1

ĐẶT VẤN ĐỀ
U nguyên bào thần kinh đệm - Glioblastoma (GB) là loại u não
nguyên phát của hệ thần kinh trung ương, chiếm khoảng 15-20% các u nội
sọ [1]. Tổ chức Y tế Thế giới phân loại U nguyên bào thần kinh đệm là loại
ác tính nhất (độ IV) [2]. Tỉ lệ U nguyên bào thần kinh đệm ở nam cao hơn
nữ giới, tuổi phát hiện trung bình khoảng 64 tuổi [3].
U nguyên bào thần kinh đệm là loại u rất ác tính, thường hình thành
trong chất trắng não, phát triển nhanh chóng, và có thể thành khối u lớn trước
khi xuất hiện triệu chứng. Biểu hiện lâm sàng đầu tiên thường bằng hội chứng
tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời
gian sống thêm của bệnh nhân sau mổ trung bình chỉ 10 -12 tháng [4].
Do vậy, việc tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và quá trình sinh
bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm để có thể can thiệp chính xác và
hiệu quả, đồng thời đưa ra tiên lượng bệnh là điều rất cần thiết. Các nhà khoa
học trên thế giới đã tìm thấy sự biến đổi một số gen như RTEL1, TP53, RB1,
NF1, PIK3R1, ERBB2, EGFR, IDHl [5-8]… trong đó gen RTEL1 được phân
loại như một gen ức chế khối u, khi gen bị đột biến, tế bào bị tổn thương,
DNA sẽ không được sửa chữa và kiểm soát dẫn đến hình thành và phát triển
thành khối u [9-12].
Gen RTEL1 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 20, dài 40,889kb, gồm
40exon. Các đột biến hay gặp của gen trên u nguyên bào thần kinh đệm là
các đột biến điểm. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy một số đa hình
gen như SNPrs6010620, SNPrs2297440 trên intron 12 của gen RTEL1 có
liên quan mật thiết tới nguy cơ mắc bệnh u nguyên bào thần kinh đệm [9-14].
Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về xác định một số đa hình trên gen


2


hematopoietic), U tế bào mầm (germ cell tumous), U vùng hố yên (tumor of
the sellar region), U di căn (metastatic tumouSNPrs).
3.

Tình hình mắc bệnh trong nước và trên thế giới
Ngày nay, ung thư đã trở thành một vấn đề sức khoẻ mang tính chất toàn

cầu. Theo thống kê của tổ chức ung thư thế giới (IARC) hàng năm trên thế giới
có khoảng 12,7 triệu ca mắc mới với 7,6 triệu ca tử vong, trung bình mỗi ngày
trên thế giới có khoảng 21.000 trường hợp tử vong do ung thư [15],[16]. Ước
tính đến năm 2050 thế giới sẽ có thêm khoảng 27 triệu ca ung thư mới mỗi
năm với khoảng 17,5 triệu bệnh nhân tử vong. Có một thực tế rằng tỷ lệ mắc
ung thư đang chậm lại ở các nước phát triển, nhưng lại tăng cao tại các nước
đang phát triển trong đó có Việt Nam. Rõ ràng chúng ta cần phải có những
biện pháp kịp thời để ngăn ngừa sự hình thành và tiến triển cũng như nâng cao
hiệu quả trong việc điều trị ung thư [17].


4

Từ những nghiên cứu đột phá trong Y học, cơ chế phân tử của ung thư
dần được sáng tỏ. Theo đó, chính sự tích lũy đột biến gen theo thời gian dẫn
tới sự phát sinh, phát triển mọi dạng tế bào ung thư trong cơ thể. Quá trình
chuyển dạng tế bào sang ác tính thường được đánh dấu bằng sự kích hoạt các
gen gây ung thư và đột biến gây bất hoạt các gen áp chế ung thư nằm tại một
số vị trí chủ chốt trên các con đường tín hiệu tế bào [18],[19]. Cơ chế điều
hòa gen vốn hoạt động nhịp nhàng và chặt chẽ cũng bị rối loạn khiến hệ thống
các enzym sửa chữa thương tổn gen của tế bào không thể khắc phục dẫn tới
việc tích lũy một số lượng lớn các đột biến, khởi phát quá trình ung thư [20],
[21]. Nhưng cũng chính các đột biến lại làm tăng ái lực của thuốc điều trị đích

