Giới thi u chung v sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)………
1.1.1. Cấu trúc phân tử …………………………………………………..
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học c a các Sulfamit, Metronidazole ………….
1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng c a Sulfamit, Metronidazole ...........
1.1.4. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn c a Sulfamit, Metronidazole ..........
1.1.5. Một số chế phẩm c a Sulfamit tiêu biểu ………..………………...
1.2. Ph

ng pháp xác định……………………………………………….



Footer Page 1 of 148.

1


Header Page 2 of 148.

Luận văn Thạc sĩ
2.2.2.

Bùi Minh Thái

Phân tích định lượng bằng HPLC …………………………

2.3.

Giới thi u chung v ph

ng pháp chi t pha r n ….………….

2.4.

Hóa ch t và d ng c ……………………………………………..

2.4.1.

Hoá chất …………………………………………………

2.4.2.

Footer Page 2 of 148.

2


Header Page 3 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

DANH M C T

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Footer Page 3 of 148.

VI T T T

Viết tắt



Hấp phụ pha đ o

LOD

Limit of Detection

Giới h n phát hiện

LOQ

Limit of Quantity

Giới h n định lượng
Thông tư

TT
UV - Vis

Untraviolet - Visibet

3

Tử ngo i – Kh kiến


Header Page 4 of 148.

Luận văn Thạc sĩ



33-34

B ng 3.6:

Diện tích pic c a các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động....

36

B ng 3.7:

Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ các chất phân tích………

38-39

B ng 3.8:

B ng giá trị các Ftính c a các chất phân tích............................................

42

B ng 3.9:

LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy ..........................................

43

B ng 3.10: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm)

45


54

B ng 3.19: Kết qu phân tích các chất đối với mẫu tôm sú……………………...

55

B ng 3.20: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm sú……………………

55

Footer Page 4 of 148.

4


Header Page 5 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

B ng 3.21: Kết qu phân tích các chất đối với mẫu tôm lớt…………………….

56

B ng 3.22: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm lớt……………………….

57


26-27

Hình 3.4: Sự phụ thuộc c a k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha động……

29

Hình 3.5: Píc sắc ký các giá trị nồng độ đệm khác nhau...................................

29-30

Hình 3.6: Sự phụ thuộc c a K’ vào pH c a pha động..........................................

31

Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký pH khác nhau...............................................................

32

Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN trong pha động...............................

34

Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký t i các tỉ lệ thành phần pha động khác nhau...........

34-35

Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động.......................

36


48

Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tôm.............................................................................

49

Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm........................

50

Footer Page 6 of 148.

6


Header Page 7 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Hình 3.21: Đư ng chuẩn SGU trong mẫu tôm r o khi phân tích thêm chuẩn….

53

Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm r o………

53

Hình 3.23: Đư ng chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng khi phân tích thêm chuẩn..

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

M

Đ U

Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ng i c a hầu hết
các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số lo i kháng sinh thông thư ng
(chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) b n thân nó có thể gây ra tác
động có h i cho s c khoẻ ngư i tiêu dùng, một số lo i khác như các kháng sinh
nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra
những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit
(SAs) là nhóm kháng khuẩn có ho t phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi
trồng, chế biến nông th y s n, v.v..
Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn
quá giới h n cho phép trong cơ thể động vật. Khi ngư i tiêu dùng sử dụng thực
phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong th i gian dài gây ra
một lo t các ph n ng như rối lo n đư ng tiết niệu, rối lo n t o máu, rối lo n
chuyển hóa porphyrin. Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất
kháng sinh trong th c ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong s n phẩm từ động vật là rất
quan trọng.
Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên c u các
điều kiện tách và xác định đồng th i chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit
như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis,
phương pháp này có độ chọn lọc, độ nh y tốt và được trang bị
nghiệm c a nước ta, có tính kh thi và ng dụng vào thực tế cao.


Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi
khuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh. MTD là một trong những thành phần có mặt
trong th c ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng th y s n (với tên thương
m i là Enro DC).
1.1.3. Tính ch t v t lý và hoá học c a các Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.2.1. Tính chất vật lý
SAs

d ng tinh thể màu trắng hoặc vàng nh t, không mùi, thư ng ít tan trong

nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin).

Footer Page 9 of 148.

9


Header Page 10 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không khí,
sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng ch y

kho ng 159oC – 163oC.

Metronidazol khó tan trong nước, aceton.
1.1.2.2. Tính chất hoá học

H

R

Na

- SAs t o muối ph c kết t a với ion Ag+, và t o ph c màu kết t a với ion Cu2+,
Co2+, …
nhóm amin bậc một c a SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực hiện ph n

-

ng t o ph c chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho ph c màu tím có bước
sóng hấp thụ cực đ i

270-273 nm.

