BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

MAI THỊ THU

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA
DÒNG IgY NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN
NANG F1 CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH YERSINIA
PESTIS VÀ
ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 11/2017


2
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu là do tôi tự thực hiện.
Tất cả các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn
là hoàn toàn trung thực, chưa được bất kỳ tác giả nào công bố trước đây.
Nếu lời cam đoan không đúng sự thật tôi xin chịu hoàn toàn trách
nhiệm.
Tác giả

Mai Thị Thu



I.1. Bệnh dịch hạch...................................................................................................12
I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam .................................................13
I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới ....................................................................13
I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam...................................................................14
I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch ............................................................................16
I.3.1. Dịch hạch thể hạch .......................................................................................... 16
I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết ....................................................................18
I.3.3. Dịch hạch thể phổi .......................................................................................... 19
I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis .........................................20
I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch ...................................................................20
I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis .......................................................... 22
I.5. Kháng nguyên nang F1 ......................................................................................24
I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên nang F1 ....................................................................24
I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1 ............................................................. 25
I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn
Y.pestis......................................................................................................................25
I.6.1. Phương pháp miễn dịch .................................................................................25
I.6.2. Phương pháp sinh học phân tử........................................................................30
I.7. Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng........................................................... 31
I.7.1. Định nghĩa IgY ............................................................................................... 31
I.7.2. Sự hình thành kháng thể IgY ở gà ..................................................................31
I.7.3. Cấu trúc của kháng thể IgY ............................................................................32


5
I.8. Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c ........................... 33
I.8.1. Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng ..............................................33
I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng .......................................................34
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................37
II.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................... 37

nghiệm. .....................................................................................................................65
III.4.4. Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20. ...................66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................68


7

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001
Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002
Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001
Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch
Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch
Hình 1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson
Hình 1.7: Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)
Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng
Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY
Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng
Hình 2.1: Gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1
Hình 3.1: Phổ điện di các phân đoạn rửa giải trong quá trình tinh sạch kháng
nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1
Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP
Hình 3.3: Xác định độ pha loãng của kháng thể IgY kháng F1
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY
Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ trứng thu tại thời điểm 30, 35
ngày sau gây miễn dịch lần 1
Hình 3.6: Hiệu giá mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau khi gây miễn
dịch ở các độ pha loãng khác nhau
Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dòng có ái lực F1

IgY

Yolk Immunoglobulin

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

BSA

Bovine Serum Albumin

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide
Gel Electrophoresis

HTSKMD

Hệ thống sắc ký miễn dịch

kDa

Kilo Dalton

KLPT

Khối lượng phân tử

MBP

LỜI MỞ ĐẦU
Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra.
Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét.
Bệnh đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI,
XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong. Tuy đã được phát hiện từ lâu
nhưng hiện nay các ổ dịch vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực
trên trái đất.
Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ
học vẫn phải được tiến hành thường xuyên. Bởi vì bệnh dịch hạch có thể xuất hiện
bất cứ khi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi và sẽ gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc
sống của con người. Đặc biệt vi khuẩn Yesinia pestis vẫn được coi là một trong
những tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học.
Trong bối cảnh phức tạp như hiện nay, trên thế giới, khủng bố bằng vũ khí
sinh học đang được các thế lực thù địch tìm cách lợi dụng và phát triển. Trong đó, vi
khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) và vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Y. pestis)
là những đối tượng nguy hiểm nhất. So với các loại vũ khí thông thường, thì vũ khí
sinh học rất khó phát hiện, nhưng lại gây chết người hàng loạt trên diện rộng; gây
thiệt hại nặng nề về kinh tế và gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng.
Các phương pháp phân tích kháng nguyên F1 đặc hiệu cho Y. Pestis đều là
các phương pháp miễn dịch trong đó phổ biến nhất là ELISA và sắc ký miễn dịch
kẹp đôi (Splettstoesser và đồng tác giả, 2004). Que thử phát hiện nhanh kháng
nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi có quy trình
phân tích rất đơn giản, không cần trang thiết bị do vậy rất thích hợp với các phép
phân tích tại hiện trường; đáp ứng nhu cầu củacác phân đội lính trinh sát làm nhiệm
vụ tại các vùng rừng núi hẻo lánh.
Nhiệm vụ của Phòng Sinh học/Viện Hóa học – Môi trường quân sự là
nghiên cứu, chế tạo các trạng thiết bị để thực hiện nhiệm vụ trinh sát, phát hiện
nhanh các tác nhân sinh học. Do vậy việc nghiên cứu sản xuất các test phát hiện
nhanh kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis trong môi trường bằng phương


