BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
TRÊN ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA
VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV)

Ngành học

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN XUÂN THẮNG

Niên khóa

2009 – 2013

Tháng 06/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******


Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
 PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tôi thực hiên đề tài .
 Chị Vương Thị Thúy Vi, anh Võ Tấn Hùng, anh Võ Khánh Hưng, anh Nguyễn
Phan Thành …đã giúp đỡ và truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong
suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Bốn năm đại học đã cho tôi có được những người bạn tốt. Các bạn đã bên cạnh,
chia sẻ và giúp đỡ tôi rất nhiều. Đời sinh viên của tôi thật có ý nghĩa và tuyệt vời khi có
các bạn: tập thể lớp DH09SH, các anh chị cựu sinh viên BM. CNSH, tập thể KTX phòng
16C/C, các anh chị em trong BM. CNSH đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá
trình học tập và thực hiện đề tài … Xin chân thành cảm ơn và mãi nhớ về các bạn thân
yêu.
Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Nguyễn Xuân Thắng
i


TÓM TẮT
Việc phân tích di truyền của PRRS có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong dịch tễ học.
Từ thông tin di truyền của PRRS có thể xác định được nguồn gốc phát sinh dịch bệnh,
biến đổi di truyền đang xảy ra như thế nào đối với dịch bệnh. Đề tài “Phân tích sự biến
đổi di truyền trên đoạn gen mã hóa protein NSP2 của vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp trên heo (PRRSV)” được tiến hành, mục đích là khảo sát sự biến chủng và
biến đổi thông tin di truyền của các chủng PRRS tại Việt Nam phục vụ cho các nghiên
cứu về kiểm soát và phòng chống dịch bệnh PRRS.
Hai mươi mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong xét nghiệm cho kết quả 6 mẫu
dương tính bằng kĩ thuật RT-PCR. Cả 6 chủng trên được phân tích và xây dựng cây di
truyền để so sánh sự biến đổi di truyền.
Cả 6 mẫu khảo sát dương tính có sự đột biến trên đoạn gene NSP2 rõ rệt. Nhóm
chủng HP-PRRS 2007: SDH1 và SH1H1 có tỉ lệ tương đồng với chủng JXA1 rất cao
(98,7-99,2 %). Đây là 2 chủng có trình tự aa tương ứng đột biến ít nhất so với các chủng

Asparagine and Phenylalanine) and 16 other amino acid replacement mutations, DN1 and
DN2 strains were in HP-PRRS strain branch, these were similar to JXA1 reference strain
(similarity degree: 92.3 - 92.6%). Compared with the corresponding amino acid sequence
of the gene NSP2, DN1 and DN2 strains had 29 and 30 point mutations. All of 6 strains
had clear nucleotide and acid amin sequences mutations on NSP2 gene.

iii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn .............................................................................................................................i 
Tóm tắt ................................................................................................................................. ii 
Summary ............................................................................................................................. iii 
Mục lục ................................................................................................................................iv 
Danh sách chữ viết tắt .........................................................................................................vi 
Danh sách các bảng ........................................................................................................... vii 
Danh sách các hình ........................................................................................................... viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 
1.1.  Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 
1.2.  Mục tiêu đề tài......................................................................................................... 2 
1.3.  Nội dung thực hiện .................................................................................................. 2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3 
2.1.  Một số thông tin về Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) ........ 3 
2.2 

Tác nhân gây bệnh .................................................................................................. 7 

2.3 

Triệu chứng bệnh .................................................................................................... 8 

3.1.  Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 22 
3.2.  Vật liệu và hóa chất............................................................................................... 22 
3.2.1.  Vật liệu sinh học............................................................................................. 22 
3.2.2.  Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................... 22 
3.2.3.  Hóa chất.......................................................................................................... 22 
3.3.  Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 24 
iv


