BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
*****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ.

Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ HẠNH DUNG
Lớp: DH07DY
Ngành: Dược Thú Y
Niên khóa: 2007-2012

Tháng 08/2012


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

LÊ THỊ HẠNH DUNG

PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y

Giáo viên hướng dẫn

Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Cơ Bản, Ban Chủ Nhiệm
Khoa Chăn Nuôi Thú Y và cùng toàn thể quý thầy cô khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo
mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông Lâm cùng
toàn thể cán bộ công nhân viên đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cám ơn các bạn trong và ngoài lớp đã cùng tôi học tập giúp đỡ nhau trong
suốt quãng đời sinh viên.
Xin chân thành cảm ơn!
Lê Thị Hạnh Dung

iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài “Phân lập Escherichia coli và xác định đặc tính gây bệnh của vi
khuẩn này trên gà” được tiến hành tại Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông
Lâm Tp.HCM, thời gian từ ngày 25/11/2011 đến 4/05/2012.
Phân lập vi khuẩn E. coli trên 36 mẫu bệnh phẩm (túi khí) trên những gà có
bệnh tích điển hình và gà không có bệnh tích điển hình do E. coli được đem đến mổ
khám tại Bệnh Viện Thú Y. Kết quả ghi nhận tỉ lệ dương tính với E. coli là 21/36
(58,33 %).
Sau đó thử kháng sinh đồ của 21 gốc E. coli phân lập được với 13 loại kháng
sinh, đa số đề kháng cao với một số kháng sinh như trimethoprim/ sulfamethoxazone
(85,72 %); ampicillin, amoxicillin và tetracycline (76,19 %); kanamycin và
doxycycline (71,43 %) và chỉ còn nhạy với một số kháng sinh như neltimicin (95,24
%), colistin (90,48 %), tobramycin (80,96 %), gentamycin (66,67 %), cephalexin
(52,38 %). Vi khuẩn kháng trung bình với cefuroxine (66,67 %).
Tiến hành chọn ra 15 gốc E. coli phân lập được tiêm truyền trên phôi trứng
12 - 13 ngày tuổi xác định độc lực. Trong đó, có 10 gốc có độc lực cao chiếm tỉ lệ
66,67 %, 4 gốc độc lực trung bình 26,67 % và 1 gốc không có độc lực 6,66 %. Tỉ lệ

2.1.2.4 Sức đề kháng ................................................................................................................ 5
2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố ................................................................................. 5
2.1.3.1 Cấu trúc kháng nguyên ............................................................................................... 5
2.1.3.2 Độc tố ............................................................................................................................ 6
2.1.3.3. Tính chất gây bệnh ..................................................................................................... 7
2.2 Bệnh do E. coli trên gà ...................................................................................................... 8
2.2.1 Truyền nhiễm học ........................................................................................................... 8
2.2.1.1 Động vật cảm thụ ........................................................................................................ 8
2.2.1.2 Chất chứa căn bệnh ..................................................................................................... 8

v


2.2.1.3 Phương thức truyền lây............................................................................................... 8
2.2.1.4 Đường xâm nhập ......................................................................................................... 9
2.2.2 Cơ chế sinh bệnh............................................................................................................. 9
2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích ............................................................................................... 9
2.2.3.1 Triệu chứng .................................................................................................................. 9
2.2.3.2 Bệnh tích.................................................................................................................... 10
2.2.4 Chẩn đoán ...................................................................................................................... 10
2.2.5 Phòng và điều trị bệnh ................................................................................................. 10
2.3 Giới thiệu phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)........................................ 11
2.3.1 Giới thiệu ....................................................................................................................... 11
2.3.2 Nguyên tắc chung ......................................................................................................... 12
2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR ............................................................................... 12
2.3.4 Thành phần phản ứng PCR.......................................................................................... 12
2.3.5 Kiểm tra kết quả PCR .................................................................................................. 13
2.3.6 Ứng dụng của phương pháp PCR ............................................................................... 13
2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................................................... 13
2.4.1 Trong nước .................................................................................................................... 13

