1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Lycopene là sắc tố màu đỏ cam thuộc nhóm carotenoid được sử dụng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Trong tự nhiên lycopene có
trong các loại quả như cà chua, cà rốt, gấc. Sắc tố này có khả năng bảo vệ tế bào
khỏi sự oxi hóa làm chậm quá trình phát triển của một số bệnh ung thư tiền liệt
tuyến, ruột kết, thực quản và ngăn ngừa bệnh tim mạch [27]. Cơ thể con người
không có khả năng tự tổng hợp được lycopene mà chỉ hấp thu chất này từ thực
phẩm hoặc dược phẩm chứa lycopene. Nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan giữa
tiêu thụ cà chua mà trong đó có chứa lycopene với ung thư, nghiên cứu cho thấy
nhóm người sử dụng khẩu phần ăn nhiều cà chua có tỷ lệ mắc ung thư thấp hơn
[59].
Lycopene đã được sản xuất thương mại bằng tổng hợp hóa học, lên men hoặc
tách từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên [33]. Tuy nhiên những phương pháp này có
những nhược điểm nhất định như tạo nhiều chất thải gây ô nhiễm môi trường, phụ
thuộc thời vụ, hiệu quả kinh tế thấp. Vì vậy việc sử dụng vi sinh vật để tổng hợp
lycopene thân thiện với môi trường và đem lại hiệu quả kinh tế cao đang được quan
tâm nghiên cứu [39].
Lycopene được tổng hợp từ tiền chất isoprenoid là IPP và đồng phân DMAPP
[11]. Con đường sinh tổng hợp lycopene từ tiền chất DMAPP trải qua các bước
chuyển hóa dưới sự xúc tác của các enzyme isopentenyl diphosphate isomerase,
geranylgeranyl

pyrophosphate

synthetase,

phytoene

- Biến nạp vector pR-iEIB vào chủng vi khuẩn E. coli BL21, biểu hiện 4 gen
idi, crtE, crtI, crtB tạo lycopene
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Tách dòng và xác định trình tự các gen crtE, crtI, crtB từ vi khuẩn
P.ananatis và gen idi từ vi khuẩn E.coli .
- Nhân dòng gen idi sử dụng cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR từ vi khuẩn
E. coli. Nhân dòng gen carotenoid crtE, crtI, crtB sử dụng cặp mồi đặc hiệu bằng
phản ứng PCR từ vi khuẩn P. ananatis.
- Tạo dòng các gen: Gắn gen vào vector tách dòng pLUG bằng enzyme T4
DNA ligase, biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E. coli DH5α khả biến. Chọn lọc
dòng bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn. Xác định trình tự gen bằng phương
pháp giải trình tự.
Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện pRSET-iEIB chứa các gen idi, crtE, crtI,
crtB. Dựa trên cơ sở phân tử của con đường sinh tổng hợp lycopene trong vi khuẩn


3

E. coli và nền tảng vector pRSET-A cùng với các gen đã được tách dòng ở trên,
thiết kế vector pRSETA-iEIB
Nội dung 3: Biến nạp vector pR-iEIB vào E. coli BL21(DE3). Cảm ứng biểu hiện 4
gen idi, crtE, crtI, crtB tạo lycopene màu hồng đỏ.
Nội dung 4: Định tính định lượng lycopene thu được bằng phương pháp sắc ký
lỏng cao áp (HPLC).


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm [59]. Một số
carotenoid được sử dụng làm phụ gia thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (bảng 2.2).
Bảng 1.1: Một số carotenoid được sử dụng làm phụ gia trong thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi [45].
Nguồn thu nhận
Carotenoids

Vai trò

Động thực vật

Vi sinh vật

β-carotene

Cΰ rốt

Blakeslea trispora
Dunaliella salina

Lycopene

Cà chua

Blakeslea trispora Streptomyces Tạo màu
chrestomyceticus
thựcphẩm


Thức ăn
gia cầm

Thức ăn
cho cá

Vì vai trò của carotenoid đối với sức khỏe con người, nhu cầu về các hợp chất
này ngày càng cao. Theo báo cáo, năm 1999, thị trường carotenoid toàn cầu là 786
triệu USD; năm 2004 là 887 triệu USD. Năm 2008 là 766 triệu USD, dự tính đến
năm 2015 sẽ tăng lên 919 triệu USD, tỷ lệ tăng trưởng hàng năm là 2,3%. Đặc biệt
thị trường của β-carotene trong năm 2007 là 247 triệu USD và dự tính đến 2015 sẽ
đạt 285 triệu USD (BCC, 2008).