3.3.1.  Ly trích RNA virus PRRS .............................................................................. 24 
3.3.2.  Khuếch đại vùng chứa đoạn NSP2 bằng RT-PCR ......................................... 25 
3.3.3.  Giải trình tự đoạn gen mã hóa protein NSP2 của PRRSV ............................. 27 
3.3.4.  Phân tích trình tự di truyền của các chủng PRRSV ....................................... 27 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 31 
4.1.  Kiểm tra primer ..................................................................................................... 31 
4.2.  Kết quả chạy RT-PCR các mẫu thực địa PRRS ................................................... 34 
4.3.  Phân tích trình tự di truyền các mẫu nghiên cứu .................................................. 35 
4.4.  Phân tích trình tự acid amin từ trình tự di truyền các mẫu nghiên cứu ................ 39 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 42 
5.1.  Kết luận ................................................................................................................. 42 
5.2.  Đề nghị .................................................................................................................. 43 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 

v


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
PRRS


MDS

Mistery Disease of Swine

PEARS

Porcine Endemic Abortion And Respiratory Syndrome

BED

Blue Ear Disease

HP-PRRS

Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EU

Europe

NA

North America

PCV


vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Chức năng các ORF của PRRSV ........................................................ 10
Bảng 3.1 Trình tự cặp primer khuếch đại vùng chứa đoạn NSP2 của PRRSV .. 26
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR.................................................................. 27
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR ...................................................... 28
Bảng 3.4 Các chủng virus trong mẫu bệnh phẩm được giải trình tự ................. 29
Bảng 3.5 Các chủng virus tham chiếu ở Việt Nam............................................. 30
Bảng 3.6 Các chủng virus tham chiếu trên thế giới ............................................ 30

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Dịch PRRS tại Mỹ tính tới tháng 10 năm 2012................................................. 4
Hình 2.2 Sự lây lan của dịch PRRS ở Đông Nam Á từ năm 2007 tới giữa năm 2010 .... 5
Hình 2.3 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV ................................................... 8
Hình 2.4 Triệu chứng bệnh ở heo nhiềm PRRS .............................................................. 9
Hình 2.5 Cấu trúc bộ gen virus PRRS ............................................................................ 10
Hình 2.6 Biểu đồ giả định protein NSP2 của PRRSV.................................................... 12
Hình 2.7 Xây dựng các chủng VR-2332 có NSP2 đột biến ........................................... 13
Hình 2.8 Sảy thai, thai chết lưu ở các giai đoạn thai kì khác nhau của bệnh PRRS ...... 15
Hình 2.9 Sơ đồ khối giải trình tự mao quản .......................................................... 19
Hình 2.10 Sơ đồ khối một máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA .................. 19
Hình 4.1 Kết quả Align primer NSP2 với các chủng PRRS tham khảo trên genbank... 32
Hình 4.2 Kết quả kiểm tra primer với mẫu PRRS bằng phản ửng RT-PCR .................. 33
Hình 4.3 Trình tự gen vùng NSP2 của PRRSV tại Việt Nam ........................................ 34
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR ................................................................. 35

NSP2 của vùng ORF1a của các chủng này so với các chủng bình thường (Tian và ctv,
2007). Vùng trình tự mã hóa NSP2 là một trong những vùng có liên quan đến độc lực của
virus PRRS ngoài ORF5 và ORF7. Nhằm xác định khả năng biến đổi di truyền của
PRRSV, đề tài “Phân tích sự biến đổi di truyền trên đoạn gen mã hóa protein NSP2 của
virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRSV)” được thực hiện nhằm
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo như đánh giá sự biến đổi di truyền trên các đoạn

1


gene khác, chế tạo vaccine… góp phần vào công tác chẩn đoán và ngăn ngừa căn bệnh
nguy hiểm này.
1.2.

Mục tiêu đề tài
Bước đầu khảo sát sự biến đổi di truyền của PRRSV trên đoạn gen mã hóa protein

NSP2 nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo như đánh giá sự biến đổi di truyền trên
các đoạn gene khác, chế tạo vaccine…
1.3.