phân loại U nguyên bào thần kinh đệm như một u tế bào hình sao
(Astrocytoma) cấp III và IV với độ ác tính cao [33],[34]. Hầu hết các bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm khi được chẩn đoán là khối u nguyên phát và
một số bệnh nhân là u thứ phát và phát triển từ khối u thần kinh đệm có mức độ
ác tính thấp hơn. Tỷ lệ mắc U nguyên bào thần kinh đệm trên thế giới được
thống kê là khoảng 3-5 ca trên 100.000 dân. Nghiên cứu của Richard Johnson
và cộng sự cho thấy năm 2010 có khoảng 10.800 bệnh nhân tại Hoa Kỳ được
chẩn đoán u nguyên bào thần kinh đệm, trong đó có gần 10 nghìn ca tử vong.
Tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm ở nam giới xấp xỉ 1.6 lần so nữ giới. Tỷ
lệ U nguyên bào thần kinh đệm phát hiện ra nhiều nhất vào độ tuổi từ 45 đến
62 và dưới 10% các trường hợp ung thư dạng này xảy ra ở trẻ em [25],[26].
1.3. Đặc điểm mô bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm
Các tế bào của u nguyên bào thần kinh đệm có nguồn gốc phôi thai
giảm biệt hoá tăng sản được chia thành 2 loại dựa vào nguồn gốc phát sinh là
u phôi thai tiên phát (60%) và u thứ phát từ tế bào hình sao [34].
Hình ảnh đại thể của u nguyên bào thần kinh đệm khá điển hình với
ranh giới hình vòng cung không rõ rệt, cắt ngang u có thể gặp màu xám hay
hồng, có điểm hoại tử màu vàng hoặc ở vùng có xuất huyết thì màu đỏ hoặc
nâu thâm. Thành mạch máu trong u tăng sinh dày, có thể gặp u thể nang hay


6

nhiều ô, u thường có mật độ mềm và chỉ cứng khi xâm lấn dánh vào màng
não gây chảy máu [35],[36].
Hình ảnh vi thể của các khối u nguyên bào thần kinh đệm rất khác nhau.
Khối u luôn dày đặc tế bào, nhưng có thể đồng dạng hoặc đa hình với nhiều
giai đoạn trung gian giữa hai loại tế bào. Tính biệt hoá thấp, tạo sự giảm thiểu
các nhánh bào tương và nhân bắt màu đậm, đa hình thái [35],[36]. Có 3 thể u
chủ yếu sau:

nội mô xếp lại thành từng cụm [37]. Nhân tế bào nội mô trải rộng hay gặp
hình nhân chia. Đôi khi có một số biến đổi như các điểm mao mạch thành dày
lòng mao mạch giãn rộng tạo ra hình ảnh sao mạch [38].
Theo phân loại trên u biểu mô thần kinh có 9 loại, trong đó có u tế bào
sao. U tế bào sao gồm có u tế bào sao thể lông, u biểu mô tế bào sao khổng lồ
màng nội tủy (độ I), u biểu mô tế bào sao hỗn hợp màu vàng, u tế bào sao lan
tỏa là độ II, có độ ác tính thấp. U tế bào sao thoái triển (độ III), u nguyên bào
thần kinh đệm (độ IV) có độ ác tính cao [2].


8

1.4. Chẩn đoán u nguyên bào thần kinh đệm
1.4.1. Triệu chứng lâm sàng và những dấu hiệu thường gặp
Trong giai đoạn sớm, bệnh nhân không có các triệu chứng điển hình và
thường dễ dàng bị bỏ qua [32].
Trong giai đoạn bệnh tiến triển, bệnh nhân xuất hiện các triệu chứng
của tăng áp lực nội sọ do sự phát triển của khối u. Các triệu chứng bao gồm
những cơn đau đầu dữ dội vào các buổi sáng và giảm hơn trong ngày. Các
hoạt động làm gia tăng áp lực nội sọ như ho, hắt hơi, cúi xuống hoặc làm
các công việc nặng đều làm gia tăng mức độ của các cơn đau. Tăng áp lực
nội sọ khiến bệnh nhân có thể bị rối loạn tầm nhìn và rối loạn khả năng
thăng bằng [33],[34].
Ngoài ra, bệnh nhân còn có thể xuất hiện một số triệu chứng liên quan
đến vị trí của khối u như: thay đổi về tính cách và trí tuệ, khó khăn trong việc
diễn đạt ngôn ngữ, khó khăn trong việc thực hiện các di chuyển phối hợp, liệt
hoặc suy yếu nửa người…[31],[32].
Soi đáy mắt bệnh nhân có thể có phù gai thị, một dấu hiệu của tăng áp
lực nội sọ.
1.4.2. Các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh

triệu chứng [31]. Tuy nhiên các can thiệp này đem lại kết quả rất hạn
chế.
Phẫu thuật
Mục tiêu của việc phẫu thuật là loại bỏ u và không gây tổn thương đến tổ
chức não lành. Tuy nhiên mục tiêu đó đạt được hay không còn phụ thuộc vào
vị trí u nông hay sâu, u có giới hạn rõ hay không. Liên quan với u, khối lượng
u và trình độ chuyên khoa của phẫu thuật viên. Nhờ chụp cắt lớp vi tính và


