ĐẠI HỌ
C BÁCH KHOA TP H
KHOA K

TI
Ể
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG C
ĐỀ TÀI:
Các phương pháp phân tích polyphenols
trong nướ
c ép trái cây, trong bia và r

GVHD:
H
ọ
Lê Hà
Thành ph

C BÁCH KHOA TP H
Ồ CHÍ MINH

KHOA K
Ỹ THUẬT HÓA HỌC Ể
U LUẬN MÔN HỌC
ƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG C
ương pháp phân tích polyphenols
c ép trái cây, trong bia và rư
GVHD:

3. Chiết tách phenolics từ quả nho 8
3.1. Phương pháp chiết lỏng-rắn 8
3.2. Tinh chế dịch chiết 10
4 . Phân tích thành phần rượu vang và chiết xuất 11
4.1. Xác định tổng lượng hợp chất phenolics 11
4.2. Chiết tách và phân tích các hợp chất phenolics (kỹ thuật sắc ký) 17
4.2.3. Phân tích, xác định các hợp chất phenolic 20
5. Kỹ thuật tách mới 26
6. Kỹ thuật để Thiết lập cấu trúc Tannin (Xác định mức độ trùng hợp) 28
7. Kết luận 30 Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 3

1. Tổng quan
Các hợp chất phenolic là những chất chuyển hóa trung gian phổ biến nhất trong
giới thực vật. Các hợp chất này có cấu trúc chung bao gồm một vòng benzen thơm với
một hoặc nhiều nhóm thế hydroxyl. Cấu trúc này đại diện cho một nhóm lớn và đa dạng
của các phân tử khác nhau được chia làm hai họ chính: flavonoids dựa trên cấu trúc C6-
C3-C6 trên bộ khung carbon và nhóm non-flavonoids. Trong cơ thể thực vật, phenolics
đóng một vai trò trong sự phát triển, sinh sản và trong các phản ứng phòng vệ khác nhau
của thực vật nhằm bảo vệ chống lại các tác động bên ngoài như tia UV hoặc đe dọa sinh
học như động vật ăn thịt và các tác nhân gây bệnh tấn công. Chúng cũng cấu thành các
thành phần cơ bản của các hợp chất sắc tố, tinh chất và hương vị trong thực vật.
Đa số các hợp chất phenolic (như resveratrol , quercetin , rutin , catechin ,
proanthocyanidins) đã được công bố có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm cả khả năng
bảo vệ tim mạch , chống viêm , chống ung thư , kháng virus và kháng khuẩn do các hợp
chất này chủ yếu đóng vai trò là chất chống oxy hóa và ức chế sự hoạt hóa của gốc tự do.

nhau đã được cải thiện qua thời gian. Nhìn chung, các phương pháp cho phép xác định
một chỉ số tổng (ví dụ , "tổng số polyphenol") chủ yếu được thực hiện bằng cách phân
tích quang phổ, sau đó tiếp tục thực hiện các phép phân tích chi tiết hơn dựa trên phương
pháp phân tách từng hợp chất polyphenolic khác nhau được thực hiện bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao hoặc điện di mao quản và các cấu trúc này được xác định bởi máy dò khác
nhau, UV -vis và phổ khối lượng.
2. Cấu trúc của các polyphenol chính trong quả nho và rượu vang
Thành phần các hợp chất phenolics trong rượu vang phụ thuộc vào nguồn gốc loại
nho được sử dụng và quy trình sản xuất rượu. Cấu trúc của các hợp chất phenolics bao
gồm các vòng thơm đơn giản với trọng lượng phân tử thấp đến các tannin trọng lượng
phân tử cao với cấu trúc phức tạp. Hai nhóm các hợp chất phenolic được chia làm hai họ
chính: flavonoids dựa trên cấu trúc C6-C3-C6 trên bộ khung carbon và nhóm non-
flavonoids.
Trong số các chất non-flavonoids, hợp chất chính là axit phenolic (axit
hydroxybenzoic), axit hydroxycinnamic và stilbens. Axit hydroxybenzoic có cấu trúc C6-
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 5

