BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC- MÔI TRƯỜNG
BÁO CÁO THỰC HÀNH
VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
LỚP 09MT112
NHÓM 1 - TỔ 2:
1. NGUYỄN TĂNG CƯỜNG
2. NGUYỄN VĂN CƯỜNG
3. DƯƠNG THỊ QUỲNH CHÂU
4. NGUYỄN VĂN ĐÔ
GVHD: VƯU NGỌC DUNG
BÀI BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
I .Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh
a. Pha môi trường:
+môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi cho hòa tan vào nước cất.
+môi trường đặc: cân agar và hóa chất cho vào bình tam giác hay becher
rồi hòa tan trong nước, đun trong bếp hay hấp trong autoclave.
b. Chuẩn bị môi trường(làm thạch petri):
Đun thạch chảy lỏng, để nguội 50 – 60
o
c .
Tay phải cầm bình môi trường đã chảy lỏng, giữ hơi nghiêng, dùng tay trái
xoay và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng bình trên đèn cồn.
Dùng tay trái hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót vào hộp 1 lượng
môi trường thích hợp.
Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ trên bàn để thạch dàn
thành 1 lớp đều trên đáy hộp. không xoay mạnh làm thạch bắn lên.
Hé mở nắp hộp và để yên cho đến lúc thạch đặc hoàn toàn.
Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên trên.


- Glucose: 1 g
- Agar: 15 g vào 1 lít nước cất. Sau đó hấp khử trùng ở 121
o
C, 1atm, và
thời gian 30 phút.
II. Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị 2 bình nón có dung tích 250ml
+ Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng
+ bình 2 đã vô trùng và không chứa gì
- Cân 1g mẫu đất cho vào bình 2 rối đổ toàn bộ nước ở bình 1 vào
- Lắc 5 phút , để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu theo dãy thập phân .
III.Tiến hành thí nghiệm
1. Nuôi cấy nấm
- Dùng cồn rửa sạch tay( gần hết cách tay ) và không gian xung quanh chỗ
làm việc
- Môi trường sabouraud sau khi vô trùng , lấy ra để nguội còn khoảng 45-50
độ C.
- Hút 0.1ml mẫu vào ống môi trường , đậy nút lại . lắc tròn quanh trục ống
nghiệm .
- Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật
nhanh nắp trên lại sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí .
- Tất cả thao tác trong quá trình làm đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn để
tránh bị nhiễm khuẩn .
- Kết quả : sau 24h ta sẽ thấy các sợi bông đen và các chấm nhỏ li ti . Đó là
nấm mốc và các bào tử .
2. Nuôi cấy vi sinh hiếu khí
- Dùng cồn rửa sach tay ( gần hết cách tay ) và khử trùng không gian xung
quanh nơi làm việc .
- Môi trường thạch sau khi hấp khử trùng mang ra để nguội khoảng 45-50 độ
C .

đỏ của mật kết tủa .
hình ảnh của vi khuẩn e.coli và coliform
4. Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, một số ống
nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và một số ống hút (1ml) vô trùng.
Ta lấy 10ml nước cất đã vô trùng cho vào 3 ống nghiệm. Lấy 0,1g đất cho
vào ống nghiệm thứ 1 lắc đều cho đến khi đất tan hoàn toàn.
Dùng ống hút hút 1ml nước ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 lắc
đều, sau đó cũng lấy 1ml nước ở ống nghiệm 2 cho vào ống nghiệm 3 lắc
đều.
Tùy theo số lượng vi sinh vật trong mẫu mà ta pha loãng nhiều hay ít. Ở
đây ta lấy 1ml nước mẫu tương đương với độ pha loãng là 10
-1
.
a. Mẫu ở trạng thái lỏng :
- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Hình 5.1 : Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân
b. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực
phẩm)
- Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml
+ Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng
+ Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì
- Khử trùng cối chày sứ bằng cách cho một ít cồn vào và đốt lên. Sau đó
để nguội.
- Cân 1 g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu.
- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2.
- Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng
thí lỏng.
- Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng
nhiều hay ít

, mẫu đất)
1. Vi sinh vật hiếu khí :
- Phương pháp : đếm khuẩn lạc quan sát được
- Công thức :

Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng
CFU/g= …………………………………………
Thể tích mẫu (ml)
* tính toán:
- độ pha loãng: 10
3
- thể tích mẫu : 0,05 ml
Số trung bình TVSVHK: (30+45+50)/3 = 42
CFU/g = ( 42 x 10
3
) /0,05 = 840000đĩa 1 đĩa 2 đĩa 3
CFU 30 45 50
CFU
tb
(30+45+50)/3 = 42
CFU/g (42 x 10
3
)/0,05 = 840000
2. Tổng vi nấm:
- Phương pháp : đếm khuẩn lạc quan sát được
- Công thức :
Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng

- Kết quả : sau 2 ngày ta có kết quả sau
Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3
5 60 40
- Theo bảng MPN thì số lương vi khuẩn là 15MPN/100ml . tuy nhiên đây là
số lượng vi sinh vật nếu ta cho 10ml mẫu vào hệ thống ống nghiệm đầu tiên .
Thực tế ta chỉ hút 0.1ml mẫu cho nên kết quả chính xác cho mẫu trên là 15 x
10 = 150MPN/100ml mẫu hay 150000MPN/0.1ml mẫu .
V. Phương pháp nhuộm Gram:
1. Dụng cụ:
- Môi trường có vi khuẩn
- tiêu bản phết kính
- muối sinh lí
- tím kết tinh
- lugol
- safranin O (fuchsin)
- giấy thấm
- dầu soi kính
2. Các bước tiến hành:
- Rửa lam kính thật sạch, lau khô hoặc hơ trên đèn cồn.
- Dùng bút lông vẽ 1 hình tròn nhỏ và ghi tên người thí nghiệm.
- Lật mặt sau lam kính dùng que cấy nhúng vào nước thải lấy 1 lượng vừa đủ cho
vào hình tròn đã vẽ và dàn đến vi sinh.
- Chờ cho khô hoặc hơ trên đèn cồn.
- Sau khi khô, ta nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi bằng Crystal violet.
- Sau 1-2 phút rửa lại bằng cồn 96
0
rồi tiếp tục rửa bằng nước cất. Sau đó hơ khô
trên đèn cồn.
- Nhỏ tiếp iodine(lugol)
- Để 1-2 phút rửa bằng cồn và nước cất.

4. Hỏi: Có mấy loại môi trường thạch ống nghiệm? nêu các đặc trưng cho từng
loại môi trường?
Trả lời: có 2 loại môi trường thạch ống nghiệm: thạch đứng và thạch nghiêng.
5. Hỏi: Tại sao phải pha loãng mẫu? các bước pha loãng mẫu?
Trả lời: pha loãng mẫu để dễ dàng quan sát được số lượng vi sinh vật có trong
mẫu. Các bước pha loãng (xem phần 4 ).
6. Hỏi: Vi sinh vật hiếu khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác
định tổng vi khuẩn hiếu khí?
Trả lời: vi sinh vật hiếu khí có ở khắp mọi nơi nào có oxi.Ý nghĩa việc xác định
tổng vi khuẩn hiếu khí là để biết được nơi đó có ô nhiễm hay không.
7. Hỏi: Tại sao phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ: môi trường, dụng cụ,
tay trong quá trình thao tác?Ý nghĩa việc khử trùng và sát trùng?
Trả lời: phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ để vi khuẩn có hại không xâm nhập
và lan truyền trong quá trình thao tác.Ý nghĩa của việc khử trùng và sát trùng là
đảm bảo môi trường vi sinh vật sống và phát triển tốt.