i LỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Công
nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này tôi xin
bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đặng Thúy Bình và Ths. Nguyễn Thị
Hải Thanh, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, TP.
Nha Trang - Khánh Hòa đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện để hoàn thành đồ án.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám đốc và các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường,
Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng trang thiết bị, hóa
chất và các dụng cụ thí nghiệm.
ThS. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinh học
đã giúp đỡ tôi về kỹ thuật và thao tác.
Các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha
Trang đã cung cấp cho tôi những kiến thức nền tảng để hoàn thành đồ án tốt nghiệp
này.
Tập thể lớp 49CNSH và nhóm sinh viên Trường Đại học Nha Trang đã cùng tôi
thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia
đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Xin kính chúc mọi người sức khoẻ, hạnh phúc và thành công.
Nha Trang, tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Hoàng Thị Lý
ii


I.3.3. Nghiên cứu di truyền ốc cối 28
I.3.3.1. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa: 28
iii I.3.3.2. Mối liên hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh dưỡng (Conus spp.) 30
I.3.3.3. Nghiên cứu cấu trúc hệ gen. 31
I.3.3.4. Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam 32
I.3.3.5. Nghiên cứu di truyền độc tố. 33
I.3.3.6. Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối và động vật thân mềm. 34
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 36
II.1. Đối tượng và địa điểm thu mẫu: 37
II.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: 38
II.4. Tách chiết DNA 39
II.4.1. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification
System 39
II.4.2. Chuẩn bị gel agarose 40
II.4.3. Điện di và đọc kết quả 41
II.5. Phản ứng PCR 41
II.5.1. Cơ sở lý thuyết: 41
II.5.2: Tiến hành thực nghiệm: 42
II.6. Giải trình tự gen 16S mtDNA thu được 43
II.6.1: Cơ sở lý thuyết. 43
II.6.2. Phương pháp tiến hành: 44
II.7. Phân tích đa dạng loài ốc cối. 44
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 48
III.1. KẾT QUẢ 49
III.1.1. Đặc điểm hình thái 49
III.1.2. Tách chiết DNA tổng số 51
III.1.2.1. Lựa chọn vị trí lấy mẫu mô tách chiết 51
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA
26
Bảng 2.1: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 43
Bảng 2.2: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa
(best-fit models) được lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng
Akaike Information Criterion. 45
Bảng 2.3: Mã số các trình tự gen 16S và chế độ ăn của các loài ốc cối trong nghiên
cứu hiện tại và từ Genbank. (P: ăn cá; P+V: ăn cá và nhuyễn thể; P+V: ăn cá và
giun biển; V: ăn giun biển; M: ăn nhuyễn thể; U: chưa nghiên cứu (unknow)). 46
Bảng 3.1: So sánh tỷ lệ các trình tự giống nhau giữa các loài ốc cối thu thập được
ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam 56
Bảng 3.2: Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phương pháp MP, ML,
BI. Nhóm được phân loại dựa theo chế độ ăn (P: ăn cá, V: ăn giun; M: ăn nhuyễn
thể; U: chưa biết). 59
vi DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái ngoài của một số loài ốc cối 10
Hình 1.2. Cấu tạo bên ngoài của ốc cối 4
1 LỜI MỞ ĐẦU
Ốc cối là một trong những họ động vật thân mềm lớn (gồm khoảng 700 loài)
thuộc loài ăn thịt, có nọc độc, phân bố rộng rãi trên thế giới đặc biệt là ở vùng biển
nhiệt đới. Vỏ của các loài ốc cối có màu sắc và hoa văn đẹp nên thường được khai
thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm. Ngoài ra, ốc cối còn
là nguồn nguyên liệu sản xuất các loại thuốc chữa các cơn đau mạn tính, ung thư và
nhiều bệnh khác. Các nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối
(conotoxin) có hiệu quả giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphine mà không
gây nghiện hoặc các phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc
giảm đau hiện nay (Olivera, 1990). Vì những lợi ích về kinh tế và y học đó mà tình
trạng khai thác bừa bãi các loài ốc cối ngày càng gia tăng. Bởi vậy, đòi hỏi các nhà
khoa học phải có các nghiên cứu để bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài
nguyên này. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sự đa dạng loài của
ốc cối. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng lại ở mức độ
thống kê và mô tả các đặc điểm hình thái giải phẫu. Hiện việc nghiên cứu về ốc cối
ở mức độ phân tử vẫn còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu và xây dựng phát sinh chủng