4.4 Kết quả kiểm tra một số gene độc lực của vi khuẩn E. coli ....................................... 45
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 47
5.1 Kết luận ............................................................................................................................. 47
5.2 Đề nghị ............................................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 48
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 51

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APEC: Avian pathogenic Escherichia coli
BA: Bool Agar
BHI: Brain Heart infusion Broth
CFU: Colony – forming units
CRD: Chronic Respiratory Disease
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphat
EMB: Eosin Methylen Blue
EPEC: Enteropathogenic E. coli
ETEC: Enterotoxigenic E. coli
EIEC: Enteroinvasie E. coli
IMViC: Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simon’s Citrate
LT: Heat labile toxin
LPS: Lipopolysaccharide
MCK: Mac Con Key
NA: Nutrient agar
SLT: Shiga Like Toxin
ST: Heat stable toxin
KIA: Kligler iron agar

DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ
Hình 2.1 Hình vi khuẩn E. coli ..................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc kháng nguyên E. coli ....................................................................... 5
Hình 4.1 Khuẩn lạc E. coli có màu tím ánh kim trên môi trường EMB ..................... 32
Hình 4.2 Kết quả kháng sinh đồ .................................................................................. 35
Hình 4.3 Bệnh tích đại thể trên phôi gà ...................................................................... 39
Hình 4.4 Gà có triệu chứng bệnh do E. coli. ............................................................... 41
Hình 4.5 Bệnh tích đại thể trên gà thí nghiệm ............................................................ 42
Hình 4.6 Tim xuất huyết nhiều ................................................................................... 44
Hình 4.7 Viêm phổi lan rộng....................................................................................... 44
Hình 4.8 Lách sung huyết ........................................................................................... 44
Hình 4.9 Túi khí dày tích casein ................................................................................. 44
Hình 4.10 Thận sung huyết, xuất huyết ..................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.11 Biểu mô ruột bong tróc .............................................................................. 44
Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của fimC và iucD ........................... 45
Sơ đồ 3.1 Các bước tiến hành thí nghiệm ................................................................ 188 
Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli ............................................................. 20 
Sơ đồ 3.3 Cách pha huyễn dịch vi khuẩn E. coli ........................................................ 23 
Sơ đồ 3.4 Quy trình thử nghiệm độc lực vi khuẩn trên phôi trứng ............................. 24 

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Escherichia coli là một tác nhân gây bệnh chủ yếu trong chăn nuôi gia cầm,
được xem là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành
chăn nuôi gà công nghiệp trên toàn thế giới. Bệnh xảy ra ở gà mọi lứa tuổi, làm
giảm tỉ lệ ấp nở, giảm tỉ lệ đẻ, giảm tăng trọng, làm tăng tỉ lệ chết, tăng chi phí sản

1.2 Mục đích và yêu cầu
Mục đích
Phân lập và xác định đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli làm cơ sở cho
công tác chẩn đoán và phòng trị bệnh có hiệu quả.
Yêu cầu
Nắm được những đặc điểm cơ bản về bệnh E. coli trên gà, các yếu tố gây
bệnh.
Nắm được phương pháp, qui trình chẩn đoán trong phòng thí nghiệm về bệnh
E. coli trên gà.
Phân lập các gốc E. coli trên gà có bệnh tích điển hình và không điển hình do
E. coli gây ra.
Xác định độc lực của các gốc E. coli phân lập được qua phôi trứng gà 12-13
ngày tuổi và gà con 1 ngày tuổi. Ghi nhận bệnh tích đại thể và vi thể trên gà sau khi
tiêm các gốc vi khuẩn E. coli phân lập được.
Xác định các gene độc lực của các gốc E. coli có khả năng gây bệnh.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
2.1.1 Đại cương
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn Eschesrichia
coli (E. coli) thuộc:
Lớp: Schyzomycetes
Bộ: Eubacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Tộc: Escherichiae
Giống: Escherichia