do vi khuẩn hay vi rút.
Trong khoảng hai ngàn năm qua, các vụ dịch hạch lớn đã lây lan rộng khắp
đến các quốc gia trên thế giới. Đại dịch đầu tiên được ghi nhận vào thế kỷ thứ VI,
vào khoảng từ năm 542 đến 546 xảy ra vụ dịch lớn bắt đầu ở Đế quốc La Mã
phương Đông vào triều đại Vua Justinian 1 ở Ai Cập, lây lan sang Châu Âu, ước
tính làm chết khoảng 100 triệu người ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu. Đại dịch
lần thứ hai nổi tiếng với tên “Bệnh chết đen - Black Death” vào thế kỷ XIV,
khoảng từ năm 1347 đến 1350. Đại dịch lần thứ 2 ước tính làm chết khoảng 50
triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu, chiếm một
phần ba dân số Châu Âu thời bấy giờ. Tỷ lệ tử vong trong đại dịch này từ 70 - 80%.
Cuối thế kỷ XIX, đại dịch thứ ba bắt đầu ở Canton và Hồng Kông vào năm
1894, nhanh chóng lan truyền đi khắp thế giới. Trong vòng 10 năm (1894-1903),
dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu: Châu Á: 31, Châu Âu: 12,
Châu Phi: 8, Bắc Mỹ: 4, Nam Mỹ: 15 và Châu Úc: 7. Trong đại dịch này, dịch
hạch lây lan mạnh mẽ ở Ấn Độ, chỉ riêng ở Bombay đã làm chết khoảng
13.000.000 người [1].


13
I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam
I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới
Các vùng dịch hạch lưu hành không cố định mà luôn luôn thay đổi, tuỳ
thuộc vào sự thay đổi của nhiều yếu tố tự nhiên, xã hội như: khí hậu, động đất, sự
di chuyển của các quần thể gặm nhấm, di dân,... Hiện nay, các ổ dịch hạch tự nhiên
tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, từ 55 vĩ độ
Bắc đến 40 vĩ độ Nam. Tuy nhiên, trong vành đai này có những vùng không có ổ
dịch hạch như các hoang mạc với một số lượng ít hoặc không có loài vật chủ gặm
nhấm, vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao đóng băng quanh năm.
Từ 1954 - 2001, Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận có 38 quốc gia trên thế giới
xảy ra bệnh dịch hạch gồm 89.651 trường hợp mắc và 7.715 bệnh nhân tử vong.

lắng dịu nhưng thực sự chưa bao giờ được loại trừ.
Dịch hạch được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha
Trang trong bối cảnh vụ đại dịch hạch thế giới lần thứ 3. Dịch xâm nhập chủ yếu
theo hàng hóa của người Trung Hoa. Sau khi xâm nhập dịch lây lan đến những nơi
khác như Bắc Ninh, Hòn Gai, Phan Thiết, Phan Rang, Sóc Trăng.... Dịch tại những
nơi xâm nhập đều có tính chất tạm thời trừ Sài Gòn và Phan Thiết có chiều hướng
trở thành vùng dịch lưu hành dai dẳng. Vào năm 1911 tại Châu Đốc, Long Xuyên,
Thủ Dầu Một xảy ra một vụ dịch lớn với nhiều bệnh nhân dịch hạch thể phổi có
886 người tử vong.