3 Hình
1.1: Hình thái ngoài c
ủa một số
loài

ốc cối.
(o)
I.1. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI (CONUS.SPP)
I.1.1. Phân loại
Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong
những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay, trên
thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc giống
Conus.
Hệ thống phân loại của ốc cối như sau:
Giới: Animalia
Ngành: Mollusca
Lớp: Gastropoda

Cấu tạo bên ngoài của ốc cối được chú thích (hình 1.2): Hình 1.2. Cấu tạo bên ngoài của ốc cối.
(
Cấu tạo bên ngoài của ốc cối gồm những bộ phân sau:
5 1) Vòi hút (Proboscis): Vòi hút là vũ khí săn mồi của ốc cối. Độc tố được tiêm vào
con mồi bằng các răng chứa trong túi răng chitin. Vòi hút có thể duỗi dài ra gấp 2
lần cơ thể ốc cối.
2) Súc tu (Siphon): siphon của ốc có chức năng như mũi. Đó là một túi có thể duỗi
dài ra và phát hiện con mồi trong môi trường nước xung quanh. Nó cũng góp phần
đưa nước đến mang giúp cho quá trình hô hấp.

phong phú hơn (Kohn và cs, 2001).
6
Hình 1.3: Khu vực phân bố của Conus textile trên thế giới (chấm vàng)
(
Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực
Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (như Trường Sa,
Hoàng Sa, Côn Đảo, )
I.1.4. Đặc điểm sinh học, sinh sản
 Tuổi thọ, kích cỡ và trọng lượng
Vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10-15 năm trong tự nhiên cũng như
trong điều kiện nuôi nhốt, dựa vào chỉ tiêu sinh trưởng của vỏ. Chúng có thể đạt đến
kích cở chiều dài tối đa là 23 cm, nhưng hầu hết các loài đều có kích thước nhỏ
dưới 8cm và khối lượng dưới 100g (Röckel và cs, 1995).
 Tập tính sống.
Ốc cối thường sống đơn lẻ, nhưng một số loài được tìm thấy với số lượng
lớn ở một số khu vực riêng biệt.
Phần lớn các loài ốc cối săn mồi vào ban đêm. Mặc dù chúng có cuống mắt
nhưng tầm nhìn của chúng rất kém, và chúng được cho là sử dụng khả năng cảm

ấu trùng sống ngoài khơi thường kéo dài khoảng từ 1 đến 50 ngày. Vòng đời của ốc
cối kéo dài khoảng 10 – 15 năm trong tự nhiên, cũng như trong điều kiện nuôi nhốt. 8
Hình 1.4: Vòng đời của ốc cối

I.1.5. Chế độ dinh dưỡng và phương thức săn mồi
Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), chúng ăn mồi sống. Thức ăn chính
của chúng là các loài cá nhỏ (được gọi là piscivorous), giun biển (được gọi là
vermivorous), nhuyễn thể (được gọi là molluscivorous), và ngay cả các loài ốc cối
khác (Terlau và Olivera, 2004;Olivera và cs, 2002). Chúng có một cơ quan bắt mồi
chuyên biệt là dải răng kitin. Răng kitin của ốc cối hõm sâu và có gai, giống như
những cây lao thu nhỏ (chiều dài của răng thường khoảng vài mm, nhưng đôi khi có
thể lên tới 10mm). Khi ốc cối nhận ra đối tượng vòi của chúng kéo dài ra, và nhờ
lực co cơ những mũi tên từ ống vòi được phóng rất nhanh, kèm theo một lượng lớn
độc tố được phóng thích, làm tê liệt con mồi nhanh chóng. Sự tấn công này chỉ xảy
ra trong khoảng một phần nghìn giây. Chất độc sẽ làm tê liệt con mồi và gây tử