sinh hơi, không sinh khí H2S. Môi trường Brilliant green agar (BGA) tạo khóm
xanh lá mạ.
2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa
E. coli lên men sinh hơi đường glucose, lactose, manitol, galactose. E. coli
lên men không sinh hơi đường maltose, arabinose, lên men hay không lên men
đường saccarose, không lên men dextrin, glycogen, salisin amidon, ít khi lên men
inulin, pectin. Phản ứng IMViC: ++-- (indol +, methylred +, voges proskauer -,
citrate -).

4


2.1.2.4 Sức đề kháng
E.coli bị tiêu diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ, 600C trong 15 - 30 phút, 95%
bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ. Trong tự nhiên có thể tồn tại từ vài tuần
đến 1 tháng, chủng độc lực cao có thể tồn tại trên 4 tháng.
Vi khuẩn này dễ dàng bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường như: acid
fenic, HgCl2, formol trong 5 phút, có khả năng chịu đựng được các yếu tố lý hóa
cao hơn các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella (Tô Minh Châu và Trần Thị
Bích Liên, 2006).
2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
2.1.3.1 Cấu trúc kháng nguyên

Hình 2.2. Cấu trúc kháng nguyên E. coli
( />Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), cấu trúc kháng nguyên
của vi khuẩn E. coli phức tạp, gồm 4 loại: O, H, K và F.
Kháng nguyên thân O (Ohn)
Kháng nguyên thân O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS), có trên 160
loại phân bố trong vách tế bào. Kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn, không
bị phân hủy ở nhiệt độ 100 - 1200C trong 2 giờ, các chất có cồn, acid HCl 1 N chịu

Kháng nguyên H (Hauch)
Bản chất là protein, có 60 loại, chịu nhiệt thấp, 1000C trong 2 giờ thì mất tính
chất kháng nguyên, phần lớn E. coli có chung type kháng nguyên này.
2.1.3.2 Độc tố
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn E. coli sinh các
độc tố sau:
Nội độc tố (endotoxin): được sinh ra khi vi khuẩn bị tiêu diệt.

6


Ngoại độc tố (exotoxin)
Là độc tố mà vi khuẩn E. coli tiết ra bao gồm: enterotoxigenic E. coli
(ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E. coli (EIEC),….
Ngoại độc tố làm tan huyết. Loại độc tố này hướng mạch máu, gây nên hiện
tượng phù thũng.
Ngoài ra, E. coli còn tiết một số độc tố khác như: cytotoxin, haemolysin.
2.1.3.3. Tính chất gây bệnh
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), ngày nay người ta chia
E. coli gây bệnh ra làm nhiều nhóm và tùy thuộc vào độc lực của chúng.
Gồm có 3 nhóm chính:
E. coli độc tố ruột: enterotoxigenic E. coli (ETEC), E. coli gây bệnh tích ở
ruột: enteropathogenic E. coli (EPEC), E. coli xâm lấn ruột: enteroinvasive E. coli
(EIEC).
Và một số nhóm khác như: Vasotoxin E. coli hay verotoxin (VTEC), Avian
panthogenic E. coli (APEC).
Enterotoxigenic E. coli (ETEC): đây là độc tố được nói đến nhiều nhất và nó
được xem là nguyên nhân gây tiêu chảy thông thường trên thú non (độc tố đường
ruột), có 2 loại:
LT (heat labile enterotoxin): độc tố đường ruột không chịu nhiệt, gây tiêu

