Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Nguyễn Hoài Thu

Đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng
Vibrio parahaemolyticus phân lập đƣợc ở bệnh nhân
ngộ độc thực phẩm tại Hà Nội

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Bình Minh

Hà Nội - Năm 2010

2


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

Lời cảm ơn
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn
Bình Minh, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình

Nguyễn Hoài Thu

4


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

Mục lục

Trang phụ bìa .............................................................................................................. 2
Lời cảm ơn .................................................................................................................. 3
Lời cam đoan ............................................................................................................... 4
Mục lục ........................................................................................................................ 5
Danh mục chữ viết tắt ................................................................................................. 8
Danh mục bảng ........................................................................................................... 9
Danh mục hình minh họa .......................................................................................... 11
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 12
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 15
1.1.

Ngộ độc thực phẩm nguyên nhân do V. parahaemolyticus ............................ 15

1.1.1.

Tình hình ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus trên thế giới .......15

1.1.2.


1.2.5.

Tính chất kháng nguyên ...........................................................................23

1.2.6.

Bộ gen của V. parahaemolyticus ..............................................................24

1.2.7.

Độc tố và cơ chế gây bệnh .......................................................................24

1.2.8.

Chủng V. parahaemolyticus gây dịch type huyết thanh O3:K6 ...............28

1.2.8.1.

Nguồn gốc phát sinh chủng O3:K6 mới ............................................28

1.2.8.2.

Các biến thể của type huyết thanh O3:K6 .........................................29

1.3.

Các phƣơng pháp chẩn đoán ........................................................................... 30

5


1.4.1.

Trên thế giới .............................................................................................35

1.4.1.1.

Phƣơng pháp PCR .............................................................................35

1.4.1.2.

Phƣơng pháp xác định genotype .......................................................37

1.4.1.3.

Kỹ thuật Ribotyping ..........................................................................39

1.4.1.4.

Phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn ............................................40

1.4.2.

Tại Việt Nam ............................................................................................40

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 42
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................... 42

2.2.


2.4.3.1.
đƣợc

Tách chiết ADN của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập
.................................................................................................45

2.4.3.2.

Phản ứng chuỗi men (PCR) phát hiện gen ToxR ..............................45

2.4.3.3.

PCR phát hiện gen tdh ......................................................................47

2.4.3.4.

PCR phát hiện gen trh ......................................................................48

2.4.3.5.

PCR phát hiện gen GS ......................................................................50

6


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

2.5.


KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 70

7


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

Danh mục chữ viết tắt

ADN

axit deoxyribonucleic

ARN

axit ribonucleic

bp

base pair (cặp ba zơ)

CDC

Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát và phòng bệnh dịch)

CLB


PFGE

Pulse Field Gel Electrophoresis (điện di trƣờng xung)

TBE

Tris Borate EDTA

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar

tdh

thermostable direct hemolysin
(ly giải hồng cầu trực tiếp chịu nhiệt)

TE

Tris EDTA

trh

thermostable related hemolysin
(ly giải hồng cầu có liên quan đến yếu tố chịu nhiệt)

TTSS

Type III Secretion System (hệ thống tiết type III)

Bảng 2.12. Chu trình chạy PCR phát hiện gen GS ...................................................51
Bảng 2.13. Thành phần dung dịch đệm trƣớc khi cắt ADN bằng enzyme giới hạn .53
Bảng 2.14. Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt ADN bằng NotI ...............................54
Bảng 3.1. Tính chất hóa sinh của 84 chủng V. parahaemolyticus ...........................57
Bảng 3.2. Kết quả xác định type huyết thanh của các chủng V. parahaemolyticus .58

9


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

Bảng 3.3. Phân nhóm kiểu gen độc tố.......................................................................62
Bảng 3.4. Mối liên quan giữa type huyết thanh và các kiểu gen của các chủng vi
khuẩn .........................................................................................................................65

