NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

LỜI CẢM ƠN

Trong khoảng 4 tháng làm luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại
học Bách Khoa Tp HCM đã nhiệt tình giúp đỡ các vấn đề liên quan và tặng giống vi sinh
vật dùng trong đề tài.
Thạc Sĩ Trần Thị Tưởng An đã ân cần hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt
quá trình làm luận văn.
Kỹ Sư Quách Đức Tính đã tặng giống và hướng dẫn tận tình trong quá trình thực
hiện đề tài này.
Các cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117B2 đã tạo điều kiện cho tôi có thể
sử dụng các thiết bị và dụng cụ phục vụ cho đề tài.
Cha mẹ và người thân đã giúp đỡ về mặt tinh thần và kinh tế để tôi có thể an tâm
hoàn thành luận văn.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM đã cùng giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Và cuối cùng là gửi đến các quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã giành thời
gian đọc và nhận xét luận văn này.

1. Kết quả phân lập hệ vi khuẩn lactic từ hạt kefir: Phân lập được bảy chủng vi
khuẩn. Có sáu chủng Gram dương (đều là vi khuẩn lactic) và một chủng Gram âm.
2. Thử khả năng sinh hoạt tính bacteriocin: có tất cả sáu chủng sinh hoạt tính
bacteriocin.
3. Kết quả khảo sát hoạt tính bacteriocin: Hoạt tính bacteriocin thô của chủng
Lactobacillus acidophilus (L2) là 457 AU/ml.
4. Khảo sát bảo quản cá Diêu Hồng:
So với mẫu đối chứng (không tác nhân bảo quản) thì mẫu bảo quản bằng dịch
bacteriocin thô kết hợp với dịch chitosan 1% bảo quản tối đa ba ngày.

i
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
CÁC TỪ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC SƠ ĐỒ vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Kefir 2
1.1.1. Nguồn gốc và sự hình thành 2
1.1.2. Cấu tạo hạt kefir 2
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong hạt kefir 4
1.2. Vi khuẩn lactic 6
1.2.1. Khái niệm 6
1.2.2. Phân loại 6
1.2.3. Đặc điểm chung. 7
1.3. Bacteriocin 8
1.3.1. Giới thiệu chung 8
1.3.2. Phân loại 9

2.3.9. Thăm dò việc sử dụng bacteriocin thô để bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 31
2.4. Phương pháp phân tích 32
2.4.1. Phương pháp đánh giá cảm quản 32
2.4.2. Phương pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 35
3.1. Hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir 35
3.1.1. Đặc điểm đại thể và vi thể 35
3.1.2. Khảo sát khả năng sinh acid lactic 38
3.1.3. Đặc điểm sinh lý 39
3.1.4. Đặc điểm sinh hóa 40
3.1.5. Kiểm tra hoạt tính bacteriocin 42
3.1.6. Định danh vi khuẩn lactic bằng bộ kit API 50 CHL 45
3.2. Ứng dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu 45
3.2.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin 45
3.2.2. Sử dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng 46
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 53
4.1. Kết luận 53
4.2. Kiến nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC 57
iii

CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir. 3
Bảng 1.2. Tóm tắt hệ vi sinh vật phân lập trong hạt kefir. 5
Bảng 1.3. Một số đặc điểm phân loại LAB theo Orla-Jensen (1919). 7
Bảng 1.4. Bacteriocin của một số chủng vi khuẩn 15
Bảng 2.1. Các mẫu khảo sát phương pháp bảo quản cá 32
Bảng 2.2. Bảng đánh giá chất lượng cảm quan bảo quản cá sơ chế 33
Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể và vi thể của hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir. 35
Bảng 3.2. Đặc điểm sinh lý của hệ vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir. 39
Bảng 3.3. Kết quả thử khả năng sinh catalase của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
được từ hạt kefir. 40
Bảng 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir. 40
Bảng 3.5. Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus acidophilus (L2) 45
Bảng 3.6. Các phương pháp bảo quản cá sơ chế tối thiểu 47

vi
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương theo Cotter và cộng sự. 9
Sơ đồ 2.1. Nội dung các bước thí nghiệm của đề tài. 26
Sơ đồ 2.2. Tiến trình thí nghiệm bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 31