C1, bao gồm một vòng benzen với một nhóm thế -COOH trên vòng. Các dẫn chất acid
khác được phân biệt bởi các nhóm thế R1-R4 lần lượt trên vòng benzen tương ứng của
chúng. Vanillic, syringic và gallic acids là các hợp chất chính từ cấu trúc cơ bản này (cấu
trúc của chúng được minh họa trong hình 1). Một số axit hydroxycinnamic (C6-C3) có
mặt trong nho và rượu vang . Chúng được xác định tồn tại ở dạng tự do với lượng nhỏ,
chủ yếu là tồn tại ở dạng ester hóa, đặc biệt là với axit tartaric. Các hợp chất này cũng có
thể tồn tại ở dạng ester glycosides đơn giản của glucose. Một họ polyphenol cấu trúc
phức tạp hơn cũng có mặt trong nho, gỗ sồi và rượu đó là Stilbenes, các phân tử này có
hai vòng benzen, được liên kết bởi phân tử ethane, hoặc có thể là chuỗi ethylene. Trong
số các hợp chất đồng phân dạng trans, resveratrol, hoặc 3,5,4 - trihydroxystilben (
Hình 1

trong dung dịch có tính axit (
Hình 2
). Cấu trúc của các proanthocyanin khác nhau về bản
chất của các tiểu phân cấu tạo của chúng, và mức độ trùng hợp ( mDP ) trung bình và vị
trí liên kết.

Hình 2 - Cấu trúc của proanthocyanidins: flavan-3-ol được liên kết tại vị trí C4-C8 / C4-C6
Các hợp chất này phân bố trong tất cả các phần của quả nho nhưng phần vỏ có
chứa một lượng proanthocyanidins thấp hơn trong hạt và đặc điểm cấu trúc của chúng
cũng khác nhau. Proanthocyanidins trong hạt nho chỉ bao gồm procyanidin (tiểu phân
được cấu thành từ (+)-catechin (C) và (-)-epicatechin (EC)), trong khi proanthocyanidins
ở phần vỏ nho bao gồm cả prodelphinidins và procyanidinsand [tiểu phân cấu thành từ (-
)-epigallocatechin (EGC)]. Proanthocyanidins ở phần vỏ quả nho có mDP cao hơn và có
tỷ lệ của tiểu phân galloylated thấp hơn ở trong hạt. Tannin là các hợp chất có nguồn gốc
từ quả nho đóng vai trò quan trọng đối với chất lượng rượu vang đỏ do đặc tính làm se,
tạo vị cay, đắng và vai trò của chúng trong sự ổn định màu sắc lâu dài của sản phẩm.
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 8

3. Chiết tách phenolics từ quả nho
Để phân tích cấu trúc đặc trưng của các hợp chất phenolics, các thành phần
anthocyanins hoặc tannin trước tiên cần được chiết tách từ mẫu nho. Trong trường hợp
sản phẩm rượu vang, một số tác giả đề nghị rằng mẫu rượu không cần qua bất kỳ xử lý
đặc biệt nào trước mà có thể được bơm trực tiếp vào thiết bị phân tích trong khi những
tác giả khác cho rằng việc chiết tách, định lượng và định danh sẽ cho kết quả tốt hơn nếu
thực hiện một số bước tinh chế mẫu trước khi phân tích (điểm này sẽ được trình bày kỹ
hơn trong phần phương pháp phân tích).
3.1. Phương pháp chiết lỏng-rắn
Hạt nho và phần vỏ được tách riêng trước khi được chiết bằng các dung môi như

hướng phân hủy khi thời gian chiết kéo dài (hơn 210 phút). Bên cạnh đó, Pineiro và đồng
nghiệp cho thấy thí nghiệm chiết tách hạt nho bằng PLE sử dụng methanol như dung môi
cho kết quả về độ thu hồi của catechin và epicatechin đặc biệt cao hơn so với những
trường hợp thu được bằng phương pháp khuấy từ hoặc chiết tách dưới sự hỗ trợ của sóng
siêu.
Một phương pháp chiết khác là kỹ thuật hỗ trợ điện áp trong quá trình chiết tách.
Boussetta và đồng nghiệp nhận thấy rằng quá trình chiết tách vỏ trái nho Chardonnay với
sự hỗ trợ bằng xung điện trường (PEF) và điện áp cao (HVED) giúp tăng tốc quá trình
chiết tách các chất tan và polyphenol trong nước ở 20 °C về mặt độc học. Kỹ thuật
HVED được giải thích do có khả năng tạo ra các sóng xung kích giúp hỗ trợ sự phá vỡ
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 10

mô và vách các tế bào trong trái nho, phóng thích polyphenols làm tăng tốc quá trình
khuếch tán polyphenols. Tuy nhiện, một số thông số quan trọng phải được tối ưu hóa vì
phương pháp chiết tách hỗ trợ điện áp tiến hành quá lâu có thể ảnh hưởng làm phân hủy
polyphenols dẫn đến giảm nồng độ của chúng trong dịch chiết. Hơn nữa, các nghiên cứu
này được thực hiện chủ yếu trên catechin hoặc tổng lượng phenols chứ chưa áp dụng cho
việc chiết tách các hợp chất dễ bị oxy hóa như anthocyanins.
Cuối cùng, phương pháp chiết tách có hỗ trợ vi sóng giúp thúc đẩy quá trình
truyền năng lượng trong toàn bộ môi trường chiết (dung môi và chất nền) một cách hiệu
quả và đồng đều. Ứng dụng các điều kiện tối ưu để chiết hạt nho Cabernet-Sauvignon,
Shiraz, Sauvignon blanc và Chardonnay công bố rằng khoảng 92 % trong tổng số
polyphenol được chiết tách, kết quả thu được tốt hơn so với các phương pháp chiết khác
(siêu âm, ).
3.2. Tinh chế dịch chiết
Sản phẩm thu được từ các phương pháp chiết tách rắn - lỏng trình bày ở trên là
một hỗn hợp thô mà độ tinh khiết vẫn có thể được nâng cao bằng các phương pháp tinh
chế. Vì vậy, các phương pháp chiết lỏng/ lỏng ở các phân đoạn khác nhau có thể sử dụng

các phân tử không thuộc nhóm phenolics có thể có một vòng benzen (amino acid) do đó
có độ hấp thụ ở 280 nm sẽ gây sai biệt trong kết quả phân tích tổng hàm lượng.
Một phương pháp khác cho một phép xác định hàm lượng phenol tổng là thí
nghiệm Folin-Ciocalteu đặc hiệu cho các nhóm phenol do tính chất khử của chúng. Trên
thực tế, phương pháp này là phản ứng khử các axit phosphomolybdic của các hợp chất
phenolic trong môi trường kiềm tạo thành một phức chất màu xanh. Tuy nhiên, phương
pháp này vẫn không đặc trưng vì một số nhóm phenolic chiết từ protein hoặc các chất có
tính khử như acid ascorbic cũng có thể tham gia vào các phản ứng khử nêu trên. Các
phương pháp riêng biệt hơn như định lượng vanillin, DMACH, Bate-Smith đã được đề
xuất để xác định hàm lượng của proanthocyanidic tannin.
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 12

Định lượng Vanillin và DMACH dựa trên sự hình thành của các sản phẩm màu từ
phản ứng giữa tannin và các chất phản ứng họ aldehyde trong khi phương pháp Bate-
Smith dựa trên sự depolymerization của proanthocyanidin qua sự phân hủy của các liên
kết flavonol nội phân tử trong môi trường có tính axit khi được gia nhiệt. Sự phân hủy
này dẫn đến sự hình thành các carbon cation một phần được chuyển đổi thành cyanidins
đỏ (với sự hấp thụ đặc trưng tại 550 nm) nếu môi trường thuận lợi cho quá trình oxy hóa.
Các phương pháp khác dựa trên phản ứng tạo kết tủa chọn lọc với tanin bằng
protein (ví dụ albumin huyết thanh bò) hoặc các thuốc thử khác như polymer
(Polyetylenglycol, polyvinylpyrrolidone, ). Methyl cellulose, một dạng polysacharride,
cũng được sử dụng để thực hiện phản ứng kết tủa cho việc định lượng tannin trong rượu
vang đỏ hoặc dịch chiết từ nho, gọi tắt là phương pháp định lượng tannin bằng MCP.
Phương pháp này được dựa trên tương tác polymer-tanin, tạo thành phức chất không tan.
Nhìn chung, tất cả các phương pháp trên đều phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm
pH, điểm đẳng điện, lực ion, cấu tạo protein và nhiệt độ. Nhìn chung, những phương
pháp này thiếu tính đặc trưng và lặp lại. Cuối cùng, liên quan đến định lượng
anthocyanins, các phương pháp hóa học dựa trên các thuộc tính đặc trưng của