6

Hình 1.1: Biểu đồ đánh giá thị trường carotenoid toàn cầu năm 2007 và 2015
(BCC, 2008)

1.2. Sắc tố lycopene
1.2.1. Cấu trúc và tính chất của lycopene
Lycopene là sắc tố màu đỏ thuộc lớp hydrocarbon carotene của nhóm
carotenoid, là một tetreterpene hydrocarbon có chứa 40 nguyên tử carbon và 56
nguyên tử hydro, công thức phân tử là C40H56, phân tử lượng là 536 [47].
Lycopene là hydrocarbon béo, ở dạng rắn có màu đỏ đậm, không tan trong
methanol, ethanol, nước nhưng tan trong chloroform, benzen và ete, nhiệt độ nóng
chảy là 172-1730C. Trong phân tử lycopene có chứa 11 liên kết đôi liên hợp và 2
liên kết đôi không liên hợp (hình 1.1). Do có cấu trúc mạch hở và không có vòng βion mà lycopene không có hoạt tính tiền vitamin A như α, β-carotene. Sắc tố này có
khả năng hấp thu ánh sáng cực đại ở 444,47 và 502nm, có khả năng nhận năng
lượng từ các điện tử ở trạng thái kích thích [42].

1.2.2.1. Vai trò của lycopene đối với sức khỏe con người
Lycopene không phải là chất dinh dưỡng, nhưng thường được tìm thấy trong
chế độ ăn uống, chủ yếu là các món ăn chế biến từ cà chua. Trong cơ thể người
lycopene được hấp thụ qua thức ăn, khi đến ruột non lycopene được hòa tan nhờ
muối mật và các mixen lipid tạo thành những vi nang, sau đó được hấp thu qua cơ
chế vận chuyển thụ động [48]. Lycopene chủ yếu được tích tụ trong gan, túi tinh
dịch và tuyến tiền liệt [68], (bảng 1.2) sự tích lũy lycopene trong cơ thể.
Bảng 1.2: Phân phối lycopene trong cơ thể người [61]
Phân phối lycopene trong cơ thể
Mô

nmol/g trọng lượng ướt

Gan

1,28-5,72

Thận

0,15-0,62

Thượng thận

1,9-21,6

Tinh hoàn

4,34-21,4

Buồng trứng

tiền liệt, do đó giảm được nguy cơ mắc bệnh này [28].
Vai trò trong ngăn ngừa bệnh tim mạch:
Bệnh tim mạch là một trong những nguyên nhân dẫn tới tử vong của con
người, mà nguyên nhân chính là do mỡ trong máu bị oxi hóa. Lycopene có chức
năng điều tiết cholesterol do đó có tác dụng phòng ngừa chứng xơ cứng động mạch.
Hàm lượng lycopene trong cơ thể cao thì nguy cơ mắc bệnh tim mạch sẽ giảm, nếu
mỗi ngày dùng 60mg lycopene có thể làm giảm 14% cholesterol trong huyết tương
[7], [26], [37].
Vai trò tăng cường khả năng miễn dịch:
Chức năng chống oxi hóa của lycopene có khả năng điều tiết hệ miễn dịch bảo
vệ thực bào khỏi sự tự oxi hóa, kích thích khả năng đáp ứng miễn dịch, làm tăng
cường đại thực bào và tế bào tiêu độc, do đó nâng cao khả năng miễn dịch của cơ
thể. [31], [49], [64].
Vai trò giảm nguy cơ bị khối u:
Tác dụng chống oxi hóa của lycopene có thể giúp giảm sự đột biến của DNA,
từ đó dẫn đến giảm nguy cơ mắc bệnh khối u. Hàm lượng lycopene trong huyết
thanh của người mắc khối u thấp hơn so với người bình thường [23], [50]. Trong
nhóm carotenoid, lycopene là nhân tố chính trong việc ngăn ngừa ung thư và tiêu
diệt các khối u [27].
1.2.2.2. Vai trò của lycopene trong công nghiệp
Trong công nghiệp lycopene được sử dụng rộng rãi, mức độ bổ sung lycopene
trong một số loại thực phẩm được thể hiện trong bảng 1.3