Hình 1.6: Conus purpurascens và phương thức săn mồi dạng móc câu
( />1385-6-0)
b

a

c

d
10 Vòi của con ốc phóng vào cá một cây lao móc giống như răng, cái mà hõm
sâu và có gai ở phía đầu của vòi hút (1.6a). Sau khi tiêm nọc độc (1.6b) cá bị cố
định trong khoảng một vài giây (1.6c) và được nuốt bởi miệng của con ốc (1.6d)
(Terlau và cs, 1996).
- Săn mồi dạng lưới: Một hoặc nhiều con mồi bị bắt giữ thông qua vòi được
mở rộng như lưới sau đó tiêm chất độc vào chúng thông qua các gai móc để làm tê
liệt con mồi (hình 1.7). Một số loài có vòi hút ở ngoài giống như ngón tay làm con
mồi nhầm tưởng là hải quỳ. Phần miệng mở rộng trông giống như một cái bát san
hô hoặc nơi trú ẩn trên rạn san hô. Ở các loài săn mồi theo cách này độc tố của

với một túi chứa dạng bầu có thể co bóp. Cơ quan đó chính là tuyến độc. Tuyến độc
tiết ra nọc độc giúp chúng bắt những con mồi xa dễ dàng bằng cách tấn công làm tê
liệt con mồi, mặt khác tuyến độc còn là vũ khí giúp chúng tự vệ cũng như tiêu diệt
kẻ thù.
 Cấu trúc tuyến nọc độc:
Tuyến nọc độc của ốc cối gồm các bộ phận : túi nọc độc, ống dẫn độc, vòi hút,
túi răng kitin (như miêu tả ở hình 1.8)

Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối
(theo Olivera, 1999, có bổ sung).

- Túi nọc độc: hình lưỡi liềm, màu trắng sữa, nằm vuông góc với trục của cơ
thể, lõm về phía đỉnh vỏ, lồi ra về phía ngược lại. Túi nọc độc là cơ quan lớn nhất
trong tuyến nọc độc, có chức năng tiết ra độc tố, đồng thời tạo ra áp lực khi bơm
độc tố vào con mồi.

