TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG
------------o O o------------

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống Nưa Konjac
(Amorphophallus konjac) bằng phương pháp in vitro

Giảng viên hướng dẫn

: TS. Đồng Thị Kim Cúc

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Mai Phương

MSSV

: 513301032

Hà Nội – 2017


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU...............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................1
1.2. Tính cấp thiết của đề tài..........................................................................2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài...............................................................2
1.4. Ý nghĩa của đề tài.....................................................................................3

3.5. Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi.................................21
3.5.1. Ảnh hưởng kết hợp của 2,4D + IBA đến
quá trình tạo mô sẹo từ củ.................................................................21
3.5.2. Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA + 2,4D đến
quá trình hình thành mô sẹo từ củ....................................................22
3.5.3. Ảnh hưởng của tuổi củ đến quá trình tạo mô sẹo...........................22
3.5.4. Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA đến
quá trình tái sinh chồi........................................................................23
3.5.5. Ảnh hưởng của kinitin đến quá trình
tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................................23
3.5.6. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình
tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................................24
3.6. Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................24
PHẦN 4. DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC.....................................................25
4.1. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của
2,4D + IBA đếnquá trình tạo mô sẹo từ củ..............................................25
4.2. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của
BA + NAA + 2,4D đến quá trình hình thành mô sẹo từ củ.....................25
4.3. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của tuổi củ


đến quá trình tạo mô sẹo...........................................................................26
4.4. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp
của BA + NAA đến quá trình tái sinh chồi..............................................26
4.5. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của kinitin
đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................27
4.6. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA
đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh.........................................................27
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................29
5.1. Kết luận.....................................................................................................29

thực vật có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với thực tế là ngày nay đời sống con người
ngày càng nâng cao, nhiều người không còn nghĩ đến một loài cây có nhiều giá trị
to lớn như vậy.
Hơn nữa hiện nay chưa có nhiều những nghiên cứu về cây Nưa, chính vì vậy
việc quan tâm đến cây Nưa là một việc làm cần thiết để có thể nhân giống và bảo
tồn giống cây Nưa.

5


1.2. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, chi Nưa có khoảng 25 loài, trong đó có 2 trong 3 loài được trồng
phổ biến ở Trung Quốc để sản xuất nguyên liệu glucomannan. Hiện nay, nghiên
cứu trong lĩnh vực nhân giống và trồng trọt các loài Nưa ở Việt Nam vẫn chưa
được quan tâm nhiều. Trong khi đó, hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập hàng trăm
ngàn tấn bột Nưa để phục vụ cho công nghệ thực phẩm, nhiều sản phẩm thực phẩm
chức năng như viên giảm béo...
Cây Nưa konjac sinh sản chủ yếu bằng con đường sinh sản vô tính, thông qua
các thân hành nên hiệu quả tái sinh rất thấp và thân hành thường chứa các mầm
bệnh, điều này dẫn đến nhiều rủi ro trong trồng trọt. Phương pháp nhân giống này
không làm cây sạch bệnh, năng suất không cao đồng thời nó còn tốn nhiều thời
gian và công chăm sóc.
Trước tình hình đó, việc tìm ra biện pháp nhân giống cây Nưa konjac sạch
bệnh, có chất lượng tốt là cần thiết. Và thế là một phương pháp nhân giống mới
được áp dụng, đó là phương pháp nuôi cấy mô. Phương pháp này làm cho cây Nưa
tăng thêm cả về số lượng lẫn chất lượng, tạo ra một số lượng trong thời gian ngắn
và cây sạch bệnh.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống Nưa konjac (Amorphophallus konjac)
bằng phương pháp in vitro”.

loài bản địa mọc tự nhiên vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới ẩm miền đông châu Á, từ
Nhật Bản và Trung Quốc về phía nam tới Indonesia. Konjac được biết đến ở Nhật
Bản từ thế kỷ thứ 6 như một loại dược phẩm.
Phân loại khoa học:
Giới (Kingdom):

Plantae

(unranked):

Angiosperms

(unranked):

