Tài liu lun vn s phm 1 of 63.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

`

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, Tháng 5 năm 2019

Footer Page 1 of 63.


Tài liu lun vn s phm 2 of 63.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE NAP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA

thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy em trong suốt bốn năm học qua,
những kiến thức thầy cô truyền đạt trên ghế nhà trường sẽ là hành trang quý
báu cho em trong suốt cuộc đời.
Trong thời gian thực nghiệm khóa luận em đã không ngừng học hỏi để
hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất tuy nhiên các nhân em vẫn còn rất
nhiều thiếu sót vì vậy em mong sẽ nhận được nhiều ý kiến đóng góp từ quý
thầy cô và các bạn để khóa luận hoàn thiện tốt hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Lê Thị Hoàng Anh

Footer Page 3 of 63.


Tài liu lun vn s phm 4 of 63.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài khóa luận này do chính tôi thực hiện tại Viện
nghiên cứu khoa học và ứng dụng - Trường đại học Sư phạm Hà Nội 2, dưới
sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên cứu là
của riêng tôi, không trùng lặp, không sao chép từ bất cứ khóa luận nào. Kết
luận được đánh giá bằng kết quả thực nghiệm đã thực hiện hoàn toàn trung
thực, không bịa đặt. Trong khóa luận có tham khảo một số tài liệu từ một số
tác giả, tôi xin phép các tác giả nhằm bổ sung cho sự chính xác và tin cậy của
khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Môi trường gạo

MTG

4

Môi trường chuẩn

MTC

5

Berberine hidrochoride

BH

6

VLC tạo ra từ môi trường nước vo gạo

VLC - MTG

6

Giờ

h

Footer Page 5 of 63.


Hình 3.2. VLC tinh chế ................................................................................... 22
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của màng ........................................ 23
Hình 3.4. VLC hấp thụ thuốc BH 10% ........................................................... 23
Hình 3.5. VLC ngâm trong dung dịch đệm .................................................... 25
Hình 3.6. Giải phóng VLC – MTG nạp BH trong máy khuấy từ gia nhiệt .... 25
Hình 3.7. Mẫu dung dịch đệm thu được sau các giờ khác nhau ..................... 26
Hình 3.8. Khả năng giải phóng thuốc Berberin của màng VLC – MTG
nạp BH trong các độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau ... 27
Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc BH ở pH = 6,8 ............................................ 29
Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 2 ...................................................... 29
Hình 3.10. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 12 .................................................. 30

Footer Page 7 of 63.


Tài liu lun vn s phm 8 of 63.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 1
3. Nội dung của nghiên cứu .............................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 3
1.1. Vật liệu Cellulose (VLC) ........................................................................... 3
1.1.1. Vật liệu cellulose ( VLC) ......................................................................... 3
1.1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose ................................................................. 5
1.1.3. Môi trường nuôi cấy................................................................................ 6

2.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 21
3.1. Thu VLC .................................................................................................. 21
3.1.1. VLC thu được khi nuôi cấy trong môi trường nước.............................. 21
3.1.2. Tinh chế VLC......................................................................................... 22
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của VLC ............................................................... 22
3.3. VLC hấp thụ thuốc BH ............................................................................ 23
3.4. Xác định lượng thuốc giải phóng từ VLC vào các môi trường pH
khác nhau......................................................................................................... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 34

Footer Page 9 of 63.


Tài liu lun vn s phm 10 of 63.

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Đã có một số nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter xylinus tạo màng
cellulose trong các môi trường khác nhau như môi trường gạo, môi trường
dừa, môi trường chuẩn và đã có kết quả khá tốt. Nếu thay vi khuẩn là
Gluconacetobacter xylinus thì liệu màng có tạo được và cách làm có thay
đổi? Khả năng giải phóng thuốc Berberine hydrochloride với các pH khác
nhau như thế nào ( pH này được mô tả theo đường ruột )? pH nào là tốt hơn
và đạt hiệu quả giải phóng hơn? Đó toàn bộ là những yêu cầu cần đặt ra khi
làm nghiên cứu về đề tài trên.
Một số loài vi khuẩn, chủ yếu là Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus)
có thể tạo nên vật liệu cellulose (VLC). VLC do G. xylinus tạo ra cấu tạo bởi
những chuỗi polymer β-1,4 glucopyranose mạch thẳng. Cấu trúc hóa học của

Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường nước vo gạo.
3. Nội dung của nghiên cứu
- Tạo VLC lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Tại VLC nạp thuốc Berberine hydrochloride
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.

tạo

ra

- Tạo VLC nạp thuốc BH.
- Nghiên cứu được khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Berberine hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường nước vo gạo ở các môi trường khác nhau: pH= 2; pH= 6,8;
pH=12.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu tìm hiểu khả năng giải phóng để có
những hiểu biết về tiềm năng giải phóng của VLC. Việc nghiên cứu ứng dụng
VLC nhằm làm cho thuốc được giải phóng kéo dài, qua đó có thể khắc phục
hạn chế của thuốc BH dạng thương mại sẽ mở ra một hướng sản xuất thuốc
hiệu quả, mang lại lợi ích cho việc điều trị.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn: Trong lĩnh vực y học, VLC đã được các nhà
khoa học nghiên cứu sử dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu
nhân tạo.
Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể cơ sở cho một số nghiên cứu khác
liên quan.