15

Hình1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002
Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở Miền Nam. Sau đó tiếp tục lây
lan trên diện rộng ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam
Bộ. Chính quyền miền Nam dưới sự trợ giúp của Mỹ thông qua chương trình quốc
gia phòng chống dịch hạch đã khống chế được một phần, nhưng nhìn chung dịch
vẫn tồn tại với quy mô lớn. Trong giai đoạn này, hầu hết số bệnh nhân mắc phải
dịch trên thế giới đều là Việt Nam.

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001


16
Từ 1975 đến 1990: Sau 1975 dịch bùng phát, số ca mắc - chết tăng vọt tại
các vùng dịch lưu hành như ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền
Đông Nam Bộ. Đặc biệt trong thời gian này, dịch hạch đã xuất hiện và gây ra một
số vụ dịch nhỏ tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do có sự giao lưu về lương thực hàng
hóa và các phương tiện giao thông. Đặc biệt chuột và tác nhân gây bệnh Y. pestis

gian ủ bệnh trong vòng 6 ngày, thời kỳ này kéo dài hơn ở những người đã được
chủng ngừa vắc xin. Thời kỳ ủ bệnh không có triệu chứng gì, sau đó bệnh thường
khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu hiệu đặc trưng của bệnh dịch hạch là nhiễm
khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch.
* Hội chứng nhiễm trùng - nhiễm độc.
Sốt cao đột ngột là triệu chứng tương đối phổ biến và thường xuất hiện trước
khi viêm hạch. Nếu được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu thì nhiệt độ hạ, trong
vòng 18 - 24 giờ có thể giảm đến 1,5 đến 2oC, ngày sau có thể hết sốt hoặc sốt nhẹ
thêm 2 - 3 ngày rồi hết hẳn.
Các dấu hiệu nhiễm trùng, nhiễm độc thần kinh biểu hiện mức độ nặng nhẹ
của bệnh và là yếu tố quyết định tiên lượng bệnh. Cần đặc biệt quan tâm khi thấy
xuất hiện sớm trong vòng 24 giờ đầu. Ở thể nhẹ, bệnh nhân mệt mỏi, biếng ăn
nhưng vẫn tươi tỉnh. Bệnh càng nặng, biểu hiện nhiễm độc càng rõ. Mặt đỏ, kết
mạc mắt xung huyết, môi khô, lưỡi bẩn, đau nhức nhiều nơi. Người bứt rứt khó
chịu, vẻ mặt lo âu sợ hãi, hoặc hốt hoảng, vật vã, kích động, nói nhảm hoặc lừ đừ,
mắt đờ đẫn, nằm yên không cử động, không ngủ. Đôi khi gặp ảo giác, trả lời chậm
chạp, khi đúng khi sai, tiếng nói không rõ ràng. Hiếm gặp hơn là động tác bất
thường, thỉnh thoảng gồng người co giật, vã nhiều mồ hôi. Có trường hợp ói mửa,
ỉa chảy. Khó thở nhanh mà không có tổn thương bệnh lý ở phổi.
* Viêm hạch.
Viêm hạch thường xuất hiện đồng thời hoặc sau sốt vài giờ đến 24 giờ, một
số ít trường hợp nổi hạch trước sốt. Viêm hạch dịch hạch là một loại viêm cấp tính
với triệu chứng đau là tính chất nổi bật lên hàng đầu. Đau là triệu chứng sớm nhất
và thường xuất hiện trước khi nổi hạch (87%). Đau tăng lên khi bệnh nhân cử động
hay sờ nắn và bệnh nhân thường ở tư thế nhằm làm giảm sức căng lên vùng đó.
Thuốc giảm đau không hoặc có tác dụng rất ít. Đau tự nhiên, càng nhiều và càng