- Nhóm amin thơm tự do cho ph n

ng diazo hoá, rồi ngưng tụ với

n phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ

bước sóng 460nm.

Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O
Muối diazoni
đây, Ar – là thành phần -C6H5-SO2NH-R1 c a phân tử SAs.
Nh thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng.


C. difficile và C. perfringens),

Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus. Nó là hiệu qu đối với B. fragilis
phân lập kháng với clindamycin..
Metronidazole cũng có những ho t động c chế miễn dịch và kháng viêm, và
nó đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea. Các ho t động kháng
khuẩn c a metronidazole làm thay đổi trao đổi chất c a vi khuẩn acid mật trong
đư ng ruột, gi m ng a những bệnh nhân bị mật th cấp đến xơ gan mật tiền phát.
1.1.7. C ch tác d ng kháng khuẩn c a Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.4.1. Cơ chế kháng khuẩn của SAs
-

c chế enzym chuyển hóa acid folic

Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị
tố tốt hơn dị vòng 1 dị tố. Ví dụ: sulfamethoxazol: c chế enzym dihydrofolat
synthetase nên ngăn chặn giai đo n chuyển acid folic thành axit hydrofolic.
- Ngăn c n tổng hợp axít folic c a vi khuẩn

Footer Page 11 of 148.

11


Header Page 12 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái



pterin
pteoryl

Acid folic (acid pteoryl glutamic)
Acid Dihydrofolic

Dihydrofolat syntetase
(enzy m)
Dihydrofolat sreductase
(enzy m)

Acid Tetrahydrofolic
Nucleoprp tein

Acid folinic

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein
Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự c nh tranh vào vị trí
c a A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợp
axít này. Khi nồng độ đ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí c a A.PAB làm cho việc
tổng hợp axít folic bị gián đo n, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ
ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng

máu trong

suốt th i gian dùng SAs.
SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình d ng, kích thước và nhóm
ch c hoá học:
o


Footer Page 12 of 148.

Sulfamit

12


Header Page 13 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic có
sẵn trong môi trư ng thì không bị SAs tác dụng. Tế bào c a ngư i và động vật lấy
axít folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B9), nên không bị
nh hư ng b i SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc
trên vi khuẩn.
H

H

N

(-)
N

S
O

Metronidazole làm gi m b i pyruvat : ferredoxin(protein ch a sắt chuyển các điện
tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác ph n ng oxy hóa- khử) trong ty thể c a vi
khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học c a nó.
Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thư ng t o ra ATP qua decarboxylation
oxy hóa c a pyruvate. Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro c a nó ho t động
như một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thư ng được chuyển giao cho các ion
hydro trong chu kỳ này. Tác dụng làm suy gi m c a metronidazole thúc đẩy hình
thành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc h i đối với tế bào.

Footer Page 13 of 148.

13


Header Page 14 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

- Gi m tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độc
tương tác với DNA ch , dẫn đến vỡ sợi DNA và phá h y chuỗi AND.
- Sự phá vỡ c a các s n phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trung
gian độc h i phân h y thành s n phẩm cuối cùng không ho t động.
1.1.8. Một s ch phẩm c a Sulfamit tiêu bi u [3;6; 9]
Như ta đã biết, các SAs có c một họ gồm hàng nghìn chất, với những tính
chất và công dụng khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ được
nghiên c u trong luận văn này.
1.1.8.1. Sulfaguanidin (SGU)
Công thức:

H 2N

Footer Page 14 of 148.

14

N

OCH 3


Header Page 15 of 148.

Luận văn Thạc sĩ
Tính chất: SMP

Bùi Minh Thái
d ng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà, dưới tác dụng

c a ánh sáng sẽ bị sẫm màu, nâu dần; có vị đắng; rất ít tan trong nước, tan trong
kiềm và axít vô cơ loãng. Nhiệt độ nóng ch y c a dẫn chất axetyl hoá là 228 –
229oC.
SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ

ruột

nhanh hơn, nhiều hơn và đào th i rất chậm nên đ t được nồng độ cao trong máu,
đồng th i duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài. Vì vậy
dùng liều thấp hơn, ít nguy cơ kết tinh


1.1.5.4. Sulfamethoxazol (SMX)
Công thức:
O
O

O

CH3

S
NH
H2N

Footer Page 15 of 148.

15

N


Header Page 16 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Tính chất: SMX d ng bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà. Thực tế không tan
trong nước, khó tan trong ete, hơi tan trong ethanol 96o, dễ tan trong axeton, tan
trong các dung dịch hydroxyt kim lo i kiềm loãng. Nhiệt độ nóng ch y là 169 172oC.
SMX có tính kháng khuẩn m nh, đã được làm thuốc điều trị sốt rét phối hợp


Footer Page 16 of 148.