10

Bảng 1.3: Mức độ sử dụng lycopene công nghiệp thực phẩm (Theo thống kê
của Công ty các sản phẩm dinh dưỡng DSM) [15]
Thực phẩm



Đồ ăn sẵn làm từ ngũ cốc

30-130

Bánh mỳ khô

60

Bánh ngọt

30

Súp

30

Salad trộn

30

Nước xốt cà chua

30

Nước ép trái cây

4-20

1.2.3. Con đường sinh tổng hợp lycopene trong tự nhiên

acetoacetyl-CoA và β-hydroxy-β-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA), cuối
cùng tạo thành IPP và đồng phân DMAPP.
Quá trình tổng hợp lycopene từ tiền chất IPP diễn ra bằng các phản ứng ngưng
tụ liên tiếp của các tiền chất IPP và DMAPP làm cho chuỗi polyprenyl diphosphate
kéo dài ra. Geranyl diphosphate (GPP, 10C) và farnesyl diphosphate (FPP, 15C)
được tổng hợp bởi enzyme FPP synthase do gen ispA mã hóa. Geranylgeranyl
diphosphate (GGPP, 20C) được xúc tác bởi enzyme GGPP synthase do gen crtE mã
hóa. Hợp chất không màu phytoene (40 cacbon) được tạo thành bằng phản ứng kết
hợp hai phân tử GGPP xúc tác bởi enzyme phytoene synthase do gen crtB mã hóa.
Tiếp theo là phản ứng chuyển phytoene từ trạng thái no trở thành không no nhờ
enzyme phytoene desaturase do gen crtI mã hóa làm xuất hiện bốn liên kết đôi, tạo
thành hợp chất lycopene có màu đỏ [17].
1.2.4. Các phương pháp sản xuất lycopene hiện nay
1.2.4.1. Sản xuất lycopene từ thực vật
Lycopene có trong ổi, đu đủ, bưởi đỏ, dưa hấu và một số thực phẩm có màu đỏ
khác như cà chua, gấc [51].
Bảng 1.4 : Hàm lượng lycopene trong một số loại rau quả [51]
Hàm lượng lycopene trong một số loại rau quả
Nguồn
Gấc