10


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

Danh mục hình minh họa

Hình 1.1. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus dƣới kính hiển vi điện tử ..................19
Hình 1.2. Khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch TCBS .................30
Hình 1.3. Khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch Chrom ................31
Hình 1.4. Tính chất sinh hóa của V. parahaemolyticus ............................................32

thái và dịch tễ. Những loài thƣờng gặp gây bệnh đƣờng tiêu hóa ở ngƣời nhƣ Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus. Các phẩy khuẩn khác nhƣ
Vibrio mimicus, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii và Vibrio holliase thƣờng ít gây
bệnh cho ngƣời.
Không nhƣ V. cholerae, thƣờng gây bệnh ở những nƣớc chậm phát triển có
điều kiện vệ sinh thấp kém, nhiễm khuẩn do V. parahaemolyticus thƣờng xảy ra ở
cộng đồng dân cƣ có mức sống cao, ngay cả ở những nƣớc đang phát triển. Nguyên
nhân nhiễm khuẩn V. parahaemolyticus không chỉ do ý thức vệ sinh an toàn thực
phẩm mà còn do tập quán ăn uống. Vi khuẩn này cƣ trú tự nhiên ở nƣớc biển hoặc
cửa sông và truyền bệnh cho ngƣời do ăn các loại hải sản sống, chƣa đƣợc nấu chín
hoặc thực phẩm bị nhiễm trùng. Nhiễm trùng V. parahaemolyticus gây hội chứng
viêm dạ dày ruột bao gồm các triệu chứng: tiêu chảy cấp, đau bụng, nôn, đau đầu,
sốt nhẹ, thỉnh thoảng tiêu chảy có máu. Nhiễm trùng V. parahaemolyticus thƣờng
gây thành dịch lớn ở nhiều nƣớc. Cơ chế gây bệnh do V. parahaemolyticus hiện vẫn
chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. Nghiên cứu ở một số nƣớc cho thấy các chủng V.
parahaemolyticus phân lập từ bệnh nhân mang gen ly giải hồng cầu trực tiếp chịu
nhiệt tdh (thermostable direct hemolysin) hoặc gen trh (thermostable related
hemolysin) ly giải hồng cầu liên quan với tdh hoặc cả hai gen.
V. parahaemolyticus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ở nhiều nƣớc
trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tại Việt Nam, V. parahaemolyticus đã đƣợc

12


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

phân lập từ ghẹ, tôm hùm và ốc [61]. Trong một điều tra về bệnh đƣờng ruột ở tỉnh
Khánh Hòa từ năm 1997 đến năm 1999 đã phát hiện ra 548 ca nhiễm trùng có


Là nâng cao năng lực kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm của các cơ quan
chức năng.
Với những ý nghĩa trên, mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm:
1. Phát hiện và định type V. parahaemolyticus từ bệnh nhân tiêu chảy ở Hà

Nội bằng phƣơng pháp nuôi cấy phân lập

13


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

2. Xác định các gen độc tố tdh, trh và GS và so sánh các chủng V.
parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật điện di trƣờng xung

14


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1.

Ngộ độc thực phẩm nguyên nhân do V. parahaemolyticus

Nguyễn Hoài Thu

1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus tại Việt nam
Tại Việt Nam, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về bệnh đƣờng ruột
ở tỉnh Khánh Hòa và ghi nhận một lƣợng lớn các ca tiêu chảy có liên quan đến
nhiễm trùng có nguyên nhân do V. parahaemolyticus. Từ tháng 1 năm 1997 đến
tháng 11 năm 1999 nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ mắc V. parahaemolylticus trên
1000 ngƣời là 0,15 ca bệnh đối với trẻ nhỏ hơn 6 tuổi, 0,18 ca từ 6-65 tuổi và 0,09
ca lớn hơn 65 tuổi. Mặc dù hải sản vẫn là yếu tố nguy cơ chính gây nhiễm trùng V.
parahaemolyticus nhƣng điều đáng thú vị là khi so sánh điều kiện kinh tế xã hội của
những ngƣời bị ngộ độc thức ăn do vi khuẩn này gây ra, các nhà nghiên cứu đã thấy
rằng càng những ngƣời có mức sống cao trong xã hội lại càng dễ nhiễm V.
parahaemolyticus. Nguyên nhân đƣợc cho là tại Khánh Hòa, do giá hải sản tƣơi
tƣơng đối cao nên những gia đình có điều kiện kinh tế eo hẹp thƣờng khó có thể sử
dụng thƣờng xuyên nguồn dinh dƣỡng này [58].
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng
Có tất cả ba dạng bệnh cảnh lâm sàng khi bị nhiễm V. parahaemolyticus:
nhiễm trùng vết thƣơng, nhiễm trùng máu thứ cấp và bệnh đƣờng ruột. Khi xâm
nhiễm vào cơ thể, V. parahaemolyticus sẽ gây ra tình trạng tiêu chảy với các triệu
chứng buồn nôn, nôn và sốt. Thông thƣờng những triệu chứng này xảy ra trong
vòng 24 tiếng sau khi bị phơi nhiễm. Các triệu chứng trên tƣơng tự nhƣ do
Salmonella nhƣng trầm trọng hơn. Salmonella tác động lên vùng bụng trong khi V.
parahaemolyticus tác động lên bao tử ngƣời bệnh [1].
Thông thƣờng, bệnh sẽ tự khỏi trong vòng 3 ngày, tuy nhiên với những
trƣờng hợp nặng, thƣờng hay xảy ra với những ngƣời có hệ miễn dịch yếu, bệnh có
thể kéo dài lâu hơn.