Nội dung thực hiện

 Ly trích RNA tổng số, nhân đoạn gen mã hóa protein NSP2 của virus PRRS bằng
kỹ thuật RT-PCR
 Giải trình tự đoạn gen mã hóa protein NSP2 của virus PRRS thu nhận được.
 Xây dựng cây sinh dòng của các chủng PRRSV dựa trên đoạn gene mã hóa protein
NSP2 của các chủng PRRSV khảo sát và các chủng PRRSV khác trên thế giới và
tại Việt Nam.
 Đánh giá biến đổi di truyền của PRRSV thông qua trình tự của đoạn ORF1a mã

và sẩy thai ở heo (Porcine Endemic Abortion And Respiratory Syndrome – PEARS), và ở
Việt Nam PRRS thường được gọi là Bệnh heo tai xanh (Blue Ear Disease - BED) (Egli và
ctv, 2001). Năm 1992, Hội nghị quốc tế về hội chứng này được tổ chức ở Minnesota
(Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội chứng rối loạn hô hấp và
sinh sản ở heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS).
Ở Mỹ - nơi bắt nguồn của dịch bệnh này, hằng năm thiệt hại hơn 1 tỉ đô la bao
gồm khoảng 664 triệu đô la xử lý các đợt dịch bùng phát và 447 triệu đô la cho các chi
3


phí liên quan. Theo khảo sát thì đây là bệnh gây ra nhiều khó khăn và thách thức nhất cho
các nhà chăn nuôi kể từ khi nó được phát hiện tại các trang trại từ những năm 1980
(National Pork Board, 2011).

Hình 2.1 Dịch PRRS tại Mỹ tính tới tháng 10 năm 2012.
().
Ở châu Á, các trường hợp đầu tiên của bệnh PRRS xuất hiện ở Trung Quốc và
nhanh chóng bùng phát thành dịch vào năm 1995; và tới năm 2006, dịch PRRS ở Trung
Quốc bùng phát mạnh bởi một chủng virus PRRS không điển hình – virus gây rối loạn
sinh sản và hô hấp độc lực cao ở heo (HP-PRRS) và kết quả là gây tổn thất rất lớn về kinh
tế cho ngành công nghiệp chăn nuôi lợn Trung Quốc (Tian và ctv, 2007).
Đối với Đông và Đông Nam Á, với mật độ heo cao nhất trên toàn thế giới, sự tồn
tại của căn bệnh này đặt ra một mối quan tâm ngày càng tăng về kinh tế xã hội. Với cấu
trúc của khu vực sản xuất, các mầm bệnh nguy hiểm có thể cùng phát dịch và gây hậu quả
nghiêm trọng hơn (FAO, 2011).

4


Hình 2.2 cho thấy tình hình dịch bệnh PRRS ở khu vực Đông Nam Á từ năm 2007

1.978 xã, phường, thị trấn thuộc 286 quận, huyện của 49 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn mắc
bệnh là 812.947 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 442.699 con. Đầu năm 2012 đến
nay, bệnh xảy ra tại 9 tỉnh phía Bắc (tháng 1 đến tháng 6) rồi đến Bạc Liêu, Đồng Nai,
Bình Dương và Long An (tháng 6/2012) nhưng quy mô ổ dịch nhỏ hơn so với năm 2010
(báo cáo của Cục Thú Y, tháng 9/2012)
Các nghiên cứu về bệnh trên những trại heo giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy
tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở
các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là
60-75%, Mỹ là 36% (Phòng Dịch Tễ – Cục Thú Y, 2007).

6


2.2

Tác nhân gây bệnh
Virus gây bệnh PRRS (gọi tắt là PRRSV) được xác định và phân lập vào năm 1991

ở viện Thú y Lelystad (Hà Lan) và được phân lớp vào họ Arteriviridae, giống Arterivirus,
bộ Nidovirales. PRRSV là một loại virus RNA mạch đơn, không màng bao. Kích thước
bộ gene khoảng 15 kb, bao gồm 8 khung đọc mã (ORF). Hai chủng chính được xác định
gồm: genotype 1 với prototype Lelystad (thường được gọi là chủng Châu Âu - EU) và
genotype 2 với prototype VR2332 (chủng Bắc Mỹ - NA). Gần đây, một biến thể của
genotype 2 có độc lực cao hơn đã gây nhiều tổn thất ở châu Á (Li và ctv, 2010; Wang và
ctv, 2007).
Virus thuộc dòng Bắc Mỹ còn có 1 phân nhánh lớn là PRRS kiểu Trung Quốc. Các
nghiên cứu phân tử cho thấy giữa virus PRRS chủng châu Âu và chủng châu Mỹ chỉ
tương đồng 60% về nguyên liệu di truyền. Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai
type PRRSV có nhiều nét chung, nhưng theo các nghiên cứu cho thấy hai type có sự khác
biệt lớn về bộ gene (55-80% mức độ tương đồng), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng

Các triệu chứng về hô hấp thường trở nên nghiêm trọng hơn khi nhiễm các bệnh kế phát
do các vi sinh vật khác gây ra như Pasteurella multocida, Porcine Circovirus type 2
(PCV2), Mycoplasma hyopneumonia, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis,
Haemophilus parasuis, swine influenza virus… Tỉ lệ heo chết thường cao ở heo con (3050 %) và thấp hơn ở heo trưởng thành (4-20%) (OIE, 2008).

8


 Các triệu chứng về sinh sản ở heo nái: hôn mê, lờ đờ, giảm ham muốn tình dục,
sẩy thai, sinh non hoặc thai chết lưu. Heo con mới sinh thường yếu. Các bệnh về hô hấp
cũng thường xảy ra đối với heo nái bị nhiễm bệnh.
 Tuy nhiên các dấu hiệu lâm sàng nêu trên không hoàn toàn là đặc trưng cho bệnh
PRRS, mà còn xuất hiện ở các bệnh lây nhiễm do các tác nhân khác gây nên. Điều này dễ
gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh nếu chỉ dựa vào biểu hiện lâm sàng.

A

B
Hình 2.4 Triệu chứng bệnh ở heo nhiềm PRRS.
A. Da và cơ quan sinh dục đỏ; B. Tai màu tím xanh(Nguồn: Heo.com.vn).

2.4

Cấu trúc bộ gen PRRSV

2.4.1 Tổ chức bộ gen PRRSV
Chuỗi hệ gen đầy đủ của virus PRRS được xác lập vào năm 1993, nó có kích thước
khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa 8 khoang đọc mở (ORF) để mã hóa 20 protein đã định
sẵn. Hệ gen cũng chứa 2 vùng không dịch mã (UTR) tại vị trí 59 và 39 (Thiel và ctv 1993,
Meulenberg và ctv 1993). Trong đó, chỉ có 3 khung ORF có ý nghĩa quan trọng trong


Nucleocapsid protein N

ORF3

Glycoprotein màng GP3

ORF4

Glycoprotein màng GP4

ORF5

Glycoprotein màng chính GP5

ORF6

Protein kết màng – M

ORF7

Nucleocapsid protein

Protein cấu trúc

(Nguồn Dea S.và ctv, 2000)
10


ORF1a và ORF1b là định vị xuôi dòng của 59-UTR, nó chiếm giữ khoảng 80% hệ

tồn với đầu N-terminal cystein protease (PL2); vùng không tương đồng và vùng siêu biến
đổi (HV-hypervariable); vùng kỵ nước C-terminusTM (TM) (Hình 2.6)
Vùng bảo tồn với đầu N-terminal cystein protease (PL2)
Vùng này có khoảng 100 aa, là vùng hoạt động trên chất nền giữa vùng giao nhau
của NSP2 và NSP3. Đây là vùng được dự đoán có tính bảo tồn cao (Bosch và ctv, 2004).
Để kiểm tra tính quan trọng của miền PL2, Jun Han và ctv (2007) đã tiến hành tạo một số
đột biến mất nucleotide (nu) trên vùng PL2 trên NSP2 (Y47-S180). Kết quả, việc mất lõi
PL2 trên NSP2 đã gây chết cho virus.
Ngoài ra, vai trò của vùng đầu và cuối của PL2 cũng được xác định bằng cách tạo
một trong hai đột biến xóa vùng trên A13-V35[V7-NSP213-35] hoặc vùng dưới S181L323[V7-NSP2181-323], sau đó tạo dòng và nuôi cấy trên môi trường MACR-145. Kết
quả sự phiên mã cho thấy V7-NSP213-35 hoạt động bình thường còn V7-NSP2181323 chết. Điều này chứng tỏ aa 181-323 có ảnh hưởng đến hoạt động của PL2 (Jun Han
và ctv, 2007).
Vùng kỵ nước C-terminusTM (TM) và đuôi C
Vùng carboxyl của NSP2 thì có tính bảo tồn cao trên các chủng PRRSV và chứa
khoảng 3 đến 4 vùng hydrophotic TM (aa 876-898, 911-930, 963-979, 989-1009). Đặc
điểm này giống với EAV, vì vậy vùng kỵ nước C chịu trách nhiệm cho các mô đích của
các protein không cấu trúc trên màng tế bào để hoàn thành việc nhân rộng virus (Van der
Meer và ctv, 1998). Các đột biến xóa toàn bộ vùng W876-Q1009 hay vị trí giao nhau
981G/G, vùng A880-A937[V7-NSP2880-937], vùng S1070-A1162[V7-NSP210701162] đã gây chết cho virus (Jun Han và ctv, 2007).