18
sớm, đi đôi với sốt cao thường tiên lượng nặng hơn. Đau giảm rõ rệt và nhanh

Bệnh nhân đột ngột sốt cao 40 - 410C, rét run, đau đầu dữ dội, tiêu chảy và
ói mửa nhiều lần. Hốt hoảng, vật vã, kích động, nói sảng, tím tái, thở nhanh nông
…sau đó đi vào sốc nhiễm trùng nhiễm độc. Soi tươi các bệnh phẩm sẽ thấy vi
khuẩn dạng dịch hạch. Thường bệnh nhân tử vong nhanh chóng trong vòng 1 vài
ngày nếu không được điều trị sớm và hồi sức tích cực ngay từ những giờ đầu của
bệnh [2].
I.3.3. Dịch hạch thể phổi
Bệnh dịch hạch đáng sợ nhất là thể phổi vì tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong
rất cao. Thể tiền phát là do tác động trực tiếp của vi khuẩn trên tổ chức phổi theo
đường hô hấp trên, bệnh xuất hiện dưới dạng viêm đặc thùy phổi và diễn biến rất
cấp tính. Thời gian nung bệnh của thể phổi thường ngắn hơn, chỉ trong một vài
ngày, thậm chí chỉ trong vòng vài giờ sau khi nhiễm bệnh. Sau đó bệnh khởi phát
rất đột ngột với sốt cao, rét run, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mạch nhanh, huyết
áp thấp, bệnh nhân bứt rứt. Trong vòng 24 giờ sau, các dấu hiệu của tổn thương hô
hấp xuất hiện nhanh chóng, có rối loạn chức năng hô hấp như đau tức ngực, thở
nhanh nông, khó thở. Lúc đầu ho có đờm nhầy, loãng. Sau đó đờm đặc dần, có vết
máu, có khi có bọt. Triệu chứng thực thể ở phổi rất nghèo nàn: Gõ bình thường
hoặc đục một vài nơi, âm phế bào và rung thanh không thay đổi. Đôi khi tìm thấy
dấu hiệu 3 giảm hoặc tiếng cọ màng phổi. X quang phổi biểu hiện rất sớm, có thể
thấy hình ảnh đông đặc phổi thông thường hoặc nhiều bóng mờ rải rác hoặc hình
ảnh bong bóng giống viêm phổi tụ cầu[1,2]. Ngoài ba thể hay gặp trên còn có các
thể khác ít phổ biến hơn như: thể màng não, thể xuất huyết, thể hầu học…


20
I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis
I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch
Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm, lây truyền trong quần thể gặm nhấm. Bệnh
duy trì trong các ổ dịch thiên nhiên của các loài gặm nhấm và lây truyền qua trung
gian bọ chét sống ngoại ký sinh trên chúng. Phần lớn các loài động vật hoang dại

trực tiếp với vật chủ bị bệnh hoặc chết vì dịch hạch, nhất là dịch hạch thể phổi.
Đây là một phương thức lây truyền cực kỳ nguy hiểm vì xảy ra rất nhanh cho
người tiếp xúc.
Vi khuẩn dịch hạch xâm nhập qua da, ở nơi bọ chét đốt và theo đường bạch
huyết đến hạch khu vực, sinh sản phát triển mạnh tại đó gây nên dịch hạch thể
hạch. Sau đó, nếu không được điều trị thích hợp vi khuẩn dịch hạch xâm nhập vào
máu gây nên thể nhiễm khuẩn thứ phát. Đối với thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát
hoặc thứ phát, ngoài vai trò truyền bệnh của bọ chét còn có thêm yếu tố độc lực của
mầm bệnh và sức đề kháng của cơ thể vật chủ[1].