µg/g trọng lượng ướt
200-230

Cà chua quả

8,8-42

Bưởi đỏ


cách để ở môi trường chân không 40-600C. Sản phẩm lycopene thu được là một
chất lỏng nhớt, màu đỏ đậm. Lycopene chiết xuất từ cà chua có thể phân tích bằng
phương pháp HPLC [40].
Lycopene chiết xuất từ cà chua hay các loại quả khác có thể chứa dư lượng
ethyl acetate, được sử dụng trong chiết xuất. Quá trình tách chiết còn tạo ra chất thải
gây ô nhiễm như kim loại nặng và asen [40]. Ngoài ra, phương pháp trên còn có
một số nhược điểm như phụ thuộc mùa vụ, tốn diện tích đất gieo trồng. Do vậy, cần
tìm ra phương pháp mới hiệu quả hơn, đồng thời khắc phục những nhược điểm của
phương pháp trên.
1.2.4.2. Sản xuất lycopene bằng phương pháp tổng hợp hóa học
Đến nay, cùng với các carotenoid khác như ß-carotene, canthaxanthin,
astaxanthin, ß-apo-8′-carotenal, ethyl-ß-apo-8′-carotenoate và citranaxanthin th́
lycopene cũng được tổng hợp bằng phương pháp hóa học ở quy mô công nghiệp
[20]. Các chất này hầu hết được sản xuất bằng cách tổng hợp các cấu trúc đối xứng,
tức là có sự biến đổi đồng nhất các nhóm cuối. Phương pháp hiệu quả nhất để xây
dựng các cấu trúc đối xứng là sự ngưng tụ Wittig kép giữa một dialdehyde C10 đối
xứng đóng vai trò như là đơn vị cấu thành cơ bản tương đương của một muối
phosphonium-C15 thích hợp.
Vật liệu khởi đầu sử dụng trong tổng hợp lycopene là (E/Z)-pseudoionone có
chứa 13 nguyên tử carbon và chưng cất tạo pseudoionone-(E) nguyên chất. Quá
trình kéo dài thêm hai nguyên tử carbon để tạo ra đơn vị cấu thành cơ bản C15 (E)-


14

vinyl pseudoionone được thực hiện qua chuỗi phản ứng gồm hai bước: ethynyl hóa
và hydro hóa phần tiếp theo. Bước tiếp theo trong quá trình tổng hợp lycopene là
việc sắp xếp lại các (E)-vinyl pseudoionone để tạo thành muối C15-phosphonium
lycopene, đây là bước rất quan trọng. Sau đó các đồng phân lập thể (Z) hình thành
tại ba nhóm thế của các liên kết đôi ở vị trí (5)/(6) và (5’)/(6’) trong chuỗi polyene,

hợp các carotenoid trong các vật chủ mà bản thân chúng không chứa các gen này
[55]. Một số carotenoid đã được sản xuất thành công trong các vi sinh vật dị
carotenoid như: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, và
Zymomonas mobilis, bằng cách biến nạp các gen tham gia sinh tổng hợp các
carotenoid từ các vi sinh vật khác [44].
Điều hướng trao đổi chất đã được nghiên cứu áp dụng làm tăng cường sự biểu
bằng cách đưa các gen crt của P. ananatis vào vi khuẩn E. coli cùng với gen dxs để
tăng cường sự biểu hiện của tiền chất IPP, hàm lượng lycopene thu được là 1,33
mg/l [41]. Kết hợp các gen crt của P. ananatis đồng thời tăng cường tổng hợp tiền
chất IPP bằng cách đưa gen idi và các gen mvaK1, mvaK2, mvaD của con đường
mevalonate vào E. coli nhằm tăng cường biểu hiện của đồng loạt các gen tổng hợp
các tiền chất, tăng cường biểu hiện lycopene (Hình 1.5).


16

Hình 1.5: Con đường tổng hợp lycopene trong E. coli sử dụng các gen
ngoại lai [67].
Sử dụng kỹ thuật điều hướng trao đổi chất, các nhà khoa học đã nghiên cứu và
tăng cường biểu hiện lycopene trong một số vật chủ khác nhau (bảng 1.5)
Bảng 1.5: Sử dụng kỹ thuật điều hướng trao đổi chất sản xuất lycopene trong
một số vi sinh vật
Sinh vật chủ

Lycopene (mg/g

Nguồn tài liệu tham khảo

DCW)
Escherichia coli

6,60

Escherichia coli

22,0

Escherichia coli

16,0

[67]
[32]

Escherichia coli

27,7

[66]

[36]
[35]
[5]
[6]


17

Điều hướng trao đổi chất ở vi sinh vật sản xuất một cách hiệu quả các hợp chất
carotenoid và có những ưu điểm như : thân thiện với môi trường, giảm chi phí cho
quá trình sản xuất, hiệu quả kinh tế cao.


Phytoene desaturase

Lycopene

CrtY

Lycopene cyclase

β-carotene

CrtZ

β-carotene hydroxylase

zeaxanthin

CrtX

Zeaxanthin
glucosyltransferase

Zeaxanthin-β-diglucoside

Thứ tự các gen tổng hợp các carotenoid trong con đường sinh tổng hợp
lycopene trong vi khuẩn này được thể hiện trong hình 1.6.