Các tác giả chỉ ra rằng điện cực carbon thủy tinh là tốt nhất cho thí nghiệm này vì
nó giảm thiểu sự ảnh hưởng của ethanol do có khả năng ôxi hóa tại các điện cực kim loại
trơ như bạch kim và vàng. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các tín hiệu điện tại các điện
thế tương ứng có tương quan với sự hiện diện của các chất polyphenolics có hoạt tính
chống oxy hóa cao, trong khi những hợp chất với tính chống oxy hóa thấp cho thấy tính
hiệu điện ở điện thế dương cao hơn.
Kết quả cho thấy rằng, các chất dễ bị oxy hóa như ortho-diphenols có một tính
hiệu ở điện thế thấp khoảng 400 mV, các anthocyanin trong rượu vang đỏ có tín hiệu cao
hơn ở 650 mV, và các hợp chất có nhóm chức khó bị oxy hóa có tín hiện ở điện thế cao
hơn cả, tính chất này giúp phân biệt các hợp chất này. Trong nghiên cứu của mình,
Inanother, De Beer và đồng nghiệp đã cố gắng so sánh kết quả xác định các chất phenolic
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 14

thu được bằng các phương pháp khác nhau. Họ cập đến việc sử dụng CV để đo tổng số
phenol sử dụng Q500 (500 mV) có những nhược điểm bởi kết quả chỉ phản ánh hàm
lượng tổng chất phenolics có chứa pyrogallol, gallate, và các nhóm catechol trong
monome, oligomer hoặc các polymer như flavanol, proanthocyanidins, flavonol và axit
phenolic. Thật vậy, phần lớn anthocyanins là hợp chất phenol trong rượu vang trắng chỉ
cho tín hiệu anốt tại điện thế cao hơn 500 mV không bao gồm trong kết quả phân tích
này.
Tuy nhiên, việc xác định lượng các chất phenol tại điện thế cao hơn là khá phức
tạp do sản phẩm của quá trình oxy hóa polyphenol tích tụ trên bề mặt điện cực anode tại
các điện thế cao. Tuy nhiên, mặc dù có những nhược điểm nhưng phương pháp CV có
thể cung cấp thông tin định tính và bán định lượng về hàm lượng polyphenol và có mối
tương quan so với các phương pháp khác (Folin Ciocalteu, RP-HPLC).
Gần đây, Sanchez Arribas và đồng nghiệp trình bày phương án cải tiến phương
pháp CV bằng sự thay đổi điện cực cacbon thủy tinh với một ống nano carbon đa vách và
nối với một thiết bị phân tích tiêm mẫu. Họ cho thấy ưu điểm của điện cực cải tiến này là

hóa học chính tham gia vào quá trình lên men rượu vang cũng như các hợp chất phenolic
(phenolic tổng, tổng tannin và anthocyanin tổng số) độc lập về những thay đổi liên tục
của ma trận trong quá trình sản xuất rượu vang và cung cấp thông tin quan trọng về chất
lượng của sản phẩm cuối cùng.
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 16

Phổ NIR còn được sử dụng để xác định các hợp chất phenolic trong vỏ, hạt hoặc
quả còn nguyên vẹn. Ferrer-Gallego và đồng nghiệp đã xác định nồng độ của các họ
phenolics chính (flavanol, anthocyanins, flavonol và axit phenolic) và tổng hàm lượng
hợp chất phenolic trong vỏ nho và quả nho đỏ trong quá trình chín.
Các tác giả đã phát triển các mô hình cho phép xác định nồng độ chính xác và
nhận định rằng kết quả tốt nhất thường thu được trực tiếp ghi quang phổ của nho còn
nguyên vẹn do sự vắng mặt thực tế của mẫu ofthe thao tác đó là cần thiết. Các tác giả
cũng có công bố một nghiên cứu về khả năng sử dụng NIR để đánh giá thành phần
flavanol monomeric và oligomeric trong hạt.
Rolle và đồng nghiệp đã phát triển một phương pháp để đánh giá tổng hàm lượng
phenol có trong hạt nho sử dụng quang phổ Fourier Transform-Near Infrared (FT-NIR).
Họ thu được kết quả đầy hứa hẹn nhưng nhấn mạnh sự cần thiết phải cải thiện mô hình
này. Cuối cùng, quang phổ hồng ngoại đã được sử dụng trực tiếp trong quả nho để xác
định tổng hàm lượng anthocyanin cũng như các anthocyanins có thể chiết xuất được (pH
1 và 3.2) và tổng hàm lượng phenol. Họ báo cáo các kết quả khác nhau đối với các giống
nho khác nhau; anthocyanin chiết ở pH 1.0 và pH 3.2 có thể được dự đoán từ quang phổ
cận hồng ngoại của toàn bộ quả nho trong trường hợp của nho Syrah, trong khi họ không
thể được dự đoán giống như đối với các giống nho khác như Cabernet-Sauvignon, Merlot
và Carmenere.
Mặt khác, Cozzolino và đồng nghiệp cũng cho thấy giá trị thấp không phù hợp của
R trong kết quả ước tính tổng anthocyanins trong quả nho còn nguyên vẹn. Nhìn chung,
sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật hồng ngoại có thể trở thành một công cụ chính xác và

