B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN THANH TNG

NGHIÊN CứU MốI LIÊN QUANGIữA ĐA HìNH KIểU
GEN
MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY
XƯƠNG
ĐốT SốNG ở PHụ Nữ MãN KINH

LUN VN THC S Y HC


H NI 2017
B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN THANH TNG

NGHIÊN CứU MốI LIÊN QUANGIữA ĐA HìNH KIểU
GEN
MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY
XƯƠNG
ĐốT SốNG ở PHụ Nữ MãN KINH

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình, những
người thân đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017


Học viên

Nguyễn Thanh Tùng
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thanh Tùng, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 chuyên ngành
Sinh lý học, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Huy Bình, TS. Nguyễn Thị Thanh Hương.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi
nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017


F

Forward primer

Hcy

Homocystein

MTHFR

Methylen Tetrahydrofolat Reductase

MĐX

Mật độ xương

Rw

Reverse wild type primer

Rm

Reverse mutation primer

SNP

Single nucleotide polymorphism


MỤC LỤC

2.3.1. Thời gian nghiên cứu......................................................................30
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu.......................................................................30
2.4. Quy trình nghiên cứu............................................................................30
2.5. Các phương pháp và công cụ thu thập số liệu.......................................31
2.5.1. Quy trình lấy máu và bảo quản.......................................................31
2.5.2. Đánh giá gãy xương đốt sống trên X Quang...................................32
2.6. Các bước tiến hành phân tích gen.........................................................32
2.6.1. Tách DNA.......................................................................................32
2.6.2. Qui trình xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR...............................33
2.6.3. Phương pháp giải trình tự gen.........................................................35
2.7. Các biến số nghiên cứu.........................................................................36
2.8. Phân tích và xử lý số liệu......................................................................37
2.9. Đạo đức nghiên cứu..............................................................................37
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.........................................................38
3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu.....................................................38
3.1.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu.....................................38
3.1.2. Đặc điểm mật độ xương của đối tượng nghiên cứu........................39
3.1.3. Đặc điểm gãy xương của đối tượng nghiên cứu.............................39
3.2. Xác định đa hình kiểu gen MTHFR C677T..........................................41
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA..................................................................41
3.2.2. Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp
ARMS PCR.....................................................................................43
3.2.3. Kết quảxác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương phápgiải
trình tự gen......................................................................................44
3.2.4. Phân bố kiểu gen và tần số alen của đa hình MTHFR C677T của
đối tượng nghiên cứu......................................................................45
3.3. Mối liên quan giữa kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống
của đối tượng nghiên cứu......................................................................46




DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Giá trị tham chiếu thang định lượng trên người Việt Nam.........10

Bảng 1.2.

Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO............................11

Bảng 1.3.

Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm2) trong quần thể của phụ nữ
Việt Nam đo bằng máy Hologic..................................................12

Bảng 1.4.

Vị trí và các kiểu đa hình gen MTHFR.......................................20

Bảng 1.5.

Bảng phân bố tần số đa hình kiểu gen MTHFR C677T trên thế giới21

Bảng 2.1.

Thành phần phản ứng PCR.........................................................33

Bảng 2.2.

Trình tự chuỗi DNA mồi.............................................................34


Bảng 3.7.

Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật độ
xương cổ xương đùi của đối tượng nghiên cứu..........................46

Bảng 3.8.

Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ
xương đầu trên xương đùi của đối tượng nghiên cứu.................47

Bảng 3.9.

Mốiliên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật độ
xương cột sống thắt lưng của đối tượng nghiên cứu...................47

Bảng 3.10. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới gãy
xương của đối tượng nghiên cứu................................................48


Bảng 3.11. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với tuổi của
đối tượng nghiên cứu..................................................................48
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với chiều
cao của đối tượng nghiên cứu.....................................................49
Bảng 3.13. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới cân
nặng của đối tượng nghiên cứu...................................................49
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới BMI
của đối tượng nghiên cứu............................................................50
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới số năm
mãn kinh của đối tượng nghiên cứu............................................50

Sự phân bố kiểu gen của đa hình MTHFR C677T ở một số
cộng đồng................................................................................58


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Phân loại gãy xương đốt sống qua đánh giá bằng X-Quang........6

Hình 1.2.

Thay đổi hình dáng đốt sống.........................................................7

Hình 1.3.

Hình ảnh gãy nhẹ..........................................................................8

Hình 1.4.

Cách đặt điểm xác định 3 trục cột sống........................................9

Hình 1.5.

Mô hình xương bình thường và loãng xương.............................10

Hình 1.6.

Quá trình tái mô hình (remodeling) xương xảy ra theo trình tự
khởi động, phân hủy, tạm ngưng và tạo xương...........................13



Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp
ARMS – PCR..............................................................................43

Hình 3.2.

Kết quả giải trình tự gen..............................................................44

Hình 4.1.