Monocots

Bộ (Order):

Alismatales

Họ (Family):

Araceae

Chi (Genus):

Amorphophallus

Loài (Species):


một số loại dược phẩm. Glucomannan là một chất xơ hòa tan, chính vì vậy nó được
sử dụng để điều trị táo bón. Glucomannan cũng có tác dụng làm giảm colesterol,
lipoprotein và chất béo trung tính, do đó được bổ sung vào thành phần của các loại
thuốc chữa béo phì. Chất này cũng được chứng minh là có tác dụng chống lão hóa,
hạ đường huyết. Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống cây Nưa để thu glucomannan
có ý nghĩa rất to lớn.

9


2.2. Phương pháp nhân giống cây Nưa konjac
2.2.1. Phương pháp nhân giống truyền thống
Gieo hạt
Là phương pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành cây con, hạt giống được
thu từ quả đã chín, trong điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm hình thành cây.
Ưu điểm: vận chuyển và bảo quản hạt giống dễ dàng do kích thước hạt
giống nhỏ.
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp.
Cắt chồi từ cây mẹ
Là phương pháp cắt cành (ngó) từ củ cây mẹ để cho tạo thành những cây
mới.
Ưu điểm: ít tốn thời gian.
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp, cây dễ bị thoái hóa, rễ
cây yếu. Phương pháp này không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể được
truyền từ cây mẹ sang.
2.2.2. Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học
Nuôi cấy mô (nhân giống in vitro)
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn
thân non nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể mới
hoàn chỉnh.

trồng trọt Nưa Konjac trên đất bằng và đất dốc tại 2 tỉnh Jinnejo và Uedama ở Nhật
Bản, cũng như các yếu tố về nhiệt độ, đất, sâu bệnh và thời vụ.
Dhua và cộng sự (1988) đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất hóa
học đến quá trình nảy mầm, phát triển và sản lượng của củ Nưa chuông
(Amorphophallus paeoniifolius).

11


Liu và cs. (1998) khi nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển của một số loài
Nưa ở Trung Quốc đã chỉ ra các điều kiện sinh thái của Nưa. Theo nhóm nghiên
cứu, Nưa không phải là cây đòi hỏi nhiều nước, có khả năng chịu hạn tốt nhưng
không chịu được ngập úng. Về nhiệt độ, Nưa là cây ưa ấm, có khả năng chịu biến
thiên nhiệt độ từ 5 - 43°C, nhiệt độ tối thích là 20 – 25°C, sau khi nhiệt độ xuống
dưới 0°C và lên trên 48°C cây sẽ chết sau 5 ngày. Nghiên cứu này cũng đưa ra
một số mức nhiệt tối thích cho sự phát triển của củ và rễ, khả năng lai của một số
loài Nưa và thu được nhiều kết quả khả quan. Cũng theo nghiên cứu cho biết Nhật
Bản và Trung Quốc là hai nước có lịch sử trồng và sử dụng bột Nưa như loại thực
phẩm truyền thống từ hàng nghìn năm trở về trước. Dựa trên những nghiên cứu
rộng rãi về an toàn thực phẩm, Bộ Y tế Trung Quốc cho phép đưa bột Nưa vào
trong những thực phẩm quản lý thông thường từ năm 1998. Ở Mỹ người ta chấp
nhận bột Nưa như thực phẩm bổ sung (1997), và cũng cho phép sử dụng bột Nưa
như nhân tố làm đặc, tạo màng, chất chuyển thể sữa và chất ổn định trong các thực
phẩm. Ngày nay Nhật Bản, Trung Quốc và một số nước đã sử dụng bột Nưa làm
nguyên liệu trong công nghiệp dược phẩm, sản xuất thực phẩm chức năng, hỗ trợ
nhiều bệnh như đái tháo đường, hạ cholesterol máu, điều trị táo bón, hỗ trợ giảm
cân.
Long Chi Lin (1998) đã có công trình nghiên cứu thực vật dân tộc học của
các loài Nưa, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng người dân Trung Quốc đã sử dụng nưa
làm thức ăn từ 3000 – 4000 năm trước, nhiều kiến thức về kỹ thuật trồng cây Nưa

giá là cây sinh trưởng chậm cho năng suất thấp.
Kết quả nghiên cứu của Nedunchezhiyan và cs. (2006) đã giới thiệu khá cụ
thể về các bước nhân giống từ củ, làm đất, tỷ lệ phân bón, mật độ trồng, tưới nước,
thu hoạch, cũng như bảo quản củ Nưa ở Ấn Độ.
Theo Melinda Chua và cs. (2010), ở Trung Quốc, Nưa được trồng xen canh
với ngô cũng đạt năng suất khá cao.

13


Zhang và cs. (2010) đã công bố kết quả nghiên cứu nhân giống so le giữa 2
loài Nưa là: A. bulbifer và A. muelleri nhằm tìm ra loài Nưa thích hợp cho vùng
Nam Á. Sau khi nghiên cứu và so sánh với Nưa konjac (A. konjac), nhóm nghiên
cứu đã kết luận loài A. muelleri có khả năng thích ứng tốt với khí hậu Nam Á, cho
hàm lượng glucomannan cao (>70%) có thể phát triển trồng ở bắc Mianma và Lào.
Nghiên cứu đã giải thích tại sao ở Nam Á người ta sử dụng củ mà không sử dụng
hạt Nưa làm vật liệu nhân giống. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện khí hậu
của khu vực rất thuận lợi cho sự phát triển của các loài cỏ dại, cây từ hạt thường
không đủ sức cạnh tranh. Hơn nữa, cây có nguồn gốc từ hạt không thể cho củ lớn
trong thời gian 1 năm trong điều kiện tự nhiên.
Mặc dù đã có nhiều tác giả nghiên cứu về Nưa nhưng các tài liệu được công
bố chủ yếu là các tài liệu về phân loại học và hình thái học còn các tài liệu về sinh
trưởng, phát triển cũng như trồng trọt, nhân giống chủ yếu được nghiên cứu ở một
số loài như: A. konjac, A. bulbifer, A. muelleri và A. paeoniifolius. Các loài Nưa
khác còn ít được biết đến.
2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, chi Nưa có khoảng 25 loài phân bố từ Bắc vào Nam nhưng hầu
hết tập trung ở các tỉnh miền núi, một số tỉnh duyên hải và hải đảo. Một số loài đã
được các dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không chỉ làm thực phẩm mà còn là
nguồn dược liệu tự nhiên quý giá. Người dân thường trồng Nưa lấy củ làm lương

bào được chứng minh bằng thực nghiệm. Từ đó đến nay, rất nhiều công trình
nghiên cứu đã tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay
một phần của cơ quan. Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ
sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
- Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

15


Biệt hóa (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho
đến khi thể hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trường nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và
chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở
lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi
là phản phân hóa.

Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản
phân hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào
càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó xảy ra
quá trình phản phân hoá và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào
thần kinh ở động vật. Người ta đã chứng minh rằng: các tế bào càng gần trạng thái
của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt
động của gene. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một gene nào đó
đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho một tính trạng
mới. Ngược lại một số gene lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình hoạt hoá,
ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gene của
tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà. Khi
tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho


17


trường nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trường nhiều kali giúp
cho quá trình trao đổi chất diễn ramạnh.
+ Các nguyên tố vi lượng
Nguyên tố vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ dưới
30ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi
trường nuôi cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và
phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu
Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp.
Hàm lượng các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi
trường nuôi cấy và các đối tượng nuôi cấy.
- Nguồn cacbon
Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon.Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện
bắt buộc.Trong phần lớn các môi trường nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu là
saccharose và glucose. Ở một số mô thì có thể

dùng mantose, fructose và

galactose.
- Vitamin
Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) vẫn có khả
năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu
sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng.Vì vậy, phải bổ sung thêm các vitamin
cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co-enzyme xúc tác cho các
phản ứng sinh hóa trong tế bào. Các vitamin thường đươc sử dụng như:
B1(Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Panthotenic), B5 (Nicotinic acid) với nồng độ

mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa Aux ngoại sinh và Aux nội sinh.
Aux kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to dẫn đến tăng kích
thước của các cơ quan như tăng diện tích lá, phình to của quả, củ, tăng đường
kính và chiều dài của cành, thân, rễ, tạo quả không hạt, kìm hãm sự rụng lá, hoa

19


quả...
Aux điều khiển tính hướng của cây như hướng sáng, hướng đất. Do sự phân
bố không đều của Aux ở hai phía của cơ quan, dẫn đến sự sinh trưởng không đều
của tế bào trong một cơ quan, gây ra tính hướng.
Ở cấp độ tế bào, Aux còn ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất, các
quá trình sinh lý của cây trồng như: quang hợp, hô hấp, trao đổi nước hay khoáng,
tăng khả năng thẩm thấu của tế bào, tăng quá trình trao đổi acid nucleic,protein…
Quan trọng nhất là Aux kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất định
trên cành chiết, cành giâm và trên mô nuôi cấy.Vì vậy, trong kỹ thuật nhân giống
vô tính, việc sử dụng Aux để kích thích ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc.
+ Cytokinin
Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia
tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, BAP. Kinetin là một dẫn xuất của
bazo nito adenine được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất nucleic acid.
BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin.Kinetin
và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động
của tế bào phôi sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào. Ngoài ra, các chất này
có tác dụng lên qua trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein
và tăng cường hoạt tính của nhiều loại enzyme. Cơ chế tác động của cytokinin ở
mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với
các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự
tổng hợp DNA. Tác động phối hợp giữa auxin và cytokinin có tác động quyết

trao đổi chất di truyền của GA khẳng định rằng các đột biến lùn của một số thực
vật như ngô, đậu Hà lan (chiều cao của cây chỉ bằng 20% chiều cao của cây bình
thường) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu những gen chịu trác nhiệm
tổng hợp các enzyme của một số phản ứng trên con đường tổng hợp GA mà cây
không thể hình thành được GA dù là một lượng rất nhỏ. Với những đột biến này
thì việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho cây sinh trưởng bình thường.

21


- Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia hữu cơ được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích
thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, dịch chiết khoai
tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước dừa chứa các acid
amin, acid hữu cơ, đường, Myo-inositol và các chất có hoạt tính auxin, các
gluoxit của cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng do
trong thành phần của chúng có chứa một số loại vitamin và các chất kích thích tố
có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cây nuôi cấy.
- Chất giá thể (thạch -Agar)
Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường nuôicấy,
hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng.
Khi nồng độ agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất
dinh dưỡng cũng như sự hấp thụ của mô gặp khó khăn. Đa số nuôi cấy phôi được
thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào từng loại cây mà sử dụng
cho phù hợp. Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng, việc sử dụng agar được
tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na
và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy nhiên, các chất nói trên cũng có thể
được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong
o
cồn và làm khô ở 60 C trong 24 giờ.



PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu là cây
Nưa konjac được cung cấp bởi Trung tâm Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp
Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông Nghiệp.
- Phạm vi nghiên cứu: Đối tượng được nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm.
3.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
3.2.1. Hóa chất sử dụng
- Hóa chất sử dụng là các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần
của môi trường MS.
- Các chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D (Bio science), kinetin (Wako), BA
(Duchefa), NAA (Trung quốc), IBA (Duchefa); các chất bổsung như: inositol (Bio
science).
3.2.2. Thiết bị sử dụng
- Các thiết bị dùng cho nghiên cứu: Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp
khử trùng ALP (Nhật bản), tủ sấy (Memmenrt) (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II
(Airtech) (Hàn Quốc), máy chuẩn pH (Hanna HI2210) (Đức), Lò vi sóng Sanyo
(Nhật bản)…
Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm Trung tâm
Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông
Nghiệp.

3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành

24



Tổng số mẫu vào

25