Footer Page 11 of 63.


Footer Page 12 of 63.

3


Tài liu lun vn s phm 13 of 63.

nghiên cứu về sự tương quan giữa tinh thể đặc tính của cellulose đang nghiên
cứu.
1.1.1.3 Tính chất của cellulose vi khuẩn
- Có cấu trúc giống Cellulose thực vật , nhưng có một số tính chất lý
hóa đặc biệt như:
+ Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.[1]
+ Khả năng giữ và hấp thụ nước tích cực.[1]
+ Có thể bị phân hủy bởi một số vi sinh vật là nguồn tài nguyên có thể
phục hồi.
+ Độ polymer hóa lớn.[1]
Quan sát VLC trên kính hiển vi điện tử quét ( SEM) loại PE – SEM
S4800 HITACHI với độ phân giải 1nm, từ đấy thấy được trong cấu trúc màng
cellulose vi khuẩn chứa các sợi rất nhỏ, các sợi này chúng liên kết với nhau
một cách chặt chẽ, và ở mỗi sợi có độ mảnh và đồng nhất.

Hình 1.2 Cấu trúc sợi của màng vật liệu cellulose
1.1.1.4. Đặc tính của màng VLC
Thực hiện nuôi cấy VLC nhờ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G.
xylinus) trong nuôi cấy tĩnh. VLC được tạo thành trên bề mặt dinh dưỡng lỏng
trong môi trường gạo hoặc môi trường chuẩn hoặc môi trường dừa thành các
lớp mỏng như da. Sản phẩm này có có những tính chất đặc biệt như: độ tinh
sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị


1.1.2.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
G. xylinus là vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này gồm
các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter,
Gluconobacter và Kozakia. G. xylinus thường được phân lập từ các nguồn
khác nhau như từ nước quả, hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ, từ
giấm, từ thạch dừa, từ nấm Kombucha, trà,... [8].
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái của G. xylinus
G. xylinum là vi khuẩn Gram âm dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có
thể di động hay không di động, không sinh bào tử, chúng có thể đứng riêng rẽ
hay xếp thành.

Footer Page 14 of 63.

5


Tài liu lun vn s phm 15 of 63.

1.1.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi nuôi cấy G. xylinus là môi trường tổng hợp từ các
nguồn dinh dưỡng giúp vi khuẩn có thể tạo màng tối ưu như nguồn cacbon,
nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Để tổng hợp tối ưu màng VLC thì nhu cầu sử dụng đường của vi khuẩn G.
xylinus là rất lớn và giữ vai trò quan trọng.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus tạo VLC được thể hiện ở bảng
1.1.
Bảng 1.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng VLC
MTG

Thành phần

Công thức:
Berberine:

Footer Page 15 of 63.

6


Tài liu lun vn s phm 16 of 63.

+ Công thức phân tử: C20H18NO4+
+ Công thức cấu tạo:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Berberine
+ Khối lượng phân tử: 336,3612 g/mol.
+ Nhiệt độ nóng chảy: 1450C.
Berberine hydrochloride:
+ Công thức phân tử: C20H18Cl NO4
+ Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Berberine hydrochloride
+ Khối lượng phân tử: 372,8612 g/mol.
Berberine là hoạt chất được chiết từ cây hoàng đằng (còn có tên vàng
đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta)…(là loại cây dây leo thân gỗ
có phân nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi). Trong hoàng đằng có nhiều alkaloid

Footer Page 16 of 63.

7


1.2.3. Dược lý và cơ chế tác dụng

Footer Page 17 of 63.

8


Tài liu lun vn s phm 18 of 63.