1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì
yếu tố sức khỏe là một vấn đề quan trọng. So với việc bảo quản thực phẩm bằng kháng
sinh đã gây ra nhiều tác động tiêu cực như khả năng kháng lại thuốc kháng sinh và
những dư lượng trong thực phẩm làm ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người thì
bảo quản bằng tác nhân sinh học mà tiêu biểu là bacteriocin đã thu hút được nhiều chú ý
ở các nước phát triển. Do đó việc bảo quản thực phẩm bằng bacteriocin ngày càng được
thay thế cho việc sử dụng chất kháng sinh. Tuy nhiên chỉ có nisin thu được từ
Lactococcus lactis và pediococin từ Pediococcus được FAD và WHO công nhận và ứng
dụng rộng rãi trong việc bảo quản. Việc tìm ra những loại bacteriocin mới để có thể ứng

và mọi người sử dụng kefir như một loại thuốc chữa bệnh.
Năm 1930 kefir đã được tiến hành nghiên cứu sản xuất hàng loạt. Tuy nhiên, quy
trình này cho chất lượng sản phẩm cũng không tốt như cách truyền thống. Vào 1950,
viện nghiên cứu của Nga đã phát triển quy trình sản xuất kefir thương mại.
Hiện tại kefir là một trong những loại sữa lên men rất được yêu thích ở Nga.
Ngoài ra kefir cũng đang được sản xuất một số lượng lớn ở Cộng Hòa Séc, Phần Lan,
Hungary, Na Uy, Hà Lan, Thụy Điển, Thụy Sĩ, Đan Mạch, Mĩ, Pháp, Canada,…[5].
1.1.2. Cấu tạo hạt kefir
FAO/WHO (2001) đã định nghĩa kefir dựa trên thành phần hệ vi sinh vật của cả
hạt kefir và trong sản phẩm kefir cuối cùng. Trong sản xuất kefir, người ta sử dụng tổ
hợp giống vi sinh vật dưới dạng hạt kefir. Các hạt kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt,
hình dạng không ổn định và thường kết thành chùm với nhau tạo dạng tương tự hoa
chou-fleur với đường kính trung bình 0.3÷2 cm. Thành phần hóa học hạt kefir bao gồm
89-90% nước, 0.2% lipid, 3% protein, 6% đường (chủ yếu là polysaccharide) và 0.7%
chất tro.
Hạt kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi chất polysaccharide. Các giống
này bao gồm vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc ) và nấm men.
Đôi khi, còn tìm thấy vi khuẩn Acetobacter cùng với các vi sinh vật khác tổ chức thành
khối cầu vi sinh vật.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
3
Tuy vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn nhưng từ hàng nghìn năm qua sự tiêu
thụ đã chứng minh được rằng hệ vi sinh vật trong kefir là không gây bệnh mà còn có khả
năng ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như Salmonella hay Sigella [8].

Hình 1.1. Hạt kefir [29].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir.
Năng lượng 65Kcal Thành phần khoáng (g)
Chất béo (%) 3.5 Ca 0.12
Protein 3.3 P 0.1

Lactobacillus đạt 10
8
–5x10
9
(cfu/g) gồm nhóm lên men đồng hình và dị hình. Nhóm vi
khuẩn lactic Lactococcus và Leuconostoc với mật độ 10
8
–10
9
(cfu/g) và nấm men với
mật độ 10
6
–10
8
(cfu/g) gồm nhóm nấm men có khả năng chuyển hóa đường lactose và
nhóm nấm men không có khả năng chuyển hóa đường lactose.
Ngoài ra, một số nghiên cứu còn phát hiện sự hiện diện của nhóm vi khuẩn
Acetobacter với mật độ 10
5
– 10
6
(cfu/g). Tỉ lệ vi khuẩn lactic: nấm men thường đạt là
250:1. Có sự khác biệt về sự phân bố nấm men và Lactobacillus. Ở vùng nấm men
chiếm ưu thế thì có ít Lactobacillus và ở vùng Lactobacillus chiếm ưu thế thì có ít nấm
men. Nấm men không phân bố dày đặc ở bên ngoài hạt kefir, chủ yếu tồn tại ở bên trong
hạt. Các loài nấm men lên men được đường lactose thường được tìm thấy tại các vị trí
gần bề mặt hạt kefir. Ngược lại, các loài nấm men không lên men được đường lactose lại
tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong tâm hạt [12].

Hình 1.3. Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử [25].

b
r
e
v
is

Lb. casei
Lb. casei subsp.
rhamnosus

Lb. casei subsp.
pseudoplantarum

Lb.
paracasei
subsp.
paracasei

Lb. cellobiosus
Lb.
de
l
b
r
uec
k
ii
subsp.
bulgaricus


r
i

Lb.
k
e
f
i
r
a
no
f
a
c
i
en
s
subsp. k
e
f
i
r
g
r
a
nu
m
subsp.
Lb.
kSTREPTOCOCCUS/LACTOCOCCUS

Lactococci lactis subsp. lactis
Lc. lactis var. diacetylactis
Lc. lactis subsp. cremoris
Streptococc lactis
St. salivarius subsp. thermophilus
Enterococcus durans
Leuconostoc cremoris
Leuc. mesenteroides