18


sử dụng TrcDx-idi hàm lượng lycopene đạt 12.85 mg/l [13].
1.5. Tình hình nghiên cứu về lycopene trong và ngoài nước
1.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Sắc tố lycopene và các carotenoid được sự quan tâm nghiên cứu từ trước thể
kỷ XX, nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về bản chất hóa học, các tính chất của
carotenoid và phân lập tách chiết carotenoid từ các nguồn trong tự nhiên. Năm
1875, Millardet chiết xuất được lycopene thô từ cà chua, nhưng không phân biệt
được rõ với các carotenoid khác. Năm 1910, Willstaller và Escher nghiên cứu chất
lycopene và lần đầu tiên xác định được công thức hóa học là C40H56 và khối lượng
phân tử của nó là 536,85. Cho đến năm 1985, Colditz và cộng sự đã nghiên cứu về
chức năng của các hợp chất carotenoid có trong các loại rau quả và đã phát hiện ra
rằng lycopene có khả năng ngăn ngừa ung thư và phòng chống bệnh tim mạch. Từ
đó, con người bắt đầu nghiên cứu chiết xuất lycopene trực tiếp từ các nguồn sẵn có
trong tự nhiên như: từ thực vật, nấm, tảo và tổng hợp chất này bằng phương pháp
hóa học.


20

Năm 1990, Misawa và cộng sự đã tách dòng và xác định trình tự các gen crt
tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ con đường
sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn P. ananatis bằng cách sử dụng phương
pháp điều hướng trao đổi chất biến nạp các gen crtE, crtB, crtI vào vi khuẩn E. coli
tạo ra lycopene và phân tích chức năng sản phẩm do các gen đó mã hóa [42].
Từ đó, có nhiều nghiên cứu khác nhau về điều hướng trao đổi chất nhằm tăng
cường tổng hợp lycopene. Năm 1998, Miura đã sử dụng các gen carotenoid từ vi
khuẩn P. ananatis và A. aurantiacum biến nạp vào chủng nấm C. utilis, tạo ra
lycopene với hàm lượng 1,1 mg/g trọng lượng khô tế bào [44]. Năm 2000, Famer đã
tiến hành đưa các gen crt cùng với các gen dxs, idi và gps vào E. coli nhằm tăng
cường biểu hiện của đồng loạt các gen tổng hợp các tiền chất lycopene, sử dụng

ký lỏng cao áp (HPLC). Kết quả cho thấy hàm lượng β-carotene có nhiều trong rau
ngót, bí đỏ, rau sam, và nhiều nhất là trong lá đu đủ (57,059%); hàm lượng lutein có
nhiều nhất ở lá đinh lăng (50,762%); hàm lượng lycopene có nhiều nhất ở quả cà
chua (22,483%) [4].
Nghiên cứu chiết xuất tinh chế và xác định bản chất hóa học, hoạt tính sinh
học của một vài carotenoid từ một số cây cỏ Việt Nam dùng trong sản xuất thuốc và
thực phẩm thuốc [3].
Năm 2010, Bùi Minh Giao Long và cộng sự khảo sát đối với 54 chủng vi khuẩn
có màu được phân lập từ các mẫu đất, cát ở biển và hồ nuôi tôm (biển Vũng Tàu, Phan
Thiết, Long Hải; suối nước nóng Bình Châu; hồ tôm ở Cần Giờ và Bình Thuận), đã
chọn được 5 chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp carotenoid. Các chủng này đều có
hoạt tính chống oxi hóa (thử nghiệm DPPH) lớn hơn 50%. Kết quả giải trình tự 16S
rDNA cho thấy các chủng này đều thuộc chi Bacillus, bao gồm Bacillus firmus,
Bacillus indicus, Bacillus catenulatus, Bacillus aquimaris, Bacillus marisflav [1].
Khi phân tích các carotenoid ở thịt quả và màng hạt trong trái Gấc Việt Nam
cũng bằng phương pháp HPLC, các tác giả đã chỉ ra trong trái Gấc chứa một lượng
carotenoid khá lớn, nhất là ở màng hạt gấc. Trong một gam thịt quả gấc (phần có
màu vàng) chứa 7-37 µg β-carotene, 0.2-1.6 µg lycopene. Khi tách chiết bằng
phương pháp xà phòng hóa thì một gam thịt quả chứa 4-26 µg β-carotene, 0.1-0.7
µg lycopene, 1-2µg zeaxanthin, 2-5 µg β-cryptoxanthin. Trong một gam màng hạt
gấc chứa 310-460 µg lycopene, 60-140 µg β-carotene. Khi xà phòng hóa mẫu thì
lượng lycopene trong màng hạt gấc là 300-400 µg, lượng β-carotene là 50-110 µg,
lượng zeaxanthin là 5-13 µg. Các tác giả cũng cho rằng nồng độ lycopene trong
màng hạt gấc gấp từ 4-10 lần so với lượng lycopene trong một số rau quả được cho
là giàu lycopene [2].


