TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

`

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, Tháng 5 năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE NAP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

`

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Sinh viên

Lê Thị Hoàng Anh


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài khóa luận này do chính tôi thực hiện tại Viện
nghiên cứu khoa học và ứng dụng - Trường đại học Sư phạm Hà Nội 2, dưới
sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên cứu là
của riêng tôi, không trùng lặp, không sao chép từ bất cứ khóa luận nào. Kết
luận được đánh giá bằng kết quả thực nghiệm đã thực hiện hoàn toàn trung
thực, không bịa đặt. Trong khóa luận có tham khảo một số tài liệu từ một số
tác giả, tôi xin phép các tác giả nhằm bổ sung cho sự chính xác và tin cậy của
khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Lê Thị Hoàng Anh


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT

Nội dung

Ký hiệu viết tắt

1


VLC tạo ra từ môi trường nước vo gạo

VLC - MTG

6

Giờ

h


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng VLC ................. 6
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy G. xylinus ...................................................... 13
Bảng 2.2. Kết quả đo đường chuẩn của thuốc BH ở bước sóng 345nm (n=3)
......................................................................................................... 16
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS với pH tương ứng là 2; 12; 6,8cm ............... 18
Bảng 3.1. Khối lượng và tỉ lệ thuốc BH hấp thụ vào VLC (n = 3)................. 24
Bảng 3.2. Giá trị OD345nm trung bình của Berberin giải phóng từ VLC qua
các thời điểm khác nhau (n=3)........................................................ 26
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc BH từ VLC – MTG hấp thụ BH, trong các
độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau (n = 3) .................. 28


DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Cấu trúc của cellulose vi khuẩn ......................................................... 3
Hình 1.2 Cấu trúc sợi của màng Cellulose vi khuẩn......................................... 4
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Berberine ....................................................... 7

1.1.3. Môi trường nuôi cấy................................................................................ 6
1.2. Tổng quan về thuốc Berberine hidrochloride (BH ) .................................. 6
1.2.1. Công thức cấu tạo và công thức phân tử của BH ................................... 6
1.2.2. Tính chất lí hóa của BH .......................................................................... 8
1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng ..................................................................... 8
1.2.4. Tác dụng và hạn chế của BH .................................................................. 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 11
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian.............................................. 11
2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 11
2.3.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................... 11
2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất.......................................................................... 11
2.3.3. Thiết bị................................................................................................... 11
2.3.4. Dụng cụ ................................................................................................. 12
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
2.4.1. Phương pháp lên men thu VLC từ môi trường nước vo gạo ................ 12


2.4.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc ................................. 14
2.4.3. Phương pháp xác định đường chuẩn .................................................... 15
2.4.4. Phương pháp xác định khối lượng VLC tạo thành ............................... 17
2.4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào VLC ................ 17
2.4.6. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphate buffered
saline) .............................................................................................................. 18
2.4.7. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế .................................................................................................... 19
2.4.8. Phương pháp xử lí thống kê .................................................................. 20
2.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 21
3.1. Thu VLC .................................................................................................. 21

[1]. VLC có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển
thuốc, cho cả thẩm thấu qua da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật và một số
ứng dụng y sinh học khác, đáng chú ý nhất trong sự kiểm soát các hệ thống vận
chuyển thuốc.Thuốc Berberine hydrochloride là hoạt chất có nguồn gốc thực
vật, dễ kiếm, rẻ tiền, an toàn, có tác dụng điều trị tốt các bệnh tiêu chảy, nhiễm
khuẩn đường ruột, đau mắt hột... đặc biệt, với bệnh lý viêm đại tràng.Với mục
đích nghiên cứu để đánh giá về khả năng giải phóng của thuốc Berberine
hydrochloride của VLC, chúng tôi đã chọn đề tài:“Nghiên cứu khả năng giải
phóng thuốc Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus
nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu

1


- Tạo VLC từ môi trường chuẩn. Tạo màng hấp thụ thuốc Berberine
hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo.
- Đánh giá được khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường nước vo gạo.
3. Nội dung của nghiên cứu
- Tạo VLC lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Tại VLC nạp thuốc Berberine hydrochloride
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.

tạo

ra


cao, có thể bị phân hủy sinh học, không đọc và không gây dị ứng, có khả
năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt có khả năng kháng khuẩn.[2,3,4]

Hình 1.1 Cấu trúc của cellulose vi khuẩn
1.1.1.2. Cấu trúc kết tinh của Cellulose vi khuẩn
Cấu trúc cellulose vi khuẩn được xác định nhờ kỹ thuật và công nghệ
hiện đại. Phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân,… là
các kĩ thuật xác định cấu trúc tinh thể của màng cellulose.
VLC được tạo từ 2 cấu trúc tinh thể là cellulose Ia và Iß. Trong vi sợi
của cellulose có 2 cấu trúc vi thể này. Trong cellulose thực vật có thể tách
chiết được tinh thể Iß, Còn tinh thể Ia thì không có cách bào để tách chiết
được. Ở cấu trúc VLC có đến 64% - 71% tinh thể Ia nhiều hơn Ia cấu trúc
cellulose thực vật chỉ chiếm 20%. Cấu trúc tinh thể được coi như một yếu tố
quan trọng ảnh hưởng đến xác định cấu trúc của cellulose. Tuy nhiên có rất ít