gà ở giai đoạn chuẩn bị đẻ.
Trong phòng thí nghiệm chuột lang, chuột bạch và thỏ đều mẫn cảm khi tiêm
canh trùng dưới da gây viêm cục bộ, nếu tiêm liều lớn gây bại huyết và giết chết
con vật.
2.2.1.2 Chất chứa căn bệnh
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), trên gà vi khuẩn có trong
gan, lách, tủy xương, buồng trứng, túi khí,… ngoài ra vi khuẩn còn có trong con
khỏe mang trùng. Trong tự nhiên vi khuẩn tồn tại khắp nơi: nền chuồng, thức ăn,
nước uống, chất độn chuồng. Ngoài ra, vi khuẩn còn hiện diện trong bụi nền
chuồng, trong điều kiện khô vi khuẩn tồn tại rất lâu.
2.2.1.3 Phương thức truyền lây
Các con đường lây bệnh chủ yếu của vi khuẩn E. coli là truyền lây qua trứng
do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, qua vỏ trứng do bị nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường

8


chuồng trại bị nhiễm trùng, qua đường hô hấp do gà bị bệnh CRD làm cho niêm
mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua vết thương. Truyền
lây qua thức ăn và nước uống nhiễm trùng.
2.2.1.4 Đường xâm nhập
Bệnh do E. coli lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa do ăn phải thức ăn, nước
uống có chứa mầm bệnh. Bệnh có thể lây nhiễm qua đường hô hấp, niêm mạc mắt.
Bệnh có thể lây nhiễm qua đường hô hấp do gà bị nhiễm CRD (Chronic
Respirstory Disease) làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập
qua vết thương vào cơ thể.
Bệnh truyền lây qua trứng do gà mẹ bị nhiễm bệnh. Vi khuẩn xâm nhập qua
vỏ trứng do vỏ trứng bị nhiễm bẩn từ phân hoặc từ môi trường chuồng trại bị nhiễm
trùng.
2.2.2 Cơ chế sinh bệnh

Niêm mạc dày lên, sung huyết, xuất huyết.
Khớp sưng, tích dịch.
Lách, thận sưng chuyển màu sậm hay nhạt hơn.
Theo Nguyễn Thị Phước Ninh (2010) trường hợp gà bị CRD kết hợp với E.
coli thì sẽ gây viêm túi khí nặng, fibrin hoặc fibrin mủ, viêm màng bao tim và màng
bao quanh gan, trên gà đẻ có casein bao phủ lên buồng trứng.
2.2.4 Chẩn đoán
Dựa trên đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và đặc điểm bệnh tích quan
sát được sau khi mổ khám gà bệnh sau đó lấy bệnh phẩm xét nghiệm và phân lập vi
khuẩn.
Chú ý cần phân biệt với các bệnh có triệu chứng lâm sàng gần giống như
bệnh bạch lỵ, thương hàn, bệnh phó thương hàn và cần phân biệt với bệnh có bệnh
tích gần giống E. coli như hô hấp mãn tính.
2.2.5 Phòng và điều trị bệnh
Phòng bệnh
Do có nhiều chủng kháng nguyên E. coli nên việc phòng bệnh bằng vaccine
ít có hiệu quả.
Khi bệnh chưa xảy ra, phòng bệnh bằng phương pháp vệ sinh từ trong ra
ngoài: vệ sinh trứng ấp bằng thuốc sát trùng trứng, vệ sinh máy ấp, khu chăn nuôi,

10


dụng cụ chăn nuôi, vệ sinh chất độn chuồng, vệ sinh chuồng nuôi và thực hiện theo
nguyên tắc cùng vào cùng ra. Chuồng trại được sát trùng, tiêu độc định kỳ, để trống
chuồng một thời gian thích hợp.
Tăng cường sức đề kháng của cơ thể bằng cách cung cấp đủ vitamin, khoáng
chất, giảm tối đa stress (như nhiệt độ cao, gió lùa, khí amoniac, mật độ nuôi quá
đông, không đủ thông thoáng, ...). Đồng thời hạn chế người ra vào nơi nuôi và
người ra vào cần phải mặc quần áo bảo hộ để tránh làm phương tiện truyền vi