10

kính hiển vi phẫu thuật người ta có thể lấy bỏ u một cách triệt để hơn. Tuy
nhiên không phải loại u nào cũng có thể lấy bỏ triệt để được, u màng não có
giới hạn rõ nhưng đôi khi cũng chỉ lấy được một phần.
U não ở sâu, ở hành não, thân não, ở các mạch máu lớn, ở nền sọ thì việc
lấy bỏ u sẽ rất khó khăn vì gần trung khu hô hấp, tim mạch và khó cầm máu.
Điều trị tia xạ
Tia phóng xạ trước hết được dùng để diệt những tế bào ác tính còn lại
sau khi cắt bỏ hoặc những u ác tính ở sâu mà người ta chỉ phẫu thuật tối thiểu
Stereotaxy với kết quả giải phẫu bệnh kèm theo. Người ta còn dùng để ngăn
không cho các u lành tính hoặc tương đối lành tính tái phát như Adenoma
tuyến yên hoặc Craniopharynoma. Nói chung trong những năm qua điều trị
các u não bằng tia phóng xạ đã có những bước tiến đáng kể do sự tiến bộ của
trang thiết bị máy móc. Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não,
phẫu thuật an toàn, hiệu quả cao.
Điều trị hoá chất
Hiện nay kết quả điều trị u ác tính bằng hoá chất rất đáng khích lệ,
nhưng đối với u của mô não chưa thay đổi rõ rệt về tiên lượng. Người ta
khuyên chỉ nên dùng các hoá chất trong những trường hợp u ác tính phát triển
nhanh, cụ thể đối với các loại U nguyên bào thần kinh đệm, Astrocytoma độ

vào khoảng 15 tháng và chỉ có một tỷ lệ nhỏ dưới 5% tổng số các bệnh nhân
có thời gian sống sau 5 năm [26],[31].
1.5. Cơ chế bệnh sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
1.5.1. Các yếu tố nguy cơ


12

Yếu tố di truyền: các yếu tố di truyền có tác động vào sự xuất hiện một
số loại u não như u nguyên bào võng mạc cũng như u thần kinh da. Trong
nhóm u xơ thần kinh typ 1, các u tế bào hình sao hay gặp nhiều gấp 4 lần.
Nhóm 2 (được đặc trưng bởi u dây VIII hai bên) là tập hợp rất nhiều u khác
nhau (u thần kinh đệm ngoại biên, u xơ thần kinh, u màng não, u thần kinh
đệm). Các u nguyên bào mạch trong não và trong ống sống thường xuất hiện
với bệnh Von Hippel Lindau.
Suy giảm miễn dịch làm tăng nguy cơ mắc các u lymphô ở não.
Khoảng 20% bệnh nhân có biểu hiện suy giảm miễn dịch kéo dài và từ 5%
đến 8% bệnh nhân AIDS bị u lymphô ác tính, thường là lympho B.
1.5.2. Cơ chế bệnh sinh
Cơ chế phân tử và vai trò của đột biến gen trong u nguyên bào thần
kinh đệm:
Nghiên cứu đầu tiên về tổn thương gen trong u nguyên bào thần kinh
đệm được công bố khoảng 35 năm trước đây. Trong nhiều năm sau đó, những
gen đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh ung thư như thụ thể yếu tố phát
triển nguyên bào sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), thụ thể yếu tố
phát triển biểu mô (epidermal growth factor receptor, EGFR), gen áp chế ung
thư TP53 đã được nghiên cứu [41,42]. Bên cạnh đó một số gen đánh giá mức
độ ác tính và biệt hoá, hay kiểm soát sự phân chia của tế bào ung thư như
RTEL1 và Hes3 cũng được xem xét và đánh giá trong u nguyên bào thần kinh
đệm. Dựa trên tình trạng đột biến gen, các nhà khoa học, các bác sỹ lâm sàng

thái đơn nucleotid là sự khác nhau về trình tự DNA xảy ra khi một nucleotid
đơn A, T, C hay G ở trong bộ gen (hay trong các trình tự được phân lập khác)
bị thay đổi, khác nhau giữa các cá thể của một loài hay giữa các cặp nhiễm
sắc thể (NST) của một người (Hình 1.3). Bộ gen người với 23 cặp NST (22
cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính) chứa khoảng 3,2 tỉ bp. Giống nhau