22

Năm 2007, “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc


BamHI
R-crtE5’cctcgagTAACTGACGGCAGCGAGT3’
XhoI
F-crtI5’actcgaggaggGCGACTACATGAAACCAACTAC3’
XhoI

crtI

R-crtI5’cggtaccTCAAATCAGATCCTCCGC3’
KpnI
FcrtB5’aggtaccaggaggGATCTGATATGAATAATCCGTCGTTA3’

crtB

KpnI
R-crtB5’tgaatccCTAGAGCGGGCGCTGCCA3’
EcoRI

Dựa vào trình tự nucleotide gen idi, crtE, crtB, crtI được công bố trên ngân
hàng gen NCBI mã số tương ứng lần lượt là CP002729.1, NC-013956.1
(4608461...4609396),

NC-013956.1

(4611845...4613323),

NC-013956.1

(4613320...4614249), chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân trình tự

Agarose Gel Extraction của hãng INTRON BiotechnologyTM (Hàn Quốc)
- Hóa chất cho phản ứng gắn nối gen vào vector tách dòng: Bộ Kit pLUG®
TA-cloning Kit của hãng iNtRON BiotechnologyTM (Hàn Quốc), các thành phẩn
bao gồm: 5X Ligation Buffer, T4 DNA Ligase, nước cất khử ion, vector tách dòng
pLUG® TA-cloning.
Vector pLUG là vector tách dòng TA có kích thước 2982 bp, cấu trúc của
vector được thiết kế bao gồm một gen kháng kháng sinh Amp và một gen LacZα có
chứa vị trí đa tách dòng. Gen kháng kháng sinh ampicilin (Amp resistant gen) mã
hóa cho enzyme phân giải kháng sinh ampicilin, do đó các tế bào mang vector
pLUG có thể sống sót và phát triển trên môi trường có ampicilin.
Vị trí của gen LacZα được thiết kế bao gồm cả vị trí đa tách dòng, chứa vị trí
cắt của 11enzyme giới hạn: SacI, NotI, XbalI, BamHI, SamI, PstI, EcoRI, HindIII,
HindIII, SacI, KpnI. Với các tế bào chủ mang vector pLUG tự đóng vòng hay không
có sự gắn xen, Lac-operon hoạt động bình thường. Trong môi trường có IPTG Lacpromoter sẽ được kích hoạt quá trình phiên mã xảy ra, sau đó là quá trình dịch mã
tổng hợp enzyme β-Galactosidase. Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa
cơ chất X-gal thành chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các tế bào này
có màu xanh. Trường hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac-Operon bị phá vỡ do gắn
xen thành công, dẫn đến enzyme β- Galactosidase không được tổng hợp, không có
sự phân giải cơ chất X-gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng. Các khuẩn lạc
màu trắng là những khuẩn lạc mong muốn trong chọn lọc dòng.