16


Header Page 17 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác định
hàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone
sulfadimethoxin và sulfa-chinoxalin) trong s n phẩm th y s n bằng HPLC- detector
huỳnh quang. Điều kiện ch y sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil 250×3mm
100-5 C18 AB. Chương trình pha động (gồm: dung dịch H3PO4 0,02M và hỗn hợp
metanol- axcetonitril tỷ lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H3PO4 và đến 45 phút 45 %
H3PO4, tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Thể tích mẫu tiêm 10 l. Bước sóng kích thích
405nm, bước sóng phát x 495nm. Phương pháp xử lý mẫu này cho hiệu suất thu
hồi nằm trong kho ng 60-70 %, với giới h n phát hiện nhỏ hơn 5

g/kg.

Năm 2010 Cheong và cộng sự[12] đã xác định dư lượng 4 SAs (Sulfadiazine
(SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) và Sulfaquinoxaline(SQX))
trong gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đ o, detector UV t i bước sóng
266nm. Điều kiện ch y sắc ký như sau: cột C18 (5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm). Kênh
A: amoni axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6). Kênh B: ACN. Sử dụng gariend pha
động như sau: ban đầu 95% A- 5%B, sau 18phút: 67%A -37%B, sau 23 phút95%

sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono-methoxin, sulfachlorpyridazin, sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin). Điều kiện
ch y sắc ký: Cột C8 (250mm × 3mm, 5 m). Pha động là axetonitril (A) và dung
dịch đệm axetat pH = 4,5(B), ch y gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút 41%
B, tốc độ pha động 0,4 ml/phút. Detector DAD đặt 270nm. Chuẩn bị mẫu: Cân 10g
mẫu bắp thịt đã được nghiền đồng thể vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào đó 10g
Na2SO4 khan và 20ml etyl axetat lắc đều trong 15 phút. Đem ly tâm với tốc độ 3000
vòng/phút trong 10 phút. Pha hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml. Quá trình
chiết như vậy được lặp l i lần hai. Kết hợp hai phần chiết l i đem cô c n bằng hút
chân không. Sau đó đem pha trong 40ml etyl axetat. Chiết pha rắn: Cột Speedisk
được ho t hoá bằng 2×3ml n-hexan và 2×4ml etyl axetat. Sau khi bơm mẫu vào cột
được rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol, rửa gi i bằng 20ml hỗn hợp
metanol/amoniac (tỷ lệ 97,5/2,5 về thể tích). Dung dịch thu được làm khô trong
điều kiện chân không, rồi hoà tan trong 1ml dung dịch đệm axetat pH = 4,5 với
0,1% metanol. Lọc qua catridge 0,45 và 0,2 l trước khi bơm vào máy HPLC.
Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55-92%, với giới h n phát
hiện 0,05

g/kg.

W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC - DAD để xác
định đồng th i mư i hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin,
sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorp
yrazin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận c a lợn, gà...
Điều kiện ch y sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C8 (250 ×
2mm, kích thước h t nhồi 5 m). Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) và
axetonitril (B), ch y gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ pha động

Footer Page 18 of 148.

18

trong 15 phút. Cuối cùng, lặp l i điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong 15phút,
tốc độ 0,5ml/phút. Chất dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan trong
ethanol 2% 0,7M H3PO4) được thêm b i bơm nhu động t i tốc độ 0,25ml/phút.
Chúng được trộn lẫn và ph n ng trong cuộn PTFE (2,5

0,8 I.D)

40oC. Đư ng

chuẩn c a sulphamethoxazole từ 0,01 -2 µg/ml, các sulfamit còn l i 0,02 -2 µg/ml.
Craig D.C. Salisbury, Jason C.Sweet, Roger Munro[13]sử dụng phương pháp
HPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để xác định dư lượng sulfamit
(sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline,
sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole) trong mô lợn, gan bò, cừu
,ngựa , thịt gà, gan cá, th c ăn chăn nuôi. Mẫu trích được b o qu n trong đệm pH

Footer Page 19 of 148.

19


Header Page 20 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

3,0-ACN (60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine. Các chất dẫn
xuất sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử dụng cột C18 với pha động: acid
phosphoric 0,02M-ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang (Eex = 405 nm;

Footer Page 20 of 148.

20


Header Page 21 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

Năm 2007 Naser Tavakoli[20]và cộng sự cũng đã sử dụng HPLC để xác
định đồng th i metronidazole và amoxicillin. Điều kiện sắc ký: cột C18, pha động
pH =4, phát hiện b i detector UV t i bước sóng 254nm. Kho ng tuyến tính c a
amoxicillin 0,15- 600(mg/ml); metronidazole 0,13 -300mg/ml. Giới h n phát hiện
c a amoxicillin (LOD:0,05mg/ml,LOQ:0,15mg/ml);metronidazole(LOD: 0,1mg/ml,
LOQ:0,13mg/ml).
Cũng vào năm đó Han-Wen Sun[17] đã xác định đồng th i dư lượng 7
nitroimidazole:metronidazolenext,ronidazole, dimetridazole, tinidazole, Ornidazole,
secnidazole và các chất chuyển hóa chung c a ronidazole và hydroxydimetridazole
trong thịt bằng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện tách: cột silica C18, pha động
H2O- ACN, detector UV phát hiện t i bước sóng 300nm. Hiệu suất thu hồi cho các
mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4-99,5%. Kho ng tuyến tính từ 0,7 60mg/kg. Độ lệch chuẩn tương đối c a 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn và
thịt xông khói tăng,

nồng độ 1mg/kg : 6,2-13,9% và 20 mg/kg : 4,0-8,7%.

Năm 2008 Hadir M. Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng th i
metronidazole và spiamycin trong cá sử dụng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện
sắc ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa gi i gradient 0,05M đệm phosphate

thay đổi trong ph m vi sau đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6-101,0 (mg/l); metronidazole
0,1-90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4-12,8(mg/l);ofloxacin:0,2-7,6(mg/l);
trimethoprim 0,6-7,6(mg/l); doxycycline 0,6-6,7(mg/l).
Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H [31] đã xác định đồng th i 7 sulfamit
(sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonome
thoxine, sulfamethoxazole) và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm
bằng sắc ký HPLC-PDA. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x 4,6
mm, 5µm). Pha động : axit formic0,1% - acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ dòng ch y
1,0 ml/phút. Phát hiện b i detector PDA t i 268 nm. Giới h n định lượng 3 - 80
mg/g. Kho ng tuyến tính c a các sulfamit 20-200 mg/ml. Kho ng tuyến tính c a
metronidazol, chloramphenicol 40-400 mg / ml. Hiệu suất thu hồi trung bình là
83,8% - 105,3% . Độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5%. Phương pháp này thư ng
được sử dụng cho việc xác định b y sulfamit và metronidazole, chloramphenicol
trong mỹ phẩm.

Footer Page 22 of 148.

22


Header Page 23 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Ch
2.5. Đ i t
2.5.1. Đ i t

ng 2 - Đ I T



2.1.2. Nhi m v nghiên c u
Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên c u tách và xác định

Footer Page 23 of 148.

23


Header Page 24 of 148.

Luận văn Thạc sĩ

Bùi Minh Thái

đồng th i các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector
UV-Vis.
Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên c u
một cách có hệ thống các vấn đề sau:
Tối ưu hoá các điều kiện tách và định lượng đồng th i năm chất bằng HPLC:
 Chọn bước sóng c a detector
 Chọn pha tĩnh
 Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ…
 Kh o sát kho ng tuyến tính, giới h n phát hiện và giới h n định lượng
 Đánh giá độ lặp l i và độ đúng c a phép đo.
Tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
 Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi
Xây dựng quy trình phân tích và ng dụng quy trình nghiên c u để phân tích
một số mẫu tôm.
2.6. Ph

Trong một hệ pha HPLC, dung lượng hấp phụ c a pha tĩnh được đặc trưng
bằng hệ số dung tích k’. Nếu k’ càng lớn thì chất phân tích sẽ bị lưu giữ càng nhiều
trên cột tách. Hệ số dung tích được tính theo biểu th c : k' 

tR  to
(tR: th i gian lưu
to

tổng cộng, to: th i gian không lưu giữ).
Quá trình tách chất có thể x y ra theo ba cơ chế chính như sau:
 Tương tác hấp phụ
 Tương tác trao đổi ion
 Tương tác theo cơ chế rây phân tử
 Tương ng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
 Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thư ng NP - HPLC và hấp phụ pha ngược RP
- HPLC)
 Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC)
 Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC)
Đối với hệ NP - HPLC, pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là dung môi
không và kém phân cực. Ngược l i trong hệ RP - HPLC, pha tĩnh kém phân cực,
thông thư ng pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan hoá bề mặt t o thành các
vật liệu nhồi kém phân cực. Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực. Khác
với hệ pha thư ng dùng cho các chất không phân cực hay ít phân cực, hệ này có thể
phân tích nhiều lo i chất với độ phân cực khác nhau. Do các ưu điểm như xác định
được nhiều lo i chất, hiệu qu tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nên
ngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng
nhiều hơn.
Sơ đồ tổng quát c a một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

Footer Page 25 of 148.