Quá trình chuyển hóa acid folic và folat.....................................66

Hình 4.2.

Quá trình chuyển hóa Homocystein............................................66


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Gãy xương đốt sống là biểu hiện kinh điển của bệnh lý loãng xương
[1]. Tuy nhiên, đa số các trường hợp gãy xương đốt sống thường không có
triệu chứng, chỉ khoảng 30% các trường hợp được chẩn đoán ngẫu nhiên và
tới 70% các trường hợp không được phát hiện [2].
Kết quả từ các nghiên cứu dịch tễ ở người Âu Mỹ cho thấy, cứ 100
người sau độ tuổi 50 thì có khoảng 20 người bị gãy xương đốt sống. Ở phụ nữ
sau mãn kinh, tỷ lệ gãy xương đốt sống thay đổi từ 15% tới 25%, đồng thời có
sự khác biệt cao của tần suất gãy xương đốt sống giữa các quốc gia và các dân
tộc [3]. Tần suất gãy xương đốt sống gia tăng theo độ tuổi cũng ghi nhận được
ở cả hai giới, và nữ có xu hướng tăng nhiều hơn nam [3]. Khoảng 50% phụ nữ

dự đoán nguy cơ gãy xương [13]. Năm 2011, nghiên cứu của H. Wang và
cộng sự phân tích 20 nghiên cứu đã cho thấy sự tương quan mức độ nhẹ giữa
MTHFR C677T với mật độ xương và nguy cơ gãy xương [14]. Tuy vậy, năm
2013 nghiên cứu của Guan tổng hợp số liệu của 7 nghiên cứu bệnh chứng lại
chỉ ra đa hình MTHFR C677T không liên quan đến gãy xương ở phụ nữ mãn
kinh [15]. Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được công bố phân tích mối
liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương do loãng
xương. Để chẩn đoán sớm và tiên lượng nguy cơ gãy xương do loãng xương ở
phụ nữ mãn kinh nhằm dự phòng và điều trị kịp thời, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu: “Nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình kiểu genMTHFR
C677Tvới mật độ xương và nguy cơ gãy xương đốt sống ở phụ nữ mãn
kinh”với mục tiêu là:
1. Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T ở phụ nữ mãn
kinh Việt Nam.
2. Xác định mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFRC677T với
mật độ xương và nguy cơ gãy xương đốt sống ở phụ nữ mãn kinh
Việt Nam.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về gãy xương đốt sống
1.1.1. Định nghĩa
Gãy xương do loãng xương là gãy xương do chấn thương nhẹ, gãy
xương do loãng xương là gãy vi cấu trúc.
Bệnh nhân bị loãng xương có nguy cơ cao đối với gãy xương đặc biệt
là đốt sống, gãy xương cổ tay và cổ xương đùi [16]. Gãy xương đốt sống là
hình thái phổ biến nhất và xuất hiện sớm nhất của gãy xương do loãng xương

gãy xương đốt sống ở phụ nữ sau mãn kinh tại các nước này là 10 và 30%
[8], [9], [10]. Tại Việt Nam tỷ lệ gãy xương đốt sống ở nam là 23% và ở nữ
là 26% [1].
Gãy xương do loãng xương gây tổn thất lớn cho nền kinh tế quốc gia.
Ở châu Âu năm 2010 số tiền mà xã hội phải chi trả cho bệnh nhân loãng
xương là 37 tỉ Euro [5]; ở Mỹ mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca gãy xương
tương đương với khoảng 17 tỉ đô la.
Hình thái gãy xương đốt sống do loãng xương hay gặp nhất là gãy bờ
tức là bờ trước của xương bị sụp trong khi bờ sau không thay đổi, vị trí gãy
thường xảy ra ở những vùng chuyển tiếp do đặc điểm chịu lực của những đốt
sống này. Đáng chú ý là 2/3 số bệnh nhân gãy xương đốt sống do loãng xương
bị bỏ sót chẩn đoán do nó diễn biến thầm lặng không có triệu chứng [16], do
đó khi phát hiện ra thì tổn thương thường nặng nề ảnh hưởng nhiều đến chất
lượng cuộc sống. Tỷ lệ tử vong do gãy xương ở phụ nữ là 50% đối với gãy cổ
xương đùi, 28% đối với gãy xương đốt sống và 22% do các gãy xương khác
[18].


5

1.1.3. Chẩn đoán gãy xương đốt sống do loãng xương
1.1.3.1. Tiêu chuẩn xác định gãy xương đốt sống trên X-Quang
Tiêu chí cho hình ảnh X Quang rõ nét
Kiểm tra gãy đốt sống do loãng xương chủ yếu dựa vào hình ảnh X
Quang, thường là X Quang thẳng và nghiêng cột sống lưng, thắt lưng. Xác
định mức độ gãy thì chỉ cần X Quang nghiêng là đủ. Khoảng cách từ tiêu
điểm phát bức xạ đến phim (focus-to-film distance-FFD) thường là 100 cm. X
Quang lưng tâm sẽ là T7, thắt lưng là L3 [20].
Hiện nay có hai phương pháp chính để chẩn đoán gãy xương đốt sống
trên X-Quang.