14

giữa các cá thể đến trên 99% và khoảng 1% sự khác biệt còn lại chủ yếu biểu
hiện bởi các SNP.
Đa hình gen SNP là một hiện tượng phổ biến, được coi là hậu quả của
những đột biến điểm thay thế một cặp nucleotid. Theo ngân hàng dữ liệu của
NCBI tính đến ngày 16/10/2014 bộ gen người có 112,736,879SNP. Tính trung
bình, cứ khoảng 3000 bp thì lại xuất hiện một SNP. Những biến thể này được
xem như là các đánh dấu sinh học, giúp xác định vị trí các gen liên quan đến
bệnh. Khi các SNP xảy ra trong gen hoặc trong một khu vực gần một gen quy
định, nó có thể có vai trò trực tiếp đến sự xuất hiện bệnh bằng cách ảnh hưởng
đến chức năng của gen.

Hình 1.2. Hình ảnh minh họa hiện tượng đa hình thái đơn nucleotid SNP
(Nguồn: )
Sự khác biệt trong trình tự DNA ở người có liên quan đến những khác
biệt trong sự phát triển bệnh, đáp ứng với các tác nhân gây bệnh, hóa chất,
thuốc, vaccine và các tác nhân khác. Trong nghiên cứu y sinh học, các nhà
nghiên cứu tiến hành so sánh trình tự gen của các nhóm người khác nhau
(giữa nhóm người bị bệnh và không bị bệnh...) để từ đó xác định mối liên


15

16

gen RTEL-1 có liên quan mật thiết với bệnh u tế bào thần kinh đệm [29].
Chính vì vậy, những đột biến điểm này trở thành tiêu chuẩn quan trọng để
tiên lượng sự sống sót của các bệnh nhân u não.
Một nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Xinan, Tứ Xuyên, Trung
Quốc đã nghiên cứu trên 110 bệnh nhân UNBTKĐ và 134 người khỏe mạnh.
Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra mối liên hệ giữa telomera kéo dài
helicase1 (RTEL1) đa hình của gen và sự nhậy cảm đối với u nguyên bào thần
kinh đệm với kết luận kiểu gen GG của SNPrs6010620 tăng nguy cơ u
nguyên bào thần kinh đệm (với OR= 2,706; 95%; CI= 1,0197-7,187; p
8
bản
sao

16
bản
sao

32
bản
sao

236= 68 tỷ
bản sao


18

Số lượng sản phẩm DNA tạo thành khi hoàn thành phản ứng PCR được
biểu thị bằng công thức sau:
N = 2n
N: số lượng bản copy sản phẩm tạo thành
n là số chu kỳ của phản ứng.
1.7.2. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các
nucleotid trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như
trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.
Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với
nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các
deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn của

được thiết kế trên nguyên tắc của Sanger. Với các máy thế hệ mới sau này,
người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP.
Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và
chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như
trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một
vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ
phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và
chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận
diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích. Phương
pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột biến, đặc biệt là các
đột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc phát hiện một số
SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen.

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


21

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nhóm chứng: 80 đối tượng
Tiêu chuẩn lựa chọn: người khoẻ mạnh, không có bất kỳ một khối u
hay ung thư một cơ quan nào, không mắc các bệnh mãn tính, đặc biệt là các
bệnh lý về phổi.
Nhóm bệnh: Nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
Tiêu chuẩn lựa chọn: 80 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng mô
bệnh học tại Bệnh viện Việt Đức là u nguyên bào thần kinh đệm.
Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan
nào khác.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

 Quy trình pha một số hóa chất:


23

Dung dịch Lysis buffer
Hóa chất

Nồng độ

Lượng hóa chất

Sucrose

0,3M

51.3gram

Trisbase HCl (pH=7,5)

0,01M

0.785gram

MgCl2

0,005M

0,2375 gram




24

 dNTP, PCR grade (Hãng QIAGEN-Đức, 250µl).
 Sử dụng các cặp mồi được gắn với chất huỳnh quang đặc hiệu.

- Hóa chất chạy điện di:
 Sample Loading Solution (SLS).
 Size Standard 600.
 Mineral Oil.
 Buffer Plate, Sample Plate 96 wells.
- Hoá chất để giải trình tự gen:
 Big dye.
 Cột lọc.
 SAM solution.
 Terminator Solution.
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang.
Dựa vào công thức tính cỡ mẫu:

n= Z21-α/2
Trong đó α = 0,05

p = 0,5

ε = 0,22

Thay vào ta được: