ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Quang Hải

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
MỘT SỐ CHẤT HỮU CƠ TRONG DƯỢC PHẨM
VÀ TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON - AMPE

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62 44 29 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS Từ Vọng Nghi
2. PGS.TS Dương Quang Phùng

HÀ NỘI - 2014


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2014
TÁC GIẢ LUẬN ÁN

TRẦN QUANG HẢI


LỜI CAM ĐOAN....................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................xii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 4
1.1. ĐẠI

CƯƠNG

VỀ

OFLOXACIN,

METRONIDAZOL,

CLOPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL ......................................... 4
1.1.1. Ofloxacin ............................................................................................ 4
1.1.2. Metronidazol ....................................................................................... 5
1.1.3. Clorpheniramin maleat ....................................................................... 7
1.1.4. Cefadroxil ........................................................................................... 9
1.2. CÁC

PHƯƠNG

METRONIDAZOL

VÀ

2.1.1. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................. 24
2.1.2. Hóa chất .............................................................................................. 25
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................... 27
2.2.1. Phân tích hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc ........................ 27
2.2.2. Phân tích hàm lượng các thuốc trong nước tiểu bệnh nhân ................ 28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 28
2.3.1. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe vòng (CV) ......... 28
2.3.2. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe xung vi phân (DP). 29
2.3.3. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xung vi phân hòa tan –
hấp phụ (DP – AdSV) ................................................................................... 30
2.3.4. Tiến hành thí nghiệm theo kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) .................... 30
2.3.5. Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc ........................... 30
2.3.6. Các bước khảo sát ............................................................................... 31
2.3.7. Xử lý mẫu ............................................................................................ 34
2.3.8. Xử lý số liệu ........................................................................................ 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 38
3.1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
OFLOXACIN ................................................................................................... 38
3.1.1. Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định ofloxacin .............................. 38
3.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp ....................... 45
3.1.3. Xây dựng qui trình định lượng ofloxacin trong mẫu thuốc. ............... 48
3.1.4. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu thuốc ..... 50
3.1.5. Nghiên cứu qui trình định lượng ofloxacin trong các mẫu nước tiểu . 51
3.1.6. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu
nước tiểu ....................................................................................................... 63
3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL .......... 65
3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp ........................................................ 65
3.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp ....................... 71
iv


Tiếng Việt

Tiếng Anh

1

ΔE

Biên độ xung

Pulse amplitude

2

SPE

Chiết pha rắn

Solid Phase Extraction

3

Ip

Cường độ dòng pic

Peak current

4



Relative Standard Deviation

Độ thu hồi

Recovery

LOQ

Giới hạn định lượng

Limit of Quantification

10

LOD

Giới hạn phá hiện

Limit of Detection

11

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

High

Performance


15

Eacc

Thế tích lũy

Accumulation potential

16

Tacc

Thời gian tích lũy

Accumulation time

17

Tcb

Thời gian cân bằng

Equilibration time

18

ν

Tốc độ quét thế


Von-ampe vòng

Cyclic Voltammetry

23

DP

Xung vi phân

Differential Pulse
vi


TT

Viết tắt,
ký hiệu

Tiếng Việt

Tiếng Anh

24

DPP

Cực phổ xung vi phân


Điện cực phù trợ

Auxiliary Electrode

29

RE

Điện cực so sánh

Reference Electrode

30

SMDE

31 GMPWHO

Điện cực giọt thủy ngân Stationary

Mercury

Drop

tĩnh

Electrode

Thực hành sản xuất tốt- Tổ


Bảng 3.16: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu vào Ip. ..... 61
Bảng 3.17: Kết quả xác định ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo .............. 62
Bảng 3.18: Kết quả xác định hàm hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước
tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 200mg. .......... 64
Bảng 3.19: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào pH dung dịch nền .. 67
Bảng 3.20: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào biên độ xung .......... 67
Bảng 3.21: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt xung ....................................... 68
viii


Bảng 3.22: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào tốc độ quét thế ....... 69
Bảng 3.23: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch metronidazol ....... 71
Bảng 3.24: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ
metronidazol ............................................................................... 71
Bảng 3.25: Độ thu hồi của metronidazol ...................................................... 73
Bảng 3.26: Độ lặp lại của metronidazol ........................................................ 74
Bảng 3.27: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Flagyl 250mg
viên nén bao film sản xuất tại Công ty TNHH Sanofi – Avantis
Việt Nam. ................................................................................... 76
Bảng 3.28: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Metronidazole 250mg
viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây. ............. 76
Bảng 3.29: Sự phụ thuộc Ip và Ep của clorpheniramin maleat vào biên
độ xung ...................................................................................... 80
Bảng 3.30: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt xung ....................................... 81
Bảng 3.31: Sự phụ thuộc Ip và Ep của clorpheniramin maleat vào tốc độ
quét thế ...................................................................................... 82
Bảng 3.32: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian sục khí nitơ .................................. 83
Bảng 3.33: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch clorpheniramin maleat . 84
Bảng 3.34: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ
clorpheniramin maleat ................................................................ 85