3


nghiên cứu về sự tương quan giữa tinh thể đặc tính của cellulose đang nghiên
cứu.
1.1.1.3 Tính chất của cellulose vi khuẩn
- Có cấu trúc giống Cellulose thực vật , nhưng có một số tính chất lý
hóa đặc biệt như:
+ Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.[1]
+ Khả năng giữ và hấp thụ nước tích cực.[1]
+ Có thể bị phân hủy bởi một số vi sinh vật là nguồn tài nguyên có thể
phục hồi.
+ Độ polymer hóa lớn.[1]
Quan sát VLC trên kính hiển vi điện tử quét ( SEM) loại PE – SEM
S4800 HITACHI với độ phân giải 1nm, từ đấy thấy được trong cấu trúc màng

Agrobacterium,
Alcaligenes,
Rhizobium,
Sarcina,
Gluconacetobacter xylinus mỗi loại vi khuẩn có những đặc trưng khác nhau.
Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus là vi khuẩn nổi tiếng tạo màng VLC.
1.1.2.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
G. xylinus là vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này gồm
các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter,
Gluconobacter và Kozakia. G. xylinus thường được phân lập từ các nguồn
khác nhau như từ nước quả, hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ, từ
giấm, từ thạch dừa, từ nấm Kombucha, trà,... [8].
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái của G. xylinus
G. xylinum là vi khuẩn Gram âm dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có
thể di động hay không di động, không sinh bào tử, chúng có thể đứng riêng rẽ
hay xếp thành.

5


1.1.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi nuôi cấy G. xylinus là môi trường tổng hợp từ các
nguồn dinh dưỡng giúp vi khuẩn có thể tạo màng tối ưu như nguồn cacbon,
nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Để tổng hợp tối ưu màng VLC thì nhu cầu sử dụng đường của vi khuẩn G.
xylinus là rất lớn và giữ vai trò quan trọng.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus tạo VLC được thể hiện ở bảng
1.1.
Bảng 1.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng VLC
MTG

Berberine thường được tìm thấy trong rễ, thân rễ, thân và cỏ cây. Berberine
có màu vàng.
Công thức:
Berberine:

6


+ Công thức phân tử: C20H18NO4+
+ Công thức cấu tạo:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Berberine
+ Khối lượng phân tử: 336,3612 g/mol.
+ Nhiệt độ nóng chảy: 1450C.
Berberine hydrochloride:
+ Công thức phân tử: C20H18Cl NO4
+ Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Berberine hydrochloride
+ Khối lượng phân tử: 372,8612 g/mol.
Berberine là hoạt chất được chiết từ cây hoàng đằng (còn có tên vàng
đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta)…(là loại cây dây leo thân gỗ
có phân nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi). Trong hoàng đằng có nhiều alkaloid

7


dẫn xuất của izoquinolein, chủ yếu là Berberine hydrochloride tỷ lệ từ 1,5 đến
2 – 3%.
Hiện nay, nhiều hãng dược sản xuất Berberine hydrochloride với tên

viêm đại tràng, ký sinh trùng đường ruột. Ngoài ra BH còn được điều chế
thành thuốc nhỏ mắt trị một số bệnh về mắt như: đau mắt hột, đau mắt đỏ..
Đặc biệt BH còn ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm. Gần đây có những
nghiên cứu chứng minh rằng BH có thể ngừa ung thư như: ung thư vú, ung
thư biểu mô, ung thư dạ dày... Hay nghiên cứu chứng minh BH kết hợp với
một số thuốc kháng sinh có thể giảm thiểu tác dụng phụ từ kháng sinh gây ra.
BH được sản xuất dưới dạng viên nén 10mg và 50mg.
BH thường dùng chủ yếu theo đường uống, bôi lên da và an toàn với
hầu hết nguời sử dụng. Nguyên liêu sản xuất từ rễ của cây vàng đắng khô với
8-100g sản xuất được 500g BH. BH liều cao trên 500mg có thể gây ra các
biểu hiện sau đây: đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó
thở. Huyết áp tụt, gây co giật, co thắt và dẫ đến tử vong.
Chống chỉ định: quá mẫn cảm, phụ nữ có thai. Phụ nữ mang thai và cho
con bú: không uống BH nếu bạn đang mang thai. Bởi vì có một số nghiên
cứu cho thấy rằng BH có thể đi qua nhau thai đến trẻ sơ sinh qua sãu mẹ từ đó
gây hại cho trả sơ. BH có ở thai nhi hoặc trẻ nhỏ gây vàng da nhân
(kernicterus), đây là một loại tổn thương não, đã phát triển ở trẻ sơ sinh tiếp
xúc với BH.
1.2.4. Tác dụng và hạn chế của BH
1.2.4.1. Tác dụng của thuốc BH
Các tác dụng của chủ yếu của BH là chống bệnh tiêu chảy do vi khuẩn
Ecoli gây ra hoặc do ký sinh trùng gây bệnh đường ruột. Hiện nay dược học
đã bào chế BH thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt hột và đau
mắt đỏ... Độc đáo của BH còn có thể ngăn ngừa các nhiễm nấm, chống lại các
bi khuẩn tả , đặc biệt với các bệnh lí viêm đại tràng và ngăn ngừa ung
thư.[10,11]
Nếu kháng sinh kết hợp với BH sẽ làm giảm hoặc mất tác dụng phụ của
kháng sinh.[12]

