ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRỊNH TẤT CƯỜNG



GABA-T

GABA transaminase

GAD

L-glutamate decarboxylase

HTS

Phương pháp sàng lọc High throughput
screening

KC1

Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT

ml

milliliter

mM

millimolar

MRS

De Man, Rogosa, Sharpe


Hình 2. Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA...............................................5
Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA...........................................................6
Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB............................................................7
Hình 5: Hoạt động của thụ thể trước và sau khi gắn kết với GABA..........................7
Hình 6: Kết quả chạy sắc ký TCL đối với dịch lên men trên môi trường MRS........29
Hình 7: Hoạt tính GAD trong cám gạo được xác định thông qua MSG...................31
Hình 8: Kết quả xác định glutamic acid trong cám gạo bằng TLC...........................32
Hình 9: Đường chuẩn glutamic acid.........................................................................33
Hình 10: Hiệu quả nhiệt độ và thời gian đối với quá trình thủy phân glutamic acid
từ cám
gạo.....................................................................................................................35
Hình 11: Đường chuẩn GABA..................................................................................36
Hình 12: Hiệu quả của NaCl trên quá trình phát triển tế bào và sản xuất GABA...37

5


Hình 13: Ảnh hưởng của pH tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men
dịch chiết cám gạo.....................................................................................................41
Hình 14: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên
men dịch chiết cám gạo.............................................................................................42
Hình 15: Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên
men dịch chiết cám gạo.............................................................................................43
Hình 16: Ảnh hưởng của ôxy tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men
dịch chiết cám gạo.....................................................................................................44
Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo...............................................................45
Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B)...............................46
Hình 19: Kiểm tra GABA bằng TLC........................................................................46
Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng Lactobacillusplantarum KLEPT.....................................................................................................48
Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn......................................................................49


MỞ ĐẦU
γ-Aminobutyric axit (GABA) là một axít amin có chức năng quan trọng trong
hệ thống thần kinh. GABA thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình truyền tín hiệu
thần kinh qua khe xináp và giữ liên lạc các tế bào với nhau trong hệ thống thần kinh
trung ương. Ngoài ra, GABA đã được biết có hiệu quả điều hòa một số rối loạn thần
kinh giống như bệnh Parkinson, Huntington và bệnh Alzheimer. Chính vì GABA có
những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm
vào sự phát triển GABA thành thực phẩm chức năng. Hiện nay, quá trình sản xuất
GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng hạn: tách chiết từ các loại ngũ cốc,
tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm, hoặc lên men đậu tương bằng vi sinh vật.
Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang
được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới. Đặc biệt, vi khuẩn axít
lactic đã được ứng dụng để lên men cho hàm lượng lớn GABA từ thực phẩm truyền
thống và đã tối ưu quá trình sản xuất GABA khi sử dụng vi khuẩn lactic axit đối với
mục tiêu công nghiệp.
Tại Việt Nam, có thể nói chưa có công nghệ chế biến GABA có khả năng
hướng tới quy mô công nghiệp. Mặc dù, một số công trình nghiên cứu về sản xuất
GABA đã được nghiên cứu nhưng vẫn chưa có sản phẩm GABA bán ra thị trường.
Ngoài ra cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn
Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích
miễn dịch ổn định ở Việt Nam.
Hiện nay, hướng nghiên cứu ứng dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên để làm
thực phẩm chức năng bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam. Thực tế, khi một sản phẩm có
thể tiếp cận được trên thị trường thì sản phẩm phải đảm bảo về chất lượng và giá
thành. Để giải quyết hai vấn đề lớn này, hướng nghiên cứu của đề tài là chọn một
nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có nhất ở trong nước mà vẫn cung cấp được đầy đủ
các thành phần cơ bản để có thể lên men được GABA có hiệu suất cao.
Về chất lượng sản phẩm, nhóm nghiên cứu đề tài đã sử dụng chất chỉ thị chỉ ra
được sự thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính của tế bào.


Điều trị mất tự chủ tạm thời: có mối quan hệ giữa việc thiếu GABA và hiện tượng
mất tự chủ hành vi của một số bệnh nhân. Trong những trường hợp này, bổ sung
thêm GABA có thể ngăn ngừa sự vô hiệu hóa hoạt động các tế bào thần kinh tại não
bộ, tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân.