Bảng 3.54: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang Ocefacel
(cefadroxil 500 mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm
Hà Tây ...................................................................................... 116
Bảng 3.55: Kết quả định lượng cefadroxil trong thuốc bột Tytdroxil
(cefadroxil 250mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm
Glomed ..................................................................................... 117
Bảng 3.56: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi ......................................... 119
Bảng 3.57: Sự phụ thuộc Ip vào thể tích dung môi ...................................... 120
Bảng 3.58: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi .................. 121
x


Bảng 3.59: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu ..................... 122
Bảng 3.60: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi .................. 123
Bảng 3.61: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu vào Ip. .. 124
Bảng 3.62: Kết quả xác định cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo ........... 126
Bảng 3.63: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu
của bệnh nhân uống 1 gói thuốc Tytdroxil hàm lượng 250mg...... 127
Bảng 3.64: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước
tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 500mg. ........ 128

xi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của ofloxacin ..................................................... 4
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của metronidazol ............................................... 5
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của clorpheniramin maleat ................................ 7
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cefadroxil .................................................... 9
Hình 1.5: Các bước trong kỹ thuật chiết pha rắn........................................... 22

Hình 3.23: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân
uống 2 viên ofloxacin 200mg theo thời gian ............................... 65
Hình 3.24: Đường CV của metronidazol trong nền đệm photphat ................ 66
Hình 3.25: Đường DP của metronidazol trong nền đệm photphat:................ 66
Hình 3.26: Đường DP của metronidazol trong nền đệm photphat ở các pH
từ 3,5 đến 6,0 .............................................................................. 66
Hình 3.27: Đồ thị Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào pH dung
dịch nền ...................................................................................... 66
Hình 3.28: Sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung ............................................... 67
Hình 3.29: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung ................................. 67
Hình 3.30: Đường DP của metronidazol phụ thuộc vào thời gian 1 xung ..... 68
Hình 3.31: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt 1 xung .......................... 68
Hình 3.32: Đường DP của metronidazol phụ thuộc tốc độ quét thế .............. 69
Hình 3.33: Sự phụ thuộc Ip vào tốc độ quét thế ............................................. 69
Hình 3.34: Đường DP của metronidazol phụ thuộc vào thời gian sục khí
nitơ ............................................................................................. 70
Hình 3.35: Ảnh hưởng của thời gian sục khi nitơ đến cường độ dòng pic ..... 70
Hình 3.36: Sự phụ thuộc giữa Ip vào nồng độ metronidazol .......................... 72
Hình 3.37: Đường DP của metronidazol ở các nồng độ ................................ 72
Hình 3.38: Đường DP của các mẫu nước tiểu trước và sau khi uống thuốc .. 78
Hình 3.39: Đường CV của clorpheniramin maleat 0,05mg/ml trong nền
đệm photphat pH = 4,60 ............................................................. 79
Hình 3.40: Đường DP của clorpheniramin maleat nền đệm photphat ở các
pH khác nhau.............................................................................. 79
Hình 3.41: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào pH của dung dịch nền ....................... 80
xiii


Hình 3.42: Sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung ............................................... 81
Hình 3.43: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung ..................................... 81