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn mẫu điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những
đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một 3’của mạch khuôn. DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Mồi xuôi tác động lên sợi DNA
theo chiều từ 3’- 5’. Mồi ngược tác động theo chiều 5’- 3’.
2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu
kỳ gồm 3 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính
Nhiệt độ được đưa lên 940C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi
DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy các phân tử DNA mạch kép bị tách ra, tạo nên các sợi
đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp
Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ sẽ được hạ đến 550C–650C là nhiệt độ
thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích.
 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72oC giúp DNA polymerase tổng hợp
sợi mới. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài
đoạn DNA cần khuếch đại.
2.3.4 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: khuôn mẫu (đoạn DNA cần
khuếch đại, không cần độ tinh sạch cao), cặp primer (nhân tố khuếch đại, thường
chứa 18–25 nucleotide), polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) giúp chịu được

12


nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng,
dNTPs (các loại nucleotide triphosphate), dung dịch đệm (thường là MgCl2).
2.3.5 Kiểm tra kết quả PCR

và nấm phổi trên gà 1 ngày tuổi. Tỉ lệ nhiễm E. coli là 35,34 % (41/116) và kết quả
thử độc lực dựa trên chuột cho thấy tỷ gây chết chuột là 75 – 100 %.
Trương Ngọc Tuyết (2002), phân lập vi khuẩn E. coli từ gà bệnh 1 - 7 ngày
tuổi cho thấy dịch viêm là canh khuẩn nguyên thì type dung huyết (γ) gây chết
chuột 100 %, còn α và β không gây chết chuột.
Trần Đức Trung (2003), khảo sát tỉ lệ nhiễm E. coli và sự kháng thuốc trên
gà bệnh từ 2-10 tuần tuổi mổ khám tại Bệnh viện Thú Y trường Đại học Nông Lâm,
cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh chung là 69,44 % (50/72) và kết quả tiêm chuột các chủng
E. coli được phân lập đều có khả năng gây chết chuột, tỉ lệ chết cao từ 75-100 %.
Võ Thị Hồng Điệp (2004), định type kháng nguyên của vi khuẩn E. coli
được phân lập từ gà bệnh, sử dụng phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và
chuột bạch để đánh giá độc lực. Kết quả độc lực trên phôi trứng cho thấy số phôi
trứng chết có tỉ lệ biến động từ 66 – 88 % và gây chết chuột từ 14 – 20 %.
Năm 2008 Võ Thành Thìn cho biết bốn phản ứng multiplex PCR đã được
thiết lập để xác định các gen quy định thụ thể sắt (iron – receptor) có mang trong
các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh ở gà: (1) fhuA/iutA/iron multiplex PCR phát
hiện các gen iroN, iutA và fhuA; (2) fyuA/fepA multiplex PCR phát hiện gen fyuA và
fepA; (3) chuA/ireA/fecA multiplex PCR khuếch đại ba gen chuA,fecA và ireA: (4)
fhuE/cir multiplex PCR phát hiện gen cir và fhuE. Ứng dụng phản ứng này, 20
chủng APEC phân lập được từ gà bị bệnh do E. coli tại tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa
đã được phân tích khả năng cạnh tranh giành sắt thông qua việc phát hiện 10 gen
quy định sinh tổng hợp 10 thụ thể sắt khác nhau. Kết quả cho thấy tất cả các chủng
APEC đều có mang gen mã hóa iron – receptor. Cụ thể là fepA (100%), fhuE (95%),
cir (95%), iutA (90%), iroN (75%), ireA (55%), fhuA (50%), fecA (45%), chuA
(45%) và fyuA (25%).
Hồ Thị Kim Cúc (2011), phân lập E. coli và xác định đặc tính gây bệnh của
vi khuẩn này trên gà, sử dụng phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và trên gà

14