các hạt hình cầu của silica liên kết nhờ chuỗi octadecyl (C18). Tuy nhiên, những phân
tích sắc ký này thường mất quá nhiều thời gian và đôi khi phải được bắt đầu bằng một
bước dọn rửa dũng cụ trước khi phân tích tốn thời gian. Trong quan điểm này, phương
pháp sử dụng cột đơn khối cho việc nhồi cột đã được đề xuất trong phân tích phenolic.
Các tính năng đặc trưng của vật liệu không hạt là một nhân vật liên tục của bộ
xương, đáp ứng đầy đủ các phòng tách biệt. Do cấu trúc cứng và xốp của các vật liệu này,
chúng cho phép các dòng dung môi chảy qua cột nhanh hơn, thời gian thí nghiệm ngắn
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 18

hơn và cột nhanh chóng tái cân bằng giữa chạy. Một số nghiên cứu chứng minh những ưu
điểm của loại cột này. Ví dụ, Castellari et al. báo cáo rằng cột nguyên khối có thể hoạt
động ở một vận tốc dòng chảy cao hơn so với dòng chảy trong cột RP thông thường với
sự sụt giảm áp lực giảm và thời gian rửa ngắn hơn và cũng như tái cân bằng nhanh hơn.
Một kết quả chiết tách nhanh (36 phút) của các hợp chất phenol monomeric và cải
thiện tín hiệu / nhiễu đã đạt được nhờ sử dụng loại cột này. Liazid và đồng nghiệp phát
triển một phương pháp nhanh chóng hơn (8 phút) cho phép tách và định lượng 13 họ
polypheno trong rượu vang bằng cách sử dụng một cột nguyên khối RP-18E. Các tác giả
cho thấy rằng phương pháp của họ cung cấp kết quả đáng tin cậy, độ phân giải cao và có
tính lặp và có thể được áp dụng cho mẫu thực có chứa các họ khác nhau của hợp chất
phenolics.
Phương pháp LC pha đảo có thể cung cấp thông tin cụ thể về các nhóm chất khác
nhau của các chất phenolics trong rượu vang đỏ nhưng giới hạn khả năng của phương
pháp này đối với phân tích các hợp chất có khối lượng phân tử cao. Kennedy và
Waterhouse đã đề nghị sử dụng phương pháp sắc ký pha thuận (NP-LC) cho phép phân
tích các proanthocyanidins cao phân tử khi có sự hiện diện của anthocyanin. Họ đã phát
triển một phương pháp mới sử dụng cột silica pha thuận và rửa giải cột với pha động
methylen clorua, metanol, axit fomic và axit heptanesulfonic, mà không cần làm tinh
khiết thêm. Dựa trên thứ tự rửa giải của proanthocyanidins và anthocyanins, phenol rửa