-

Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng có thể làm gia tăng sự đau nhức. Như một chất
dẫn tự nhiên có chức năng giảm stress, GABA có thể giảm bớt tình trạng đau nhức
kéo dài khi giảm các dấu hiệu lo lắng có liên quan đến đau nhức giúp cho chúng ta
bớt cảm giác về sự đau nhức đó.

-

Giảm trầm cảm.

-

Việc sử dụng các loại thuốc an thần làm giảm lượng GABA trong cơ thể và là một
trong các nguyên nhân gây ra hiện tượng hoảng loạn.

-

GABA cũng được coi là có thể điều trị được trạng thái rối loạn tâm lý trước thời kỳ
kinh nguyệt (PMS - premenstrual syndrome) đối với phụ nữ.

1.2. Cấu trúc và hình dạng của GABA
GABA có cấu trúc gồm 4 cacbon. Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin
nhận proton (hình 1). Hình dạng của GABA phụ thuộc nhiều vào điều kiện của môi


12


B6 hay còn được gọi là pyridoxal-5’-phophate được xem như một cofactor [32].
Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não.

Hình 2: Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]
GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các
neuron thần kinh. GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của
các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu.
GABA ngăn cản các tín hiệu căng thẳng và bất an đến vùng thần kinh trung ương
bằng việc chiếm giữ hoặc khống chế các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này [20].
Do vậy, GABA giúp cho thư giãn thần kinh và cải thiện được tinh thần. Cho tới nay,
nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã công bố GABA giúp cho con người có
giấc ngủ ngon và sâu, cải thiện khả năng mất tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài, rối
loạn tăng động thiếu chú ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trước thời kỳ kinh
nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54].

1.4. Enzym tổng hợp GABA
L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp
GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO 2. GAD tồn tại dưới hai dạng đồng
phân là GAD65 và GAD67 theo khối lượng phân tử của chúng (lần lượt là 65 và 67
kDa). Chúng được mã hóa bởi hai gen độc lập nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số
10 ở người, gen GAD65 nằm trên NST số 10 và gen GAD67 nằm trên NST số 2
[20, 40]. GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào thần kinh GABAergic

13



có vai trò nhận dạng phối tử bên ngoài tế bào còn GABA B2 có nhiệm vụ ở trên
màng tế bào và truyền tín hiệu. Thụ thể GABA B được ứng dụng như là đích để tìm
các loại thuốc trong điều trị dược học và liên quan đến vai trò truyền tín hiệu về
khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm
[20].

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [59]

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trước và sau khi gắn kết với GABA [52]

15


1.6. Sản xuất GABA từ vi sinh vật
Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng
hạn: quá trình khử cacbon của axít glutamic nhờ phân cắt của GAD [11, 8], tách
chiết từ các loại ngũ cốc [24, 27], tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm cho hàm
lượng GABA gần 15,8 g/100 g gạo [36], kích thích GAD trong mầm gạo để có thể
chuyển hóa GABA đạt hiệu suất là 29 g/100 g mầm gạo [36] hoặc lên men đậu
tương bằng vi sinh vật [9, 11, 37, 55]. Công nghệ sử dụng các vi sinh vật đặc biệt vi
khuẩn lactic là một phương pháp tốt để sản xuất GABA [11, 19, 21, 26, 28, 42, 45,
47, 53].
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đã được rất nhiều nghiên cứu gần đây
chứng minh có khả năng sản xuất GABA [24]. Bởi vì, vi khuẩn lactic có những hoạt
tính sinh lý đặc biệt và có thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào mục
đích chăm sóc sức khỏe cho con người [10, 15, 23, 29, 30, 34]. Do vậy, GABA
được sản xuất từ vi khuẩn lactic có bản chất từ tự nhiên và an toàn cho sức khỏe
như làm tăng lượng GABA trong nước ép dâu [8]. Nhiều sản phẩm được làm tăng
hàm lượng GABA bằng sử dụng những GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic được
phân lập từ sản phẩm của bơ [45], sữa đậu nành [37], kimchi [12], phophat [35] và

bào, kết quả làm tăng độ pH của tế bào chất và tăng pH ngoại bào do chuyển đổi
L-glutamate thành GABA kiềm hơn [25, 14].