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch


22
I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis
Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm
dịch và khai báo quốc tế do vi khuẩn Y. pestis gây nên. Bệnh lưu hành trong quần
thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh
trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người.
Vi khuẩn dịch hạch trải qua nhiều danh pháp khác nhau, đầu tiên khi mới
được phát hiện có tên là Bacterium pestis, đến năm 1900 gọi là Bacillus pestis, sau
năm 1923 đổi thành Pasteurella pestis và tại Hội nghị Sinh vật học Quốc tế lần thứ
10 vào năm 1970 mới có danh pháp như hiện nay là Y. pestis.
Yersinia pestis do Alexandre Yersin phát hiện ra tại Hồng Kông vào ngày 20
tháng 6 năm 1894, trong thời gian đại địch lần thứ 3 đang hoành hành ở đây.
Yersinia pestis trước đây được xếp vào họ Pasteurellaceae, nhưng dựa trên
cơ sở so sánh mã di truyền bằng lai tạo DNA-DNA và RNA ribosom 16S/5S thì
tương tự như Escherichia coli nên chi Yersinia được xếp lại vào họ
Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài được quan tâm vì
có khả năng gây bệnh cho người là Y. pestis, Y.pseudotuberculosis và Y.

lực liên quan đến khả năng chống lại hiện tượng thực bào.
Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y. pestis nhờ kháng
nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với kháng nguyên F1.


24
Những chủng không độc đều thiếu kháng nguyên F1. Y.pestis tạo ra cả nội độc tố
và ngoại độc tố. Các độc tố dịch hạch có tác động làm tan hồng cầu, tan tơ huyết và
làm đông huyết tương, những yếu tố này giúp vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật
chủ. Nội độc tố có tính chất ái thần kinh, gây nên bệnh cảm li bì, u ám, thâm nhiễm
xuất huyết ở các nội mạc tĩnh mạch và những tổn thương thoái hóa của phủ tạng.
Vi khuẩn dịch hạch có thể lây truyền qua cả 4 con đường: đường máu (là chủ yếu),
đường tiêu hóa, đường hô hấp và đường da, niêm mạc [2].
I.5. Kháng nguyên nang F1
I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên F1
Kháng nguyên F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có chủng Y. pestis mới có
kháng nguyên F1. William và cộng sự đã nghiên cứu trên 300 chủng Y. pestis độc
và không độc cho thấy tất cả các chủng đều có kháng nguyên F1, bởi vậy kháng
nguyên F1 được dùng cho chẩn đoán dịch hạch [6]. Ở Y. pestis, quá trình tổng hợp
và tiết kháng nguyên F1 được mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1, caf1M,
caf1A và caf1R nằm trên plasmid pMT1, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1,
caf1M và caf1A đóng vai trò trong việc tạo cấu trúc và tiết protein ra bên ngoài tế
bào, caf1R đóng vai trò trong điều hòa quá trình phiên mã các gen trên operon. Về
mặt cấu trúc, kháng nguyên F1 là chuỗi polypeptide, kích thước 17 - 17,6 kDa,
điểm đẳng điện 4,1 - 4,4. F1 là protein kị nước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β [7].
Kháng nguyên nang F1 là một dấu hiệu cụ thể để có thể xác định vi khuẩn Y. pestis.
Khi nuôi cấy ở 370C thì kháng nguyên F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt
tế bào, dễ dàng hòa tan trong môi trường nuôi cấy.
Protein F1 có cấu trúc bậc 4, tương tác kị nước, có cấu trúc bên trong kiểu
hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm có tác dụng như một màng sinh học hỗ

Phương pháp này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và các
kháng thể (kháng thể bắt cặp và kháng thể phát hiện). Trong đó kháng thể bắt cặp
được sử dụng là kháng thể đơn dòng hoặc kháng thể đa dòng, kháng thể phát hiện
thường là kháng thể đơn dòng. Nguyên lý của phương pháp gồm: (1) gắn kháng thể
bắt cặp lên giếng; (2) bổ sung mẫu (kháng nguyên liên kết với kháng thể bắt cặp);
(3) bổ sung kháng thể phát hiện (kháng thể phát hiện sẽ liên kết với kháng nguyên);
(4) bổ sung kháng thể cấp hai liên kết với enzym (kháng thể này liên kết với kháng
thể phát hiện); (5) bổ sung cơ chất (nhằm chuyển hóa thành dạng có thể phát hiện
được nhờ enzym).