để hoạt động trên các công cụ tiêu chuẩn HPLC trong hầu hết các trường hợp. Trong
những thiết kế này, một số phương pháp thông qua cột lõi vỏ được đánh giá để đạt được
phân tích tốt nhất của các thành phần phenolic không điển hình như anthocyanins
diglucoside được tìm thấy trong các giống nho lai. Kết quả cho thấy cột lõi vỏ C18 và
PFP (pentafluorophenyl) cải thiện độ chọn lọc đáng kể. Như vậy, anthocyanin /
anthocyanidin, các hợp chất đơn phân tử không thuộc họ anthocyanins hoặc tannin sau
khi phloroglucinolysis hóa, các thiết bị phân tích dạng cột lõi vỏ cung cấp một kết quả
nhanh chóng, tiêu thụ dung môi ít hơn, ngưỡng nồng độ phát hiện thấp và độ lập lại kết
quả phân tích
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 20

4.2.3. Phân tích, xác định các hợp chất phenolic
Các phương pháp phát hiện khác nhau đã được áp dụng song song kết hợp cùng
với HPLC cho hợp chất phenolic. Phenolics trong rượu thường được phát hiện bằng phổ
UV-vis (tia cực tím có thể nhìn thấy), mảng photodiode (DAD), huỳnh quang và phân
tích khối lượng nhưng phương pháp UV vẫn còn thông dụng nhất vì các hợp chất
phenolic có phổ hấp thu đặc trưng trong vùng UV. Thật vậy, anthocyanins thấy hai dải
hấp thụ maximain tại 265-275 nm và vùng 465-560 nm trong khi flavanol cho hai dải hấp
thụ tại 210 nm và 278 nm. Các tính chất này được sử dụng, việc phát hiện và định lượng
các hợp chất này hiện tại được tiến hành giữa 520 nm và 546 nm cho anthocyanins và ở
280 nm cho flavanol. Tuy nhiên, phát hiện tia cực tím là không đặc trưng cho
proanthocyanidin khi có sự hiện diện của polyphenol khác.
Phương pháp thay thế bao gồm phát hiện huỳnh quang đã được đề xuất. Bằng cách
kết hợp thiết bị dò phổ hấp thu và phổ huỳnh quang, Porgaly và Büyüktuncel đồng thời
xác định 14 hợp chất phenolic trong rượu vang đỏ và phân biệt các đỉnh tín hiệu bị chồng
chéo thường xuyên gặp trong phân tích rượu. Guerrero cũng sử dụng một sự kết hợp của
phát hiện UV (ở 320 nm) và tín hiệu huỳnh quang (bước sóng kích thích = 290 nm, bước
sóng phát xạ = 320 nm) đặc trưng cho axit hydroxycinnamic và flavan-3-ols, tương ứng.

Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 22

trigalloylated flavan-3-ols đến heptamers trong chiết xuất từ hạt nho Graciano,
Tempranillo và Cabernet Sauvignon.
Họ quan sát thấy nồng độ của monogalloylated flavan-3-ols thấp hơn gấp 10 lần
non-galloylated flavan-3-ols: hiện tượng giảm nồng độ này được quan sát ở tất cả các
mẫu nhưng nó có thể là kết quả của sự giảm hiệu quả quá trình ion hóa của dạng
galloylate hóa so với dạng không galloylate hóa. Tuy nhiên, do thiếu mẫu galloylate hóa
tiêu chuẩn, giả thuyết này không thể kiểm tra được. Dựa trên so sánh tương đối của các
nồng độ, người ta nhận thấy rằng sự phân bố của flavan-3-ols trong hạt giống bị chi phối
bởi các yếu tố như di truyền, và cũng bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu .
Các công trình khác gần đây kết hợp kỹ thuật ESI-MS và ESI-song song (MS /
MS) được ứng dụng cho việc xác định / định lượng của procyanidin được galloylate hóa
trong hạt nho. Thật vậy, khối phổ song song cho phép có được thông tin cấu trúc cụ thể
hơn của một hợp chất đặc biệt trong hai giai đoạn phân tích khối lượng. Các ion kích
thích, tạo thành từ bước ion hóa đầu tiên được cô lập bởi giá trị m / z đặc trưng của chúng
và sau đó lại bị phân mảnh và xách định trong bước phân tích thứ hai. Tandem MS có thể
được thực hiện trong hai quang phổ kế khối lượng lắp ráp song song (ví dụ: hai
quadrupoles) hoặc trong một thiết bị phân tích khối lượng duy nhất có khả năng lưu trữ
ion (ví dụ: ion bẫy tứ cực).
Trong công trình của Guerrero và đồng nghiệp, MS-MS phân mảnh có hiệu quả để
phân biệt một số hợp chất như quercetin-3-glucuronide và isorhamnetin-3 glucoside mà
hiện nay có cùng khối lượng và ion mẹ đầu tiên (m / z = 477) nhưng được phân biệt bởi
các ion phổ khối lượng sau (301 cho quercetin-3-glucuronide và 315 cho isorhamnetin-3-
glucoside). Gần đây (năm 2012), Delcambre và Saucier chứng minh hiệu suất của
UHPLC kết hợp với ESI và Q-TOF (thời gian bay gấp 4 lần) trong chế độ MS / MS để
xác định cấu trúc mới. Phổ khối lượng thời gian bay dựa trên một nguyên tắc tách khối
lượng đơn giản. Xem xét loại ion hóa bắt đầu từ vị trí tương tự tại cùng một thời gian và