1.7. Cơ chất tham gia sản xuất GABA
Monosodium glutamate (MSG) được xem như là một cơ chất trong quá trình
sản xuất Axit gamma-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic [28]. MSG là một
dạng muối của glutamic axit. MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà được tìm
thấy trong đa số các thực phẩm. Đặc biệt các thực phẩm chứa hàm lượng protein
cao chẳng hạn như bơ, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau. Trong thực phẩm
thường sử dụng MSG để tạo ra vị đã được biết tới khoảng 1200 năm về trước. Với
vị đặc biệt của MSG đã có tên là “ Unami” trong người dân Nhật Bản. Nó đã có mặt
trên thị trường cách đây hơn 100 năm. Nhiều loại thực phẩm đã tăng thêm hương vị
bằng cho thêm MSG với hàm lượng cao. Trong sữa của các bà mẹ thì hàm lượng
MSG chiếm tỉ lệ cao nhất so với các axit amino. MSG trong một số loại thuốc cao
cấp đã chứng minh có thể hoạt hóa tế bào thần kinh ở chuột cống mới sinh. Tuy
nhiên, quá trình hoạt hóa tế bào thần kinh đã không xảy ra trong thực phẩm có

17


MSG. Ngoài ra, dựa vào vô số những chứng minh khoa học cũng đã công bố MSG
là một gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe con người mà nó có vai
trò như một phân tử truyền tín hiệu không chỉ ở trong thần kinh mà còn ở một số
các mô khác. Tuy nhiên, nếu quá trình tích lũy MSG vượt quá ngưỡng trong các khe
xináp của tế bào thần kinh sẽ liên kết tạo ra những độc tố dẫn tới phá hỏng hoặc làm
tổn thương tới tế bào. Hơn nữa, MSG đã có nhiều công bố là gây độc cho tế bào
thần kinh ở trẻ em dưới 5 tuổi. Bởi vậy, sử dụng MSG như là một cơ chất cho quá
trình chuyển hóa thành GABA là một điều đáng được quan tâm [60].

1.8. Thực phẩm chức năng GABA

sản xuất ở mức quy mô công nghiệp vẫn chưa hiệu quả vì sử dụng nguồn nguyên
liệu đắt tiền do đó giá thành còn cao. Hơn nữa, sản phẩm tạo ra để ứng dụng vào
thực phẩm chức năng đang còn hạn chế về phương pháp kiểm tra hoạt tính sinh học.
Trong khi đó, một số công ty dược của Trung Quốc đang bán GABA với giá chỉ
khoảng 400.000 đồng/kg. Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên
cứu nào sử dụng cám gạo như một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất
GABA. Trong khi đó, nguồn nguyên liệu lên men từ cám gạo trong nước rất dồi
dào, giá thành thấp và gần như chỉ sử dụng để làm thức ăn gia súc. Do vậy, đây là
một trong những lý do chính giúp cho quá trình sản xuất GABA có giá thành thấp.

1.9. Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể
Trong cơ thể, tế bào có rất nhiều quá trình sinh hóa thiết yếu cho sự sống và
hoạt động chức năng được điều hòa bởi các chất dẫn truyền thần kinh và nhiều phân
tử “tín hiệu” khác. Sự điều hòa bởi những chất như vậy được thực hiện thông qua
các tương tác giữa các phân tử có nguồn gốc tự nhiên này với các thụ thể gắn trên
màng tế bào (các thụ thể liên kết màng tế bào) hoặc có mặt trong tế bào chất (thụ
thể hòa tan) hoặc trong nhân tế bào (thụ thể nhân tế bào). Trong các loại thụ thể của
cơ thể, thụ thể GABA thuộc họ thụ thể G protein là những thụ thể màng tế bào, có
những phân tử nhận dạng cấu tử ở bên ngoài tế bào và kích hoạt những con đường
truyền tín hiệu ở bên trong tế bào. Thụ thể GABA được biết tới có khả năng chi
phối nhiều loại bệnh và cũng là đích chữa bệnh của gần 30% các loại thuốc y học
hiện đại hiện nay có mặt trên thị trường. Trong các chương trình sàng lọc nhanh các