9

- Hóa chất:
+ Dùng tạo VLC: Đường glucose, acid acetic, diamoni photphat,
Amoni sulfat, pepton, acid acetic, dịch giống G. xylinus.
+ Dùng trong hấp thu thuốc: Berberin 95%, etanol.
+ Dùng trong pha dung dịch đệm giải phóng: NaCl, KCl,
Na2HPO4.12H2O4, Na2HPO4.
2.3.3. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Cân kỹ thuật (Đức)

11


- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức).
- Nước cất
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức).
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu.
- Tủ lạnh bảo quản mẫu (Y)
2.3.4. Dụng cụ
Dụng cụ cho tạo VLC: hộp nhựa, cốc đong thủy tinh, bình thủy tinh
(500ml), bình thủy tinh 1000ml, đũa thủy tinh, đèn cồn, cốc đong chia vạch
10ml, khăn mỏng, dây chun, thước kẻ…
Dụng cụ giải phóng: bình thủy tinh 1000ml, bình thủy tinh 500ml, pipet
chính xác 1ml – 5ml- 10ml thước kẹp panme, giấy lọc, lọ thủy tinh 10ml, cốc
đong 100ml và nhiều dụng cụ hóa sinh khác.

Pepton

10g

Acid acetic

2%

Dịch giống G. xylium

10%

Pha môi trường theo bảng 2.1. Đầu tiên ta pha môi trường chuẩn để
nhân dịch giống, với môi trường chuẩn thì ta chỉ cần thay nước vo gạo thành
nước cất và pha tỉ lệ hóa chất giống bảng 2.1. khi thu được lượng dịch giống
vừa đủ. Ta tiến hành tạo VLC - MTG: cho các hóa chất trên theo đúng tỉ lệ
vào bình 1000ml, sau đó lấy 1000ml nước gạo đã loại bỏ tạp chất cho vào
bình đã có hóa chất rồi tiếp tục thực hiện rung trong 30 phút cho tan hết hóa
chất. Sau đó đậy kín bình bằng giấy bạc rồi đem hấp vào máy khử trùng ở
1130C trong 15 phút. Môi trường cần để nguội và đưa vào khử trùng bằng tia
UV trong 30 phút. Sau đó thực hiện thao tác đổ môi trường, và ủ tĩnh.
Thao tác đổ môi trường: thực hiện trong phòng sạch, sát trùng tay và đồ
dùng, chuẩn bị cồn và vải mỏng để đậy khay. Hơ miệng bình trước khi thực
hiện: bổ sung ít nhất 10% dịch giống vào môi trường, sau đó đậy khăn lên
khay. Cuối cùng ủ tĩnh trong khoảng 6 – 14 ngày ở nhiệt độ phòng thu được
VLC thô. Cụ thể quy trình tạo VLC từ vi khuẩn G. xylinus trong môi trường
nước vo gạo như sơ đồ 2.1 dưới đây.

13



Tách VLC thô

Rửa bằng nước cất

Bình 1000ml NaOH 0,3M
( 20 – 30 màng d=1,5cm)

Hấp trong 1130C, 15 phút

Xả nước, 12- 24 giờ

VLC tinh khiết

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tinh chế màng VLC
- Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của VLC: Sử dụng thuốc thử
Fehling nhằm phát hiện sự có mặt của đường D – glucose, nếu có D - glucose
sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa nâu đỏ.
2.4.3. Phương pháp xác định đường chuẩn
Nguyên tắc: Chọn mẫu chuẩn ban đầu, và 6 mẫu đánh giá.
Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: cồn 96º

15


Với C1 = 100%, ta cân 0,01g BH rồi cho vào bình 100ml có chứa cồn
96% hoàn tan BH trong dung dịch thu được C1 = 100%
Với C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ của BH là 50%; 40%;
30%; 20%; 10%; 5% ta thực hiện pha loãng C1 sao cho phù hợp.
Dùng máy đo quang phổ UV-Vis để đo cường độ quang phổ của các


2

10

0,711

0,715

0,7

0,709 ± 0,0022

3

20

1,522

1,523

1,531

1,525 ± 0,0061

4

30

2,030


Giá trị trung bình

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn BH bằng phần mềm Excel
2010, kết quả được đồ thị như hình 2.3.

16