Trước

Giữa

Gãy xương độ 2

Gãy xương độ 3

Hình 1.1. Phân loại gãy xương đốt sống qua đánh giá bằng
X-Quang (chỉ số Genant)

Sau


7

Hình 1.2. Thay đổi hình dáng đốt sống
(Part II: Radiological assessment of vertebral fracture)


8

Hình 1.3. Hình ảnh gãy nhẹ (các đốt đánh dấu sao)
(Part II: Radiological assessment of vertebral fracture)
Thang Genant dễ dàng xác định gãy vừa và nặng. Với gãy nhẹ có thể
căn cứ vào tiêu chí đĩa cùng của đốt đang xét không tiếp giáp, không song
song với đĩa cùng của đốt kế cận.
Một ưu điểm của Genant là mức độ nặng nhẹ không tỷ lệ với loại gãy
(bờ-nêm-wedge, lõm-đĩa-biconcavity hay nén-lún-crush).
Thang định lượng

xương suy giảm và làm tăng nguy cơ gãy xương. Bởi vì các tế bào hủy xương là
những tế bào chính trong quá trình phân hủy xương, hầu hết các thuốc được phát
triển để điều trị loãng xương đều đặt mục tiêu ức chế các tế bào hủy xương.
Theo định nghĩa của WHO (2001): Loãng xương được đặc trưng bởi sự
thay đổi sức mạnh của xương. Sức mạnh này được đặc trưng bởi mật độ xương
và chất lượng xương. Chất lượng xương được đánh giá bởi cấu trúc của xương,
chu chuyển xương, độ khoáng hóa, tổn thương tích lũy, tính chất của các chất cơ
bản của xương. Trong đó, chu chuyển xương đóng một vai trò quan trọng.

Hình 1.5. Mô hình xương bình thường và loãng xương
(Nguồn: www.tudu.com.vn)


11

1.1.4.2.Chẩn đoán loãng xương
Từ năm 2002, các hội nghị quốc tế về loãng xương đã thống nhất
quan điểm về giá trị của các loại máy đo mật độ xương: máy đo mật độ xương
dùng siêu âm chỉ có giá trị tầm soát, chỉ có máy sử dụng tia X năng lượng
kép, được gọi là Dual Energy X-ray absorptiometry (DXA) mới có giá trị
chẩn đoán.
Nguyên tắc của phương pháp sử dụng tia X năng lượng kép là dùng tia
X có 2 mức năng lượng khác nhau quét qua một khối xương, máy sẽ đo độ
hấp thụ năng lượng tia X của xương và tính được mật độ xương (Bone
mineral density).
Sau khi đã đo BMD, người ta tính chỉ số T (T-score) là chỉ số BMD của
cá thể đó so với BMD tối đa của quần thể trẻ tuổi làm chuẩn. BMD tối đa phải
được ước tính từ một quần thể mang tính đại diện cao cho một dân tộc (vì
BMD khác biệt giữa các dân tộc). Chỉ số T được tính theo công thức sau đây:
- iBMD là mật độ xương của đối tượng i.

Đầu trên xương đùi
Cột sống thắt lưng

Mật độ xương đỉnh
pBMD (SD)
0,80 (0,10)
0,86 (0,10)
0,98 (0,11)

Tuổi mật độ
xương đạt đỉnh
25
32
30

1.1.5. Cơ chế bệnh sinh của loãng xương và gãy xương do loãng xương
Quá trình phát triển của xương phải trải qua hai giai đoạn: tạo mô
hình (modelling) và tái tạo mô hình (remolling) để biệt hóa các nhóm tế
bào xương giúp cho sự tạo thành xương hoặc làm mới xương [28]. Tạo mô
hình là quá trình chu chuyển xương lúc còn nhỏ (tuổi vị thành niên) có
chức năng là tạo hình dạng và chiều dài cho xương. Tái tạo mô hình là quá
trình bộ xương liên tục sửa chữa và tự làm mới. Quá trình này có chức
năng duy trì BMD ở mức tối ưu [29],[30].
Các tế bào tham gia vào quá trình tạo xương bao gồm: tế bào hủy
xương, tế bào tạo xương, cốt bào và các tế bào liên kết. Trong điều kiện
bình thường, chức năng của tế bào hủy xương và tế bào tạo xương hoạt
động song song và mức độ tương đương nhau, với tín hiệu của loại tế bào
này ảnh hưởng tới loại tế bào kia do đó lượng xương bị phân hủy bằng
lượng xương mới tạo thành.