19


hợp chất có hoạt tính sinh học dựa trên các protein thụ thể, được tiến hành phân tích
sự tương tác trực tiếp của hàng loạt các hợp chất mới (hoặc có nguồn gốc tổng hợp,
hoặc có nguồn gốc tự nhiên) với các protein thụ thể đích được quan tâm nghiên cứu.
Từ kết quả phân tích này, các hợp chất có hoạt tính tương tác đặc hiệu với các thụ

con đường phân tử sinh học cụ thể. Những kết quả của phương pháp này sẽ giúp
cho quá trình khởi đầu tạo ra những loại thuốc mới và hiểu quá trình tương tác hoặc
vai trò của quá trình sinh hóa trong sinh học .Trong hoàn cảnh hiện nay của Việt
Nam, để phát triển phương pháp đánh dấu phóng xạ là rất khó khăn. Do vậy, việc
phát triển phương pháp đánh dấu huỳnh quang hoặc đánh giá các tín hiệu thứ cấp
khi thụ thể hoạt động sinh ra hoàn toàn có thể phát triển và ứng dụng được trong
điều kiện thực tế của Việt Nam hiện nay [17].
Bên cạnh đó, xây dựng các hệ thống sàng lọc đơn giản hóa và tự động cần
được thiết lập trong các phòng thí nghiệm và tránh việc sử dụng các chất phóng xạ.
Hơn nữa, các hệ thống sàng lọc này sẽ cho phép phân biệt chức năng đơn giản giữa
các chất chủ vận, các chất đối vận và có khả năng ứng dụng cho phần lớn các thụ
thể. Do vậy, phương pháp sàng lọc chức năng đối với thụ thể GABA đã phát triển
gần đây dựa vào quá trình thay đổi kênh Cl- bên trong tế bào khi thụ thể này liên kết
với GABA. Từ quá trình thay đổi kênh Cl- sẽ bắt mầu với Iot. Do vậy, việc đánh giá
tín hiệu thay đổi màu Iot có thể bắt được bằng bước sóng hấp phụ 405 nm. Phương
pháp sàng lọc này có thể thực hiện trong những đĩa microplate với số lượng giếng là
96, 384, 1536, 3456. [17]. Đây là một phương pháp được chúng tôi lựa chọn xây
dựng để đánh giá hoạt tính và định lượng GABA trong đề tài nghiên cứu.

21


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Vi sinh vật
Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) được cung cấp bởi Phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên.
2.1.2. Các mẫu cám gạo

côn các loại (1 ml; 0,2 ml) và các ống eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml), pipet tiệt
trùng dùng trong nuôi cấy tế bào (1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml), Bình thủy tinh duran
các loại (Inovagen, Mỹ). Màng lọc vi khuẩn (Sigma, Đức).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo

2.2.1.1. Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1
Bảng 1: Thành phần môi trường MRS
Công thức

gram/ lít

Peptone

10

Cao thịt

10

Cao nấm men

5

Glucose

20

Tween

+ Pha môi trường MRS với thành phần hóa chất như bảng 1, chỉnh pH=6, bổ sung 1
lít nước cất. Sau đó, môi trường được hòa tan bằng thiết bị khuấy từ (IKA, Đức), và
đem đi khử trùng bằng nồi hấp (ALP, Nhật) ở 121ºC trong vòng 15 phút.
+ Chủng KC1 được bảo quản ở 4 o - 6oC được cấy trên đĩa petri chứa môi trường
MRS có bổ sung agar theo phương pháp cấy ria, sau đó ủ ở 37oC trong 24 giờ.
+ Khuẩn lạc phát triển được nhân giống cấp II với môi trường MRS lỏng trong bình
tam giác 50 ml.

2.2.1.2. Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1
Chủng KC1 sẽ được cấy vào môi trường MRS có bổ sung 5% MSG và lắc
với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy sau khi ly
tâm 1500 vòng trong 15 phút sẽ được phân tích bằng TLC để đánh giá khả năng
sinh GABA.

2.2.1.3.

Đánh giá chất lượng cám gạo
Các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng protein, lipid, tro tổng số, chất xơ tổng số,

mảnh vật sắc nhọn được kiểm nghiệm.
 Phương pháp xác định độ ẩm

Việc xác định độ ẩm của cám gạo được tiến hành theo TCVN-4326-86.
+ Sấy khô chén ở nhiệt độ 100ºC, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng chén.
+ Lấy 100 g cám gạo cho vào chén cân đã sấy khô, cân trọng lượng chén với mẫu (S1)
trước khi cho vào sấy.
+ Cho chén với mẫu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100-105ºC trong khoảng 6-8 giờ để
nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, cân đến trọng lượng mẫu không đổi (S2).
+ Tính độ ẩm: S1 - S2 (g).
 Phương pháp xác định hàm lượng protein

+ Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lượng khối lượng không đổi.
+ Nung ở nhiệt độ 525°C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà.
+ Làm nguội trong bình hút ẩm.
+ Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi.
+ Tính kết quả: X = m2 - m1 (g).
X: Hàm lượng chất tro.

25