16



Rửa tay sạch sẽ, vệ sinh dao, thớt trƣớc và sau khi chế biến hải sản

-

Nấu chín hải sản

 Điều trị
Ngộ độc thức ăn do V. parahaemolyticus gây ra thƣờng không cần phải điều
trị. Cho đến nay, vẫn chƣa có bằng chứng nào cho thấy việc điều trị bằng kháng
sinh sẽ làm giảm tính dữ dội của ca bệnh hay nhanh khỏi bệnh. Để điều trị, chủ yếu
bệnh nhân nên uống thật nhiều nƣớc để thay thế lƣợng nƣớc đã mất khi bị tiêu chảy.
Tuy nhiên, đối với những ca bệnh nặng kéo dài có thể sử dụng các kháng sinh nhƣ
Tetracycline, Ampicillin hoặc Ciprofloxacin nhƣng việc lựa chọn loại kháng sinh
nào cần phải dựa trên kháng sinh đồ của vi khuẩn gây bệnh.

17


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

1.2.

Nguyễn Hoài Thu

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.2.1. Định danh
Chi Vibrio nằm trong họ Vibrionaceae. Ngoài chi Vibrio, họ này còn bao
gồm các chi Aeromonas, Plesiomonas, và Photobacterium. Do có đặc tính ƣa mặn
nên tất cả loài Vibrio đều hiện diện trong môi trƣờng nƣớc biển. Trong 30 loài thuộc


Vibrionaceae

Chi

:

Vibrio

Loài :

Vibrio parahaemolyticus

1.2.3. Hình thái và tính chất hóa sinh
 Hình thái
Vibrio parahaemolyticus là trực khuẩn Gram âm, không có nha bào, kích
thƣớc rộng 0,5 đến 0,8 m và dài 1,4 đến 2,6 m. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm, chúng thƣờng mọc ở dạng thẳng hình que. Các phẩy khuẩn
thƣờng di dộng nhờ một lông dài ở đầu và thuộc dạng hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.

18


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

Hầu hết các loài đều sinh oxidase, catalase và lên men đƣờng glucose mà không
sinh hơi. Đặc biệt V. vulnificus có kiểu hình tƣơng đối giống V. parahaemolytic.
Tuy nhiên có thể phân biệt hai loài này dựa vào đặc tính lên men đƣờng lactose và


-/-

Urease

-

Indole

+

Methyl Red (MR)

+

Voges-Proskauer (VP)

-

LDC (Lysine decarboxylase)

+

ADH (Arginin decarboxylase)

-

ODC (Ornithine decarboxylase)

+


-

*0-10% +

20


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

1.2.4. Đặc điểm sinh thái
V. parahaemolyticus thƣờng gặp ở thủy sản loại nhuyễn thể và giáp xác
trong nƣớc biển lẫn nƣớc ngọt, tuy nhiên vi khuẩn này thƣờng không lây truyền từ
ngƣời qua ngƣời. Các trƣờng hợp nhiễm Vibrio parahaemolyticus thƣờng xảy ra
vào mùa hè. Nguyên nhân là do các vi khuẩn này thƣờng đƣợc tìm thấy trên bề mặt
nƣớc ở các vùng duyên hải, trên cá và các động vật giáp xác vào mùa hè ấm áp, còn
trong những tháng mùa đông lạnh, V. parahaemolyticus lại có xu hƣớng nằm ở
trong lớp phù sa hoặc bùn ở đáy nƣớc nên khả năng gây nhiễm giảm. V.
parahaemolyticus có mặt ở khắp các vùng nƣớc ven biển mặc dù thể sinh bệnh
không thể hồi phục từ nƣớc ở vùng cửa biển trong suốt mùa đông ở nhiệt độ thấp
[65]. Chủng V. parahaemolyticus cũng đƣợc tìm thấy ở rất nhiều món ăn chế biến
từ hải sản ở Thái Lan, Hồng Kông, Indonesia và Việt Nam [61]. Trong suốt các
tháng mùa hè những năm 1960, ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus gây ra
chiếm gần một nửa các ca ngộ độc thức ăn ở Nhật Bản nơi có tập quán ăn hải sản
sống do vi khuẩn này có rất nhiều trên bề mặt nƣớc biển [65].
Vibrio parahaemolyticus có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-430C, nhiệt độ tối
ƣu là 370C, pH tối ƣu từ 7,8 đến 8,6. Vi khuẩn này có thể phát triển ở nồng độ muối
từ 0,5-10%, nồng độ muối tối ƣu là 3%. Có khả năng sống ở nƣớc đá, tuy nhiên số


0,981

0,940-0,996

3

0,5-10

Nhiệt độ (0C)

NaCl (%)
awc: hoạt độ nƣớc

Giới hạn nhiệt độ cho sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus là từ 5-430C
nên việc làm lạnh hải sản có ý nghĩa trong việc bảo vệ thực phẩm khỏi sự phát triển
của vi khuẩn và là biện pháp ƣu tiên hàng đầu trong việc bảo quản thực phẩm trƣớc
khi chế biến. Nếu để ở nhiệt độ thƣờng từ 20-350C trong 2-3 giờ, lƣợng vi khuẩn ít
ỏi 102 cfu/g ban đầu trong hải sản có thể tăng đến 105 cfu/g [46]. Gooch và cs [15]
đã chứng minh rằng tại vùng Vịnh ở Mỹ, tại nhiệt độ 260C, vi khuẩn này tăng sinh
một cách nhanh chóng ở hàu sống (1,7 log cfu/g trong 10h và 2,9 log trong 24 giờ).
Trong khi đó, nếu để ở tủ lạnh, con số này chỉ là 0,8 log cfu/g trong 14 giờ [15]. V.
parahaemolyticus sẽ chết dần ở nhiệt độ 470C, tốc độ chết này sẽ tăng nhanh hơn ở
nhiệt độ 600C nên nấu hải sản ở nhiệt độ trên 650C là cách hiệu quả để loại bỏ vi
khuẩn. Trong quá trình bảo quản lạnh, số lƣợng vi khuẩn ban đầu cũng sẽ giảm dần
tới một mức độ và duy trì ổn định trong một thời gian dài trong hải sản [46].
V. parahaemolyticus nhạy cảm với môi trƣờng axít và không phát triển ở pH
dƣới 4,8. V. parahaemolyticus cần phải có ion kiềm để tồn tại và phát triển và có thể
chịu đƣợc độ mặn lên tới 8% NaCl. Trong khi đó sức chịu đựng hoạt độ nƣớc tối
thiểu lại phụ thuộc vào lƣợng chất hòa tan trong dung dịch [59].