Các chủng khác
Enterococcus durans
Leuconostoc cremoris
Leuconostoc mensenteroides
Micrococcus sp.
Bacillus subtilis
Escherichia coli
[6,11]

Chương 1. Tổng quan tài liệu
6
1.2. Vi khuẩn lactic
Chương 1. Tổng quan tài liệu
7
Bảng 1.3. Một số đặc điểm phân loại LAB theo Orla-Jensen (1919).
Loài
Hình
dạng
Catalase
Khử
nitrite
Lên men Loài hiện tại
Betabacterium Que - - Dị dưỡng
Lactobacillus
Weissella
Thermobacterium

Que - - Tự dưỡng Lactobacillus
Streptobacterium Que - - Tự dưỡng
Lactobacillus
Carnobacterium
Streptococcus Cầu - - Tự dưỡng
Streptococcus
Enterococcus,
Lactococcus
Vagococcus
Betacoccus Cầu - - Dị dưỡng

1.3. Bacteriocin
1.3.1. Giới thiệu chung
Trong những năm gần đây, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá
phổ biến trong điều trị bệnh của con người và động vật. Vì thế việc tiếp tục tìm ra những
chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược. Để hạn chế sử
dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự
lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh.
Trong số đó, sự sản xuất bacteriocin từ LAB đã thu hút nhiều chú ý.
Bacteriocin có bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại
vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng
lại chính bacteriocin đó. Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong
quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy
sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi
khuẩn. Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin do E.coli sinh tổng hợp nên.
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram
dương với những đặc điểm:
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: gồm nhiều loại protein khác nhau về kích
thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu nhiều nhất là colicin, do vi
khuẩn E.coli tổng hợp. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có khả năng kháng
khuẩn yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi
khuẩn Gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn Gram âm ở hai điểm sau: việc
tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tổng
hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram
âm.
Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:
- Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
9

Lớp 1a: là những phân tử peptide tích điện dương, dài 43 amino acid. Những peptide
này hoạt động chủ yếu hoạt động phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào đích. Có
thể chia lantibiotic A thành hai phân nhóm dựa trên kích thước, điện tích và trình tự
peptide dẫn.
Lớp 1: peptide của
lantibiotic

Loại 2a: giống
pediocin
Loại A: eptide
thẳng
Lớp 4: peptide
vòng

Lớp 3: protein lớn
(>10 kDa
)

Loại 3b:
không phân
gi
ả
i

Loại 2b: đa
thành phần
Loại 3a:
Lysin

Loại 2c:

Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự peptide dẫn ở đầu N,
trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt
hóa.
Lớp 2: là những phân tử bacteriocin phân tử nhỏ (< 10kDa), thường gồm những
phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bền nhiệt.
Bacteriocin lớp hai có phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp hai có thể chia thành ba phân lớp:
Lớp 2a: bacteriocin lớp này rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu
N và hoạt tính kháng Listeria.
Lớp 2b: những bacteriocin này cần có sự kết hợp của hai hoặc nhiều peptide trong
hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh. Trong hầu hết các trường hợp, các
peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin, nhưng hoạt tính sẽ cao khi có sự hiện
diện của peptide thứ hai. Ví dụ như hoạt động của hai peptide enterocin L50A và
enterocin L50B.
Lớp 2c: bacteriocin phụ thuộc vào nhân tố sec. Phân tử bacteriocin lớp 2c được
đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc nhân tố
sec.
Bacteriocin lớp 2a có tiềm năng ứng dụng quy mô công nghiệp do khả năng
kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các bacteriocin lớp
1 (nisin), do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng và không tiêu diệt những chủng
khởi động. Pediocin PA-1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổ biến nhất
trong số các bacteriocin lớp 2a.
Lớp 3: bacteriocin lớp 3 là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt. Lớp
này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của
bacteriocin. Bacteriocin lớp 3 được thu nhận từ một số giống Lactobacillus. Chỉ một vài
bacteriocin thuộc lớp này được định danh.
Lớp 4: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid
và carbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng
của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch.
Bacteriocin lớp 4 là kết quả của sự tương tác đặc tính kỵ nước và tích điện dương của
bacteriocin với các phân tử khác trong dịch mô. Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc

lipase, phospholipase, amylase. Điều đó chứng tỏ ngoài sự có mặt của các chuỗi protein
liên kết lại với nhau, trong cấu trúc bacteriocin còn chứa nhiều cấu tử khác như glucid,
lipid, phospholipid kết hợp với protein tạo thành một phức hợp phức tạp. Ví dụ:
Lactocin 27 được cấu tạo từ phức hợp lipocarbohydrate protein. Caseicin LSH và
leuconocin S là các glycoprotein.
Sự hiện diện của cầu nối disulfide hoặc thioether trong cấu trúc ảnh hưởng tới độ
bền và hoạt tính của bacteriocin.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
12
Thành phần, số lượng, trình tự các amino acid trong phân tử peptide tạo ra những
đặc điểm khác nhau giữa các loại bacteriocin, bao gồm khối lượng phân tử, điểm đẳng
điện pI, tính kỵ nước, điện tích của phân tử ở một điều kiện pH xác định… Trên cơ sở
những đặc điểm này, người ta lựa chọn phương pháp tinh sạch cho từng loại bacteriocin.
1.3.3.2. Kháng nguyên
Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và nhiều
bacteriocin có tính kháng nguyên cao. Tuy nhiên hiện nay chỉ có duy nhất một vài báo
cáo trong nghiên cứu tính kháng nguyên của bacteriocin sinh bởi loài Gram dương.
Megacin A- 216 là một kháng nguyên và tế bào cũng sinh ra một kháng thể có khả năng
chống lại ảnh hưởng giết chính nó. Việc nghiên cứu những kháng thể đến bacteriocin
trong huyết thanh của con người có lẽ là một lĩnh vực thú vị cho những nghiên cứu sau
này [27].
1.3.3.3. Tính chất ổn định của bacteriocin
Một số nghiên cứu về những đặc tính của bacteriocin cho thấy rằng những phân
tử này có thể hoạt động tốt dưới những khoảng nhiệt độ và độ pH nhất định. ST28MS và
ST26MS được sản xuất bởi Lactobacillus plantarum có thể hoạt động ổn định trong 2
giờ tại những giá trị pH từ 2.0 đến 12.0. Không giảm khả năng hoạt động chống vi
khuẩn sau 90 phút tại 100ºC hay 20 phút tại 121ºC. Đặc tính chịu nhiệt có thể liên quan
đến cấu trúc phân tử của bacteriocin.
1.3.4. Hoạt động của bacteriocin
1.3.4.1. Phạm vi hoạt động của bacteriocin

khác nhau, những loài cùng bộ gen và thậm chí đến môi trường nuôi cấy từ những điều
kiện ngoại cảnh khác. Hai kiểu miễn dịch được thấy ở lantibiotic. Một kiểu miễn dịch
dựa vào protein miễn dịch đặc trưng (LanI) trong khi kiểu miễn dịch khác dựa một vật
chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (LanEFG). Bacteriocin sẽ nhận biết được vi sinh
vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của những thụ quan đặc biệt và kết quả là
chúng không thể bám vào tế bào vi sinh vật.
Di truyền học của sự sản xuất lacticin 3147 và sự miễn trừ. Lacticin 3147 được
sản xuất từ vi khuẩn Lactococcus lactis ssp. lactis 3147 và được mã hóa trên plasmid.
Plasmid mà mã hóa sự sản xuất lacticin 3147 và sự miễn trừ là pMRC01. Plasmid này có
thể sẵn sàng được kết hợp giữa giống Lactococcus và sự biến dạng khác. Toàn bộ trình
tự nucleotide 60, 232 của plasmid pMRC01 này được xác định, đại diện cho trình tự lớn
nhất của plasmid Lactococcus cho đến nay. Sự phân tích chi tiết của quỹ tích di truyền
học liên quan trong sự sản xuất của lacticin 3147 được cung cấp trong giấy bởi
Dougherty v.v , 1998.
Những gen này được chia làm hai cụm, với ltnA1, ltnA2, ltnM1, ltnT, ltnM2 và
ltnD được sao chép cùng một hướng và ltnH, ltnJ, ltnF và ltnE được sao chép theo
hướng ngược lại.
Những gen trong cụm lớn, ltnA1 và ltnA2 mã hóa hai peptide tương đối ngắn mà
nó là điểm khởi đầu cho bacteriocin lacticin 3147 hoạt động. Những peptide này có lẽ
đòi hỏi trải qua một số cải biến trước khi chúng hoạt động. Sản phẩm gen ltnM1 và
ltnM2 (các protein cải biến) có thể thực hiện vai trò này. Lacticin 3147 là khác thường
trong trường hợp này cho đến nay, nó là bacteriocin duy nhất được biết có hai protein cải
biến, một đặc tính là nối hai thành phần peptide khác nhau của sự hoạt động bacteriocin.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
14
Sau khi peptide LtnA1 và LtnA2 được cải biến thì tế bào cần đưa chúng ra ngoài để
bacteriocin có thể làm làm giảm đi một số ảnh hưởng chống lại vi sinh vật khác. Sự vận
chuyển này nhờ vào hệ thống vận chuyển ABC (ATP Binding Cassette) mà được mã
hóa bởi ltnT. Nếu sự tập trung của lacticin 3147 ở sát vùng lân cận của tế bào sản xuất
trở nên quá cao, nó có thể giết tế bào sản xuất. Để tránh trường hợp này, tế bào sản xuất