12


Hình 2.7 Xây dựng các chủng VR-2332 có NSP2 đột biến.
Đột biến đã xóa trong khung NSP2 đã được hình thành để đạt được sản phẩm bằng
PCR. Với mục đích biểu hiện gen ra ngoài, gen GFP đã được chèn vào vị trí mà
các aa vùng 324-434 của NSP2 đã bị xóa để tạo ra đột biến V7-NSP2324-434GFP (Jun Han và ctv, 2007).
Vùng không tương đồng và vùng siêu biến đổi (HV-hypervariable)
Là vùng nằm giữa vùng PL2 và vùng TM, khoảng 150-850 aa, khác nhau rất cao
giữa các giống và đặc biệt là giữa các chủng PRRSV (Nellsen và ctv, 1999; Allende và

(Lurchachaiwong và ctv, 2008). Theo hướng dẫn của Cục Thú Y nước ta, để phát hiện
heo bệnh tai xanh, phải thường xuyên kiểm tra sức khỏe đàn heo nuôi và sử dụng định
nghĩa ca bệnh lâm sàng như sau: Heo sốt cao trên 400C, khó thở, có những vết bầm, thâm
tím trên da, tai tím xanh, heo ở các lứa tuổi khác nhau đều có thể mắc bệnh (Phan Trung
Nghĩa, 2010)

14


Hình 2.8: Sảy thai, thai chết lưu ở các giai đoạn thai kì khác nhau của bệnh PRRS.
(Nguồn: ).
Tuy nhiên, phương pháp này nhận diện bệnh không rõ ràng vì các biểu hiện bệnh
biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn heo, các yếu tố môi trường, cũng như việc
dễ nhầm lẫn với các bệnh do các tác nhân virus và vi khuẩn khác gây ra. Bên cạnh đó,
thời gian để phát hiện heo nhiễm bệnh lâu, chỉ phát hiện khi heo đã phát bệnh nên gây
khó khăn cho các biện pháp cách ly và phòng ngừa. Tuy nhiên hiện nay, đây lại là phương
pháp phát hiện phổ biến nhất ở các trại chăn nuôi cũng như các trung tâm thú y ở nước ta.
Phân lập virus
Phân lập virus được xem như là tiêu chuẩn vàng cho việc phát hiện PRRSV.
PRRSV có thể được phân lập từ mẫu huyết thanh, mô cơ quan như phổi, lách, tim, hạch
bạch huyết... Đại thực bào phổi hay dòng tế bào MARC-145 rất thích hợp làm hệ thống
nuôi cấy virus. Việc phân lập thành công virus PRRSV phụ thuộc rất nhiều vào tuổi heo
bị nhiễm, điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy mẫu,… Nhược điểm của phương pháp này là
tiến hành khó khăn, tốn thời gian (OIE, 2010), rất khó để phân lập được PRRSV type EU
vì type này thường không sao chép trong tế bào dòng mà chỉ sao chép trên đại thực bào
phổi heo (PAM - Porcine Alveolar Macrophages).
Huyết thanh học

15