ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐÌNH HUY

NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC CHẤT CHITOSAN NANO BẠC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY HƯ
HỎNG QUẢ SAU THU HOẠCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐÌNH HUY

NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC CHẤT CHITOSAN NANO BẠC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY HƯ
HỎNG QUẢ SAU THU HOẠCH
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 8.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN DUY

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018


i

DANH MỤC CÁC HÌNH ..............................................................................
viii

CHƯƠNG

1.

MỞ

ĐẦU

................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................... 1
1.2 Mục đích và yêu cầu ................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn....................................................... 2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
2.1. Tổng quan về Chitosan............................................................................... 3
2.1.1 Nguồn gốc của Chitin và chitosan ........................................................... 3
2.1.2. Cấu trúc hóa học của chitosan................................................................. 4
2.1.3. Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan.................................................. 5
2.1.4. Ứng dụng của chitosan............................................................................ 6
2.2. Tổng quan về nano bạc ............................................................................ 10
2.2.1. Giới thiệu về công nghệ nano ............................................................... 10
2.2.2. Giới thiệu về bạc kim loại ..................................................................... 11
2.2.3. Tổng quan về hạt nano bạc ................................................................... 12
2.2.4 Đặc tính và khả năng ức chế vi sinh vật của nano bạc .......................... 15
2.2.5. Ứng dụng của nano bạc trong đời sống ................................................ 18
2.3 Một số vi sinh vật thường gây hư hỏng sản phẩm rau quả .......................
19
2.3.1. Vi khuẩn Bacillus cereus....................................................................... 19

bạc...... 44
4.1.1. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của Chitosan ............. 44
4.1.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của Nano bạc ............ 48
4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế của phức chất Chitosan-Nano
bạc đối với một số vi sinh vật gây hư hỏng quả.............................................. 52
4.2.1. Xác định khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus cereus của phức chất
chitosan-nano bạc ............................................................................................ 52


4

4.2.2. Xác định khả năng ức chế nấm men Pichia của phức chất chitosannano bạc........................................................................................................... 53
4.2.3. Xác định khả năng kháng nấm mốc Penicillium digitatum của
phức chất chitosan/nano bạc ........................................................................... 55
4.3. Kết quả đánh giá thử nghiệm phức chất chitosan - nano bạc trong
bảo quản vải thiều ........................................................................................... 57
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý tới vải
sau 4 ngày bảo quản ........................................................................................ 57
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm (chitosan và
nano bạc) tới quá trình bảo quản vải ............................................................... 59
4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian bảo quản vải. .......... 62
4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm (chitosan và
nano bạc) tới quá trình bảo quản bưởi ............................................................ 63
4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý tới quá
trình bảo quản bưởi ......................................................................................... 63
4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm tới hàm lượng chất khô tổng số
trong quá trình bảo quản bưởi ......................................................................... 66
4.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm tới hàm lượng axit hữu cơ tổng
số trong quá trình bảo quản bưởi .................................................................... 67
4.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan và nano bạc tới sự biến


Đối chứng


6

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1:

Hàm lượng chitin có trong một số động vật giáp xác ................ 4

Bảng 2.2:

Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích .............................. 11

Bảng 2.3:

Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano bạc. ............. 15

Bảng 3.1.

Các thiết bị, dụng cụ chính sử dụng trong nghiên cứu.............. 28

Bảng 3.2:

Nồng độ dung dịch nano bạc pha loãng .................................... 33

Bảng 3.3:

Phương pháp phối hợp chitosan/nano bạc................................. 37


Hiệu quả kháng vi khuẩn B.cereus của chế phẩm chitosan nano bạc ..................................................................................... 53

Bảng 4.9:

Kết quả kháng nấm men Pichia của phức chất chitosan và
nano bạc ..................................................................................... 54

Bảng 4.10.