trong rượu vang. Sự hình thành các sắc tố anthocyanin có nguồn gốc từ tự nhiên xảy ra
trong quá trình lão hóa rượu vang đỏ và một loạt các cấu trúc (cụ thể là
carboxypyranoanthocyanins, methylpyranoanthocyanins, pyranoanthocyanin-flavanol,
pyranoanthocyanin phenol, portisins, oxovitisins và pyranoanthocyanidin liên hợp bậc 2)
đã được xác định trong hai thập kỷ qua. Hoạt động thông thường trong chế độ ion dương
Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Lê Hà Việt Luân Trang 24

và trong môi trường axit, anthocyanin được phát hiện ở dạng cation flavylium, M + để
cung cấp tín hiệu với cường độ cao. Bằng cách kết hợp HPLC và electrospray với một
máy dò khối lượng, sáu mươi sáu anthocyanins khác nhau đã được phát hiện trong rượu
vang đỏ Vitis viniferaDornfelder từ năm 1997. Những anthocyanin đã được xếp vào các
nhóm cấu trúc chứa đơn và diglucosides (dạng acetyl-và-coumaryl) các loại rượu vang.
Ngoài ra, các este của axit axetic và este của axit coumaric 3-glucosides đã được phát
hiện. Sản phẩm lão hóa như vitisin A (m / z = 561) và vitisin B (m / z = 517) và
acetylvitisinA (m / z = 603) và B (m / z = 559), đã được xác định trong các công trình
khác cũng được xác định trong loại rượu này. Fulcrand et al. cho thấy vitisin Một kết quả
từ tạo vòng giữa cacbon 4 và nhóm 5-hydroxyl của flavylium phân nưa
originalanthocyanin với các liên kết đôi của mẫu enolic acid pyruvic, tiếp theo là
dehydratation và rearomatization bước. Cuối cùng, bằng cách áp dụng một quá trình thủy
phân axit với rượu vang, Heier et al. chỉ ra rằng tất cả các pigmentsdetectable tại 525 nm
được lấy từ xương của delphinidin, cyanidin, peonidin, petunidin, malvidin và derivates
của họ acid pyruvic và acetaldehyd. Gần đây hơn, Xu và đồng workersattempted để phát
triển một phương pháp nhanh chóng và chính xác để định lượng anthocyanidin trong nho
và nước ép nho thông qua một quá trình thủy phân hỗ trợ sử dụng LC / MS. Trong điều
kiện tối ưu, năm anthocyanidins lớn (Dp, Cy, Pt, Pn, MV) được phân tách hoàn toàn
trong 25 phút và định lượng thành công. Phương pháp này đã được đề xuất như một
phương pháp tiếp cận toàn diện để xác định số lượng anthocyanidins để tránh những khó
khăn ofseparation / nhận dạng của nhiều anthocyanin có trong ma trận nho và rượu vang.

và mô hình phân mảnh giống như các anthocyanin tương ứng, ví dụ như, glycosides
delphinidin ([M] + chất anthocyanins và [M + H] + glycosides flavonol) đều giống nhau.
Đổi lại, phổ MS thu được ở chế độ ion âm được chứng minh là một công cụ có giá trị cho
sự phân biệt các anthocyanin với các polyphenol không anthocyanin (
Hình 7
). Cụ thể, các
ion kép của [M-2H] và [M-2H + H2O] - đặc trưng tới anthocyanin trong khi một ion
phân tử duy nhất [M-H]-chiếm ưu thế trong quang phổ của các chất polyphenol không
anthocyanin.