BH là dược phẩm điều trị tốt các bệnh về dường ruột như tiêu chảy,
viêm đại tràng, ký sinh trùng đường ruột. Ngoài ra BH còn được điều chế
thành thuốc nhỏ mắt trị một số bệnh về mắt như: đau mắt hột, đau mắt đỏ..
Đặc biệt BH còn ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm. Gần đây có những
nghiên cứu chứng minh rằng BH có thể ngừa ung thư như: ung thư vú, ung
thư biểu mô, ung thư dạ dày... Hay nghiên cứu chứng minh BH kết hợp với
một số thuốc kháng sinh có thể giảm thiểu tác dụng phụ từ kháng sinh gây ra.
BH được sản xuất dưới dạng viên nén 10mg và 50mg.
BH thường dùng chủ yếu theo đường uống, bôi lên da và an toàn với
hầu hết nguời sử dụng. Nguyên liêu sản xuất từ rễ của cây vàng đắng khô với
8-100g sản xuất được 500g BH. BH liều cao trên 500mg có thể gây ra các
biểu hiện sau đây: đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó
thở. Huyết áp tụt, gây co giật, co thắt và dẫ đến tử vong.
Chống chỉ định: quá mẫn cảm, phụ nữ có thai. Phụ nữ mang thai và cho
con bú: không uống BH nếu bạn đang mang thai. Bởi vì có một số nghiên
cứu cho thấy rằng BH có thể đi qua nhau thai đến trẻ sơ sinh qua sãu mẹ từ đó
gây hại cho trả sơ. BH có ở thai nhi hoặc trẻ nhỏ gây vàng da nhân
(kernicterus), đây là một loại tổn thương não, đã phát triển ở trẻ sơ sinh tiếp
xúc với BH.
1.2.4. Tác dụng và hạn chế của BH
1.2.4.1. Tác dụng của thuốc BH


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hệ thống giải phóng thuốc Berberine hydrochloride của VLC lên men
từ môi trường nước vo gạo.
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
Địa điểm: Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trường đại học sư
phạm Hà Nội 2.
Thời gian: 10/2018 – 5/2019.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn G. xylinus thuần chủng được viện nghiên cứu công
nghệ và khoa học, trường ĐHSP Hà Nội 2 mua từ nhật bản.
2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất
- Nguyên liệu: nước vo gạo, nước cất 2 lần, gạc vô trùng, giấy đánh
dấu…
- Hóa chất:
+ Dùng tạo VLC: Đường glucose, acid acetic, diamoni photphat,
Amoni sulfat, pepton, acid acetic, dịch giống G. xylinus.
+ Dùng trong hấp thu thuốc: Berberin 95%, etanol.
+ Dùng trong pha dung dịch đệm giải phóng: NaCl, KCl,
Na2HPO4.12H2O4, Na2HPO4.
2.3.3. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Cân kỹ thuật (Đức)

Footer Page 20 of 63.


12


Tài liu lun vn s phm 22 of 63.

Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy G. xylinus
Khối lượng

Thành phần
Nước vo gạo

1000ml

Glucose

30g

Diamoni photphat

0,3g

Amoni sulfat

0,5g

Pepton

10g



Nước vo gạo
(đã lọc bã, rác)

Bổ sung dinh dưỡng
(bảng 2.1)

Hấp thanh trùng
( 121°C , 20 phút)

Để nguội

Đổ giống và ( ít nhất 10%
dịch giống )

Ủ tĩnh 6 - 14 ngày ở 26°C

Thu VLC thô
Sơ đồ 2.1. Quy trình tạo VLC thô
2.4.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc
VLC sau khi có độ dày thích hợp để giải phóng như 0,3cm hoặc 0,5cm
thì có thể thu màng. VLC thô chứa một lượng lớn môi trường lên men và một
số sản phẩm từ quá trình trao đổi chất. Vì vậy nhất thiết phải xử lý VLC trước
khi hấp thụ thuốc, loại hết các tạp chất và loại bỏ và trung hòa các độc tố của
vi khuẩn.

Footer Page 23 of 63.

14



Tài liu lun vn s phm 25 of 63.

Với C1 = 100%, ta cân 0,01g BH rồi cho vào bình 100ml có chứa cồn
96% hoàn tan BH trong dung dịch thu được C1 = 100%
Với C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ của BH là 50%; 40%;
30%; 20%; 10%; 5% ta thực hiện pha loãng C1 sao cho phù hợp.
Dùng máy đo quang phổ UV-Vis để đo cường độ quang phổ của các
dung dịch đã pha ở bước sóng 345nm [16].
Tiến hành pha thuốc và đo quang phổ 3 lần rồi lấy kết quả trung bình.
Kết quả trung bình giá trị OD345nm của các nồng độ thuốc khác nhau được
thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả đo đường chuẩn của thuốc BH ở bước sóng 345nm
(n=3)
Giá trị OD 345nm (n=3)

STT

Nồng độ
(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

1

5


1,525 ± 0,0061

4

30

2,030

2,300

2,285

2,204 ± 0,1526

5

40

2,965

3,005

3,045

3,006 ± 0,0489

6

50