Ảnh hưởng của chế phẩm phối hợp Chitosan - Nano bạc ở các
tỉ lệ phối trộn khác nhau đến hoạt tính kháng nấm mốc
Penicillium digitatum. ............................................................... 56

Bảng 4.11:

Sự biến đổi các thành phần của vải ở các chế độ tiền xử lý
khác nhau ................................................................................... 57


vii
Bảng 4.12:

Sự biến đổi các thành phần của vải ở các nồng độ chế phẩm
(chitosan và nano bạc) khác nhau.............................................. 59

Bảng 4.13.

Sự thay đổi chỉ số L, a, b của các nồng độ chế phẩm
chitosan và nano bạc trong quá trình bảo quản vải ................... 61

Bảng 4.20.

Sự thay đổi chỉ số L của các nồng độ chế phẩm chitosan và
nano bạc trong quá trình bảo quản bưởi .................................... 68

Bảng 4.21:

Sự thay đổi chỉ số a của các nồng độ chế phẩm chitosan và
nano bạc trong quá trình bảo quản bưởi .................................... 69

Bảng 4.22:

Sự thay đổi chỉ số b của các nồng độ chế phẩm chitosan và
nano bạc trong quá trình bảo quản bưởi. ................................... 70

Bảng 4.23:

Tỷ lệ hư hỏng của các giống bưởi khác nhau trong quá
trình bảo quản. ........................................................................... 71


8

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1a.

Cấu trúc hóa học của Chitin ........................................................ 4

Hình 2.1b.



Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm men Pichia
của nano bạc .............................................................................. 35

Hình 3.5:

Sơ đồ phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của
nano bạc .................................................................................... 36

Hình 3.6:

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của
phức hợp chitosan - nano bạc.................................................... 38

Hình 4.1:

Khả năng kháng St.aureus (c) và B.cereus (d) của
chitosan ở các nồng độ khác nhau ............................................ 44

Hình 4.2:

Ảnh hưởng của các nồng độ Chitosan đến sự phát triển
của một số loại nấm men: A - Nấm men Pichia, B - Nấm
men Saccharomyces cerevisiae................................................. 46

Hình 4.3.

Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hoạt tính kháng
nấm mốc Penicillium digitatum ................................................ 47


các tỉ lệ phối trộn khác nhau đến hoạt tính kháng nấm
mốc Penicillium digitatum ........................................................ 56

Hình 4.10.

Tỷ lệ hư hỏng của các giống bưởi trog quá trình bảo quản
bằng chế phẩm chitosan - nano bạc .......................................... 71


1

CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hệ thống cây ăn quả ở Việt Nam vô cùng phong phú, đa dạng, cung cấp
ra thị trường nhiều loại quả có giá trị dinh dưỡng cao, không những vậy cây
ăn quả còn cung cấp các sản phẩm có giá trị về mặt xuất khẩu mang lại nguồn
thu nhập không nhỏ cho người dân.
Hầu hết các loại trái cây đều có hàm lượng nước cao, nhiều chất dinh
dưỡng, là môi trường thuận lợi cho các loại vi sinh vật gây hại phát triển làm
cho tỷ lệ quả hư hỏng sau thu hoạch là rất lớn. Cây ăn quả thường mang tính
thời vụ, thu hoạch quả diễn ra trong thời gian ngắn. Vì vậy, việc bảo quan sau
thu hoạch là hết sức cần thiết đối với người sản xuất.
Chitosan - sản phẩm deaxetyl hóa chitin - dẫn xuất của polysaccarit có
nhiều trong vỏ các loài động vật giáp xác. Khi dùng màng chitosan trong bảo
quản thực phẩm giúp điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng khí cho thực phẩm. Màng
chitosan tương đối dai, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được
dùng làm bao gói [4] [10].
Trong công nghệ nano, hạt nano là một vật liệu quan trọng. Một trong
những hạt nano được sử dụng sớm và rộng rãi nhất là hạt nano bạc. Ở kích

phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học.
+ Việc Nghiên cứu tạo phức chất Chitosan - nano Bạc kháng vi sinh vật
gây hư hỏng quả sau thu hoạch khẳng định được tác dụng của phức chất
chitosan - nano Bạc trong kháng vi sinh vật gây hư hỏng qua sau thu hoạch
bằng các nghiên cứu thực nghiệm làm tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng
tiếp theo.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc sản xuất chế phẩm bảo quản an
toàn, có khả kéo dài thời gian bảo quản và giữ được chất lượng sản phẩm,
giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch, nâng cao giá thành của các sản phẩm nông
sản.


3

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Chitosan
2.1.1 Nguồn gốc của Chitin và chitosan
Chitin được Bracannot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn
dịch chiết của một loại nấm và đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm
ra nó. Năm 1823 Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi
là chitin hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ nhưng ông không phát hiện sự có
mặt của nitơ. Cuối cùng cả Bracannot và Odier đều cho rằng cấu trúc của
chitin giống cấu trúc của cellulose [8].
Năm 1929 Karrer đun sôi chitin 24h trong dung dịch KOH 5% và đun
tiếp 50 phút ở 160oC với kiềm bão hòa và ông đã thu được sản phẩm có phản
ứng màu đặc trưng của thuốc thử, chất đó chính là chitosan. Việc nghiên cứu
về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa của chitosan đã được công bố từ
những năm 30 của thế kỷ XX. [8].

Vỏ tôm
Vỏ tôm phế thải hỗn
Vỏ tôm hùm
Càng cua tuyết
Chân cua tuyết
Mai mực ống
Đỉa biển

Hàm lượng chitin theo trọng lượng (%)
11
27
12 - 18
37
24
32
30 - 35
34 - 49

Chitosan là một polysaccharide sinh học với các đơn phân N-acetyl
glucosamine được deacetyl hóa một phần, hiện diện tự nhiên trong vách một
số giống nấm như Mucorales. Tuy nhiên phần lớn chitosan hiện nay được thu
nhận và sử dụng lại chủ yếu từ quá trình deacetyl hóa chitin.
2.1.2. Cấu trúc hóa học của chitosan
Chitosan thu được từ quá trình deacetyl hóa chitin, thay thế nhóm Nacetyl thành nhóm amin ở vị trí C2.
Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước
nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan,
nếu DD < 50% gọi là chitin [8].
Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-Dglucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu
tạo của chitin và chitosan được thể hiện trong hình 2.1 dưới đây.


Ngoài ra các thí nghiệm cũng cho thấy có rất nhiều ion kim loại có thể
ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như: K+, Na+, Mg2+, Ca2+…
Nói chung các kết luận chính xác về cơ chế hoạt động kháng khuẩn của
chitosan vẫn chưa được nghiên công bố rõ ràng, những cơ chế chính đã được
đề xuất như sau [35]:
- Tương tác giữa các ion tích điện dương trên các phân tử chitosan và các
điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi trong cấu trúc
màng tế bào, thay đổi khả năng thẩm thấu gây rò rỉ protein và các thành phần
khác trong tế bào, làm giảm chức năng sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn dẫn
đến mất khả năng bảo vệ, trao đổi chất của tế bào.
- Chitosan đóng vai trò như chất chọn lọc liên kết với các ion kim loại,
sau đó ức chế các chất độc và sự phát triển của vi khuẩn.
- Chitosan liên kết với nước, ức chế các enzyme khác nhau.
- Chitosan thâm nhập vào bào tương của các vi khuẩn và thông qua các
liên kết với DNA, ngăn cản sự tổng hợp ARN và protein.
- Chitosan tạo thành một lớp cao phân tử không thấm nước trên bề
mặt tế bào làm thay đổi tính thấm của tế bào bà ngăn các chất dinh dưỡng
vào tế bào.
- Chitosan có liên kết với các điện tích âm trong tế bào, làm chúng kết
dính thành từng mảng, gây nhiễu loạn các hoạt động sinh lý của các vi sinh
vật dẫn đến phá hủy tế bào.
2.1.4. Ứng dụng của chitosan
- Trong công nghiệp thực phẩm: Để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo
quản thực phẩm, hoa quả, rau tươi… Vì nó tạo màng sinh học không độc.
Người ta đã tạo màng chitosan trên quả tươi để bảo quản quả đào, quả lê, quả
kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà chua, quả vải, xoài, nho… dùng để lọc
trong các loại nước ép quả, bia, rượu vang, nước giải khát …[16]


7


+ Ứng dụng làm trong nước ép táo, cam bằng việc sử dụng dung dịch
chitosan nồng độ 2% trong acid acetic 7% giúp làm giảm độ đục hiệu quả hơn
so với sử dụng betonit và gelatin.
- Bảo vệ màu nước quả: khi cho chitosan vào dung dịch nước quả
thì chitosan sẽ tạo phức với các chất màu có trong nước quả, bao bọc bảo vệ
các phức màu này trước tác dụng của các quá trình chế biến và làm giảm màu
trong quá trình bảo quản.
+ Nhờ sử dụng chitosan trong việc loại bỏ các chất lơ lửng bằng quá trình
lọc và ly tâm, ta cũng có thể ngăn cản được sự nâu hóa do enzyme trong nước
ép táo, lê. Người ta đã bổ sung chitosan với nồng độ 1% trong acid malic 1%
và nhận thấy rằng: sự nâu hóa có thể được ngăn chặn trong nước ép táo bằng
cách thêm ít nhất 200ppm. Người ta sử dụng nồng độ 1000ppm để ngăn chặn
sự nâu hóa trong nước ép lê [40].
+ Cơ chế của nó như sau: chitosan có khả năng kiểm soát sự nâu hóa bởi
enzyme là do chitosan là một polymer tích điện dương tạo tủa với các chất rắn
lơ lửng có khả năng kết hợp với enzyme polyphenol oxydase (PPO).
- Hiệu chỉnh độ chua của nước quả: Người ta thấy rằng việc xử lý
chitosan nồng độ 1,2% trong acid ascorbic đối với nước ép cà rốt và táo
không có tác dụng làm trong nước quả nhưng lại làm giảm đáng kể lượng acid
của dịch ép.
+ Cơ chế: chitosan với một phần mang điện tích dương có khả năng kết
hợp với các phần mang điện tích âm của các acid trong nước quả. Do cơ chế
trên mà chitosan không những được sử dụng để hiệu chỉnh độ chua của nước
quả mà còn có tiềm năng ứng dụng trong các loại thực phẩm khác.
- Chitosan được sử dụng để thay thế hàn the: Đối với sản phẩm giò, chả
sử dụng chitosan với hàm lượng 2,5g/kg thịt thì thấy sản phẩm ngon, mặt
hồng mịn, thơm mùi thịt, dai và có khả năng bảo quản tương tự như sử dụng
hàn the [18].


sự đã xác định được chitosan có tác dụng hạ 5,8-42,6% hàm lượng cholesterol
trong huyết tương và 15,1 -35,1% trong cơ thể [37].


10

- Chitosan là loại polymer tích điện dương tự nhiên duy nhất có khả năng
chuyển thành dạng nhớt khi hòa tan trong môi trường axit. Nhờ tính chất này
mà chitosan được ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc tóc. Ngoài ra còn được
sử dụng trong sản phẩm chăm sóc da, do có tính bảo vệ, giữ độ ẩm, tạo màng
trên da đồng thời gắn kết với các dưỡng chất cần thiết tạo điều kiện cho các
chất này hoạt động tích cực trên da [38].
2.2. Tổng quan về nano bạc
2.2.1. Giới thiệu về công nghệ nano
2.2.1.1. Vật liệu nano
Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước cỡ nano
mét (1nm = 10-9 m). Đây là đối tượng nghiên cứu và là mối liên kết của 2
lĩnh vực khoa học nano và công nghệ nano. Tính chất của vật liệu nano bắt
nguồn từ kích thước của chúng, vào cỡ nanômét, đạt tới kích thước tới hạn
của nhiều tính chất hóa lý của vật liệu thông thường. Kích thước của vật liệu
nano trải một khoảng từ vài nm đến vài trăm nm phụ thuộc vào bản chất vật
liệu và tính chất cần nghiên cứu [6].
2.2.1.2. Phân loại vật liệu nano
Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano. Sau đây là một cách phân loại
dựa vào hình dáng vật liệu (Nguyễn Hoàng Hải) [6].
- Vật liệu không chiều là vật liệu mà ba chiều đều có kích thước nano, ví
dụ: chấm lượng tử...
- Vật liệu một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví
dụ: dây nano, ống nano…
- Vật liệu hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví

Trong tự nhiên, bạc tồn tại hai dạng đồng vị bền là Ag-107(52%) và Ag109(48%). Bạc không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng
tan trong một số axit mạnh như axit nitric, sulfuric đặc nóng…
Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa khi
chúng được chế tạo bằng công nghệ nano. Trên thị trường cũng đã xuất hiện
nhiều sản phẩm chứa nano bạc như băng gạc y tế, nước tẩy trùng bề mặt,
trong tủ lạnh, máy giặt gia đình…
Theo Trần Linh Thước (2009) [14], bạc nano là vật liệu có diện tích bề
mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo sau:
- Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng
ngoại đi xa, chống tĩnh.
- Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao,
không có phụ gia hóa chất.
- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong
các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như
benzene, toluene).
- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và
các tác nhân oxy hóa khử thông thường.
- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp.
- Ổn định ở nhiệt độ cao.


12

2.2.3. Tổng quan về hạt nano bạc
Nano bạc là các hạt bạc có kích thước dao động từ 1 nm đến 100 nm. Do
có diện tích bề mặt lớn, hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với
các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn. Các hạt nano bạc
có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo nên màu sắc
từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc
phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano.

đường tự do trung bình thì hiện tượng dập tắt không còn nữa mà điện tử sẽ
dao động cộng hưởng với ánh sáng kích thích. Do vậy, tính chất quang của
hạt nano bạc có được do sự dao động tập thể của các điện tử dẫn đến từ quá
trình tương tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao động như vậy, các điện tử sẽ
phân bố lại trong hạt nano bạc làm cho hạt nano bạc bị phân cực điện tạo
thành một lưỡng cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ thuộc
vào nhiều yếu tố nhưng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt nano bạc và
môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất [30].
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM_transmission electron
microcope) để quan sát hình dạng và kích thước hạt nano bạc và sử dụng thiết
bị đo phổ hấp thụ UV-VIS để quan sát hiệu ứng cộng hưởng plasmon của hạt
nano bạc [30].
Ngoài ra, mật độ hạt nano bạc cũng ảnh hưởng đến tính chất quang. Nếu
mật độ loãng thì có thể coi như gần đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải
tính đến ảnh hưởng của quá trình tương tác giữa các hạt [30].


14

b, Tính chất điện, tính chất nhiệt
Bạc là một kim loại dẫn điện tốt nhất trong các kim loại. Bạc có mật độ
điện tử tự do cao nên điện trở của bạc rất nhỏ [6].
Đối với vật liệu bạc ở dạng khối, các lý thuyết về độ dẫn được tính
toán dựa trên cấu trúc vùng năng lượng của chất rắn. Khi kích thước của
vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời rạc cấu trúc hóa
cấu trúc vùng năng lượng. Hệ quả của quá trình lượng tử hóa này đối với
hạt nano bạc là I-U (Sự liên hệ giữa dòng điện và điện trường) không còn
tuyến tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu ứng chắn Coulomb
(Coulomb blockade) làm cho đường I - U bị nhảy bậc với giá trị mỗi bậc
sai khác nhau một lượng e/2C đối với U và e/RC đối với I. Trong đó e là