Hình 3.64: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính Ip vào nồng độ cefadroxil ......... 100
Hình 3.65: Đường DP của cefadroxil ở các nồng độ ................................... 100
Hình 3.66: Phổ CV của thuốc cefadroxil ở các thời gian làm giàu: 0s; 30s;
60s; 90s; 150s; 180s.................................................................. 106
Hình 3.67: Phổ DP của thuốc cefadroxil ở các thời gian làm giàu: 0s; 30s;
60s; 90s; 180s. .......................................................................... 106
Hình 3.68: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào thế tích lũy
(Eacc ) ........................................................................................ 107
Hình 3.69: Sự phụ thuộc Ip vào Eacc ............................................................ 107
Hình 3.70: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào thời gian tích
lũy (tacc) .................................................................................... 108
Hình 3.71: Ảnh hưởng của thời gian tích lũy đến cường độ dòng pic ......... 108
Hình 3.72: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào tốc độ quét thế 109
Hình 3.73: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng pic ............. 109
Hình 3.74: Sự phụ thuộc Ip vào nhiệt độ ..................................................... 110
Hình 3.75: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường độ dòng vào nồng
độ cefadroxil. ............................................................................ 112
Hình 3.76: Đường CSV của cefadroxil ở các nồng độ khác nhau ............... 112
Hình 3.77: Sự phụ thuộc Ip thể tích dung môi ............................................. 120
Hình 3.78: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi ................... 121
Hình 3.79: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu ...................... 122
Hình 3.80: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi .................. 123
Hình 3.81: Sự phụ thuộc Ip và nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu. ..... 125
Hình 3.82: Đường AdSV của cefadroxil trong nước tiểu (mẫu tự tạo) ........ 125
Hình 3.83: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân
uống 2 viên cefadroxil 250mg theo thời gian ............................ 127
Hình 3.84: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân
uống 2 viên cefadroxil 500mg theo thời gian ............................ 128

xv


Dược điển Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC là phương pháp thường qui
để định lượng hoạt chất trong thuốc [1], ngoài ra có sử dụng các phương pháp
trắc quang, các phương pháp chuẩn độ…. Phương pháp HPLC có ưu điểm có
độ nhạy, độ chọn lọc cao, khả năng tách tốt, nhưng khó áp dụng rộng rãi do
thiết bị, hóa chất đắt tiền và không phân tích nhanh được. Phương pháp trắc
quang tương đối phổ biến nhưng phải qua nhiều giai đoạn chiết tách mất thời
gian, tốn hóa chất làm mất chất phân tích và độ phân giải không cao. Vì vậy,
việc nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng, độ chọn
lọc, đơn giản, giá thành thấp, tốc độ hoàn thành nhanh có thể áp dụng rộng rãi
song hành với các phương pháp phân tích trong dược điển và đánh giá tương
đương sinh học thuốc là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn.
Nhóm các phương pháp điện hóa bao gồm cực phổ và von-ampe có thể
đáp ứng các yêu cầu đặt ra. Trên thế giới đã có một số công trình dùng
phương pháp von-ampe để định lượng các chế phẩm thuốc, dịch sinh học và
một số lĩnh vực khác. Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy có rất nhiều
dược phẩm có hoạt tính điện hóa. Máy phân tích điện hóa đa năng được ưa
chuộng ở Việt Nam vì ít tiền hơn các máy phân tích quang phổ và sắc ký, chi
phí phân tích cũng rẻ hơn. Hiện nay, tại Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam,
phòng thí nghiệm của nhóm GS.TS. Lê Quốc Hùng và các cộng sự đã chế tạo
được máy phân tích điện hóa đa chức năng có độ chính xác không kém máy
nhập ngoại mà giá thành rẻ hơn rất nhiều.
Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp von-ampe còn ít được nghiên cứu
ứng dụng trong phân tích các hợp chất hữu cơ đặc biệt là trong lĩnh vực phân
tích dược phẩm. Thực hiện đề tài "Nghiên cứu xác định hàm lượng một số
chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp von-ampe."
nhằm đánh giá khả năng áp dụng phương pháp von-ampe để phân tích hoạt chất
có tác dụng chữa bệnh trong các chế phẩm thuốc và dịch sinh học ở Việt Nam.
2


3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

ĐẠI

CƯƠNG

VỀ

OFLOXACIN,

METRONIDAZOL,

CLOPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL

1.1.1. Ofloxacin
Ofloxacin là (RS)-7-fluoro-2-methyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-10oxo-4-oxa-1-azatricyclo[7.3.1.05,13]trideca-5(13),6,8,11-tetraene-11carboxylic acid. Là kháng sinh nhóm quinonol thế hệ thứ hai. [1, 2, 5, 53]

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của ofloxacin
Ofloxacin có dạng tinh thể hình kim không màu, ít tan trong nước và
etanol [1, 5]. Trong công thức cấu tạo ofloxacin có khung quinolon, nhân
quinon, có tính axit yếu với pKa1 = 5,8; pKa2 = 7,8 [31]. Hoạt tính điện hóa có
thể gây ra bởi nhóm COOH hoặc các nguyên tử N. Theo Gerong Zhou, trong
môi trường axit yếu có thể xảy ra phản ứng điện hóa [95]:
H
O