5

5,15,17,30,47,60,61,68

6

6,18,46

7

7,19

8

8,20,21,22,39,70,74

9

9,23,44

10

19,24,52,66,71

11

36,40,50,51,61

12

Bộ gen của V. parahaemolyticus chứa hai chromosome bao gồm 3288558 bp
và 1877212 bp. Hai chromosome này có tổng cộng 4832 gen. Khi so sánh bộ gen
của V. parahaemolyticus với V. cholerae, các nhà khoa học đã nhận thấy có sự cấu
trúc lại ở bên trong mỗi chromosome và giữa hai chromosome này. Điều đặc biệt là
gen cho hệ thống tiết type III (TTSS) đã đƣợc tìm thấy ở bộ gen của V.
parahaemolyticus; đây là gen thƣờng thấy ở những vi khuẩn gây tiêu chảy nhƣ
Shigenlla, Salmonella và E. coli nhƣng V. cholerae không có những gen này. Gen
gây độc tdh có trọng lƣợng phân tử 42 000 bao gồm hai dƣới đơn vị 21 000 chủ yếu
nằm trên chromosome. Tuy nhiên, có một vài trƣờng hợp lại tìm thấy gen này nằm
trên plasmid. tdh mã hóa cho 189 axít amin, đây là các axít amin có chức năng ly
giải hồng cầu và một số các hoạt động sinh hóa khác. Gen gây độc trh khác gen tdh
ở sự thay đổi các base, tuy nhiên hai gen này có sự tƣơng đồng về tỷ lệ G-C khá
giống nhau. Cũng giống tdh, trh mã hóa một đoạn polypeptide dài 189 axit amin.
trh đƣợc tạo bởi hai dƣới đơn vị và có trọng lƣợng phân tử là 23 000 .
1.2.7. Độc tố và cơ chế gây bệnh
Có rất nhiều yếu tố gây độc đƣợc cho là có vai trò trong khả năng gây bệnh
của V. parahaemolyticus bao gồm: mối liên quan với ly giải hồng cầu beta, các
nhân tố bám dính, các loại enzyme và khả năng sản sinh độc tố của các gen tdh, trh
và ure. Trƣớc đây, khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus đƣợc cho là có liên
quan tới kiểu hình Kangawa (KP) [54]. Kato và cs [24] đã tiến hành nghiên cứu và
thấy rằng các chủng V. parahaemolyticus phân lập đƣợc từ phân của bệnh nhân
nhiễm trùng đƣờng ruột có khả năng ly giải hồng cầu trên môi trƣờng thạch máu có
nồng độ muối đặc biệt. Trong khi đó, các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ
hải sản hoặc môi trƣờng nƣớc mặn lại không có khả năng này. Wagatsuma [60] sau

24


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học



25


Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Nguyễn Hoài Thu

Tuy tầm quan trọng của phản ứng Kanagawa và protein TDH ở các chủng V.
parahaemolyticus đã đƣợc nghiên cứu chứng minh, các chủng V. parahaemolyticus
KP âm tính đôi khi vẫn gây ra các vụ tiêu chảy. Honda và cs (1987,1988) đã đƣa ra
báo cáo về một số chủng V. parahaemolyticus KP âm tính vẫn gây bệnh cho ngƣời.
Những chủng này có khả năng sản sinh ra một loại protein ly giải hồng cầu có liên
quan đến TDH và đƣợc định danh là TRH. Protein này gần giống nhƣng không
tƣơng đồng với protein TDH và đƣợc tìm thấy đầu tiên ở chủng V.
parahaemolyticus O3:K6 [54]. Thêm vào đó, protein ly giải hồng cầu mới này lại có
ở hầu hết các chủng ngoại cảnh phân lập đƣợc và có khả năng gây chết chuột thí
nghiệm khi tiêm vào màng bụng chuột [49]. Gen chỉ đạo việc tổng hợp ra protein
này đƣợc định danh là trh. Gen này cũng có hải biến thể là trh 1 và trh 2. Khi so
sánh tdh và trh, ngƣời ta nhận thấy trình tự nucleotid của hai gen này tƣơng đồng
tới 69%, điều này dẫn đến giả thuyết có thể hai gen này bắt nguồn từ một gen
chung [39]. Một số chủng lâm sàng chứa cả hai gen tdh và trh, trong khi đó các
chủng ngoại cảnh hầu hết đều không có hai gen này [62]. Trong một loạt các thí
nghiệm đột biến mất đoạn, các nhà khoa học đã làm mất một phần hoặc toàn bộ gen
trh và quan sát thấy hoạt tính ly giải hồng cầu của protein này không còn nữa. Tuy
nhiên, một cách nào đó, những đột biến này vẫn còn có khả năng gây độc tế bào
trên thực nghiệm và là nguyên nhân gây ra tình trạng tích nƣớc cục bộ ở đoạn thắt
của ruột non thỏ. Điều này cho thấy có những nhân tố gây độc khác ngoài TDH và
TRH có liên quan đến khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus. Tuy nhiên theo
khuyến cáo của CDC gần đây, các chủng V. parahaemolyticus không có cả hai gen