4


+ Viêm phế quản nặng do vi khuẩn, viêm phổi,
+ Nhiễm khuẩn Chlamydia tại cổ tử cung hoặc niệu đạo có hoặc không
kèm lậu, lậu không biến chứng, viêm tuyến tiền liệt, viêm đường tiết niệu.
+ Nhiễm khuẩn da và mô mềm.
+ Viêm đại tràng do nhiễm khuẩn.
Ofloxacin được hấp thu nhanh và tốt qua đường tiêu hóa. Khả dụng
sinh học qua đường uống khoảng 100% và có nồng độ đỉnh huyết tương
khoảng 3 - 4 µg/ml, trong 1 - 2 giờ sau khi uống 400 mg. Hấp thu bị chậm lại
khi có thức ăn nhưng tỷ lệ hấp thu không bị ảnh hưởng. Nửa đời trong huyết
tương là 5 - 8 giờ; trong trường hợp suy thận, có khi kéo dài 15 - 60 giờ tùy
theo mức độ suy thận [2, 3].
Thận là nơi thải ofloxacin chính, thuốc được lọc qua cầu thận và bài tiết
qua ống thận. 75 - 80% thuốc được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng không
chuyển hóa trong 24 đến 48 giờ, làm nồng độ thuốc cao trong nước tiểu. Dưới
5% thuốc được bài tiết dưới dạng chuyển hóa trong nước tiểu; 4 đến 8% thuốc
bài tiết qua phân.
1.1.2. Metronidazol
Metronidazol có tên theo IUPAC là 2-(2-methyl-5-nitroimidazol-1yl)ethanol [1, 5], công thức cấu tạo được biểu diễn trên hình 1.2:
CH2 - CH2 - OH
O2N

CH3

N
N


N

+ 2 H2O

Metrodinazol là thuốc kháng virus chống lại vi khuẩn kị khí và kí sinh
trùng theo cách ức chế chọn lọc một số chức nǎng tế bào ở vi khuẩn làm cho
chúng bị chết.
Metronidazol có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên sinh như
amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí. Cơ chế tác dụng của metronidazol còn
chưa thật rõ. Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/ml
hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh và các vi khuẩn nhạy
cảm. Nồng độ tối thiểu ức chế các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/ml.
Metronidazol thường hấp thu nhanh và hoàn toàn sau khi uống, đạt
nồng độ trong huyết tương khoảng 10 µg/ml khoảng 1 giờ sau khi uống 500
mg. Nửa đời của metronidazol trong huyết tương khoảng 8 giờ. Metronidazol
chuyển hóa ở gan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và axit, thải trừ
qua nước tiểu một phần dưới dạng glucuronid.
Nửa đời thải trừ trung bình trong huyết tương khoảng 7 giờ. Nửa đời
của chất chuyển hóa hydroxy là 9,5 - 19,2 giờ ở người bệnh có chức năng
thận bình thường. Trên 80% liều uống được thải trừ qua thận trong 24 giờ,
chủ yếu là các chất chuyển hóa. Dưới 10% thải trừ dưới dạng chất mẹ.
6


Khoảng 14% liều dùng thải trừ qua phân. Ở người bệnh bị suy thận, nửa đời
của chất mẹ không thay đổi, nhưng nửa đời của chất chuyển hóa hydroxy kéo
dài gấp 4 đến 17 lần. Chuyển hóa metronidazol có thể bị ảnh hưởng nhiều khi
bị suy gan nặng. Metronidazol có thể loại khỏi cơ thể có hiệu quả bằng thẩm
tách máu [3].
1.1.3. Clorpheniramin maleat

CHCOOH

Clorpheniramin

maleat

CH2COOH

là

thuốc

kháng

histamin

thế

hệ

1.

Clorpheniramin maleat được sử dụng với liều 2 hoặc 4 mg trong chế phẩm
đơn thành phần hoặc phối hợp với các thành phần khác như paracetamol,
7


pseudoephedrin, phenylephrin, phenylpropalamin, dextromethorphan trong
chế phẩm đa thành phần.
Clorpheniramin là một kháng histamin có rất ít tác dụng an thần. Như

1.1.4. Cefadroxil
Cefadroxil

là

(6R,7R)-7-{[(2R)-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino}-3-

methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid monohydrat.
Cefadroxil là cephalosporin nhóm ba thế hệ thứ nhất, là kháng sinh dùng theo
đường uống có phổ kháng khuẩn tương tự cefalexin [1, 3, 5, 53].
O
HO

H
H H
N
S

NH2
O

N

CH3
COOH

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cefadroxil
Cefadroxil có cả tính chất axit gây ra bởi nhóm cacboxyl (pKa1 = 4,5)
và nhóm phenol (pKa2 = 10) và tính bazơ gây ra bởi nhóm amin, tùy pH của
môi trường có thể tồn tại ở dạng phân tử hoặc ion [65].