odontoblast (tế bào tạo răng) có vai trò tạo ra các răng kitin. Các răng kitin ban đầu
mềm sau đó trở nên cứng khi chúng di trú từ nhánh dài đến nhánh ngắn. Quá trình
đi tới nhánh ngắn răng kitin đi song song dọc theo túi. Chỉ một răng kitin trưởng
thành, cứng lên và đi về phía hầu chuẩn bị cho việc tấn công.
- Răng kitin: Răng kitin của Conus spp. giống như kim tiêm trong suốt, khi
tiêm vào cơ thể con mồi răng kitin sẽ được giữ lại trong cơ thể, răng này có vai trò
trực tiếp đưa chất độc vào cơ thể con mồi. Trên răng có các ngạnh để giữ răng kitin
lại trong con mồi. Tùy từng loài sẽ có kích thước răng kitin khác nhau. Có những
loài răng là những kim tiêm rất nhỏ yếu, có loài răng kitin lại rất cứng và chắc. Các
ngạnh của kim tiêm giống như các ngạnh của lưỡi câu. Tất cả răng kitin các loài ốc
cối có ngạnh đầu, một số có ngạnh thứ hai, ngoài ra còn tìm thấy một số rất ít loài
có ngạnh thứ ba. Lưỡi răng kitin có vai trò cắt và mở rộng diện tích tiếp xúc khi
phóng kim tiêm vào con mồi. Đường răng cưa là một dãy răng nhỏ chạy dọc phía
trong thân răng kitin từ ngạnh đầu xuống gần giữa răng kitin. Các răng nhỏ này có
kích thước lớn dần từ đỉnh đến giữa thân răng kitin. Hầu hết tất cả các loài có một
hàng răng nhỏ, chỉ một số ít có hai hàng, một số loài không có đường răng cưa này.
13 Hình thái của răng chitin có thể biến đổi rất lớn giữa các loài và nó quan hệ mật
thiết với các loại thức ăn (Endean và Rudkin, 1965).
Tùy thuộc vào loại con mồi mà phương thức tấn công bằng răng kitin cũng
khác nhau, loài ăn cá chỉ dùng một răng để bắt con mồi, trong khi đó, loài ăn
nhuyễn thể tiếp tục tiêm độc tố vào con mồi sau khi tấn công. Quan sát cho thấy loài
ăn nhuyễn thể có thể dùng đến nửa túi răng kitin để bắt một con mồi (Terlau và
Olivera, 2004). Đối với loài ăn cá thường có 2 dạng răng phổ biến dạng thứ nhất có
răng dài, đường răng cưa ở phía trước, chân hơi mở rộng, có 1 lưỡi nhỏ trên đỉnh ở
một mặt và ngạnh ở trên mặt khác, dạng thứ 2 có chiều dài ngắn hơn dạng thứ nhất,
nhưng thiếu đường răng cưa, chân hơi mở rộng, đỉnh có 2 ngạnh đối diện nhau,
ngạnh thứ 3 rất lớn và nhô ra ngoài (Duda và Paulumbi, 2001).

Hình 1.9: Cấu trúc răng kitin điển hình của ốc cối (Flankin và cs, 2007).

I.1.7. Phân loại độc tố ốc cối conotoxin
Tùy thuộc vào khả năng gây tử vong, mỗi loại peptide của độc tố ốc cối
thuộc loại conotoxin (gây tử vong) hoặc conopeptide (không gây tử vong). Mỗi loại
độc tố ốc là một dãy duy nhất chứa trên 100 loại peptide khác nhau. Khi giải mã
gen, người ta thấy rằng các conotoxin là các propeptide, sau đó chúng được enzyme
endoprotease phân cắt để tạo thành các peptide độc cuối cùng. Các peptide này có
kích thước nhỏ, tương đối dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định tác dụng vào các mục tiêu
chuyên biệt làm cho chúng trở thành các đầu dò (probe) lý tưởng trong dược học.
Một điều rất ngạc nhiên là đa số các độc tố ốc có liên quan đến sự giảm đau đớn và
được dùng trong trị liệu giảm đau. Người ta ước lượng có khoảng trên 50.000 đến
100.000 loại conopeptide nhưng chỉ mới khoảng 0,1% được đặc trưng hóa về được
học. Chính số độc tố lớn lao này tác dụng lên các kênh canxi (ω-conotoxin), natri
(µ-, µO-, δ- conotoxin) và kali (κ- conotoxin), chất vận chuyển norepinephrine (χ-
conopeptide), thụ thể (receptor) acetylcholine nicotinic (α- conotoxin), α
1
-
adrenoceptor (ρ- conopeptide), thụ thể NMDA (conantokins), thụ thể vasopressin
(conopressin) và thụ thể neurotensin (contulakins).
Gai trư

15 Độc tố ốc cối được phân ra thành 6 superfamily (A-, M-,O-, P-,S- và T) dựa
trên khung cystein của chúng, sự tương đồng của trình tự pre-pro của gen, kiểu cuộn
và tác dụng sinh lý. Chúng được biết có hoạt tính antinoceptive, chống động kinh,
bảo vệ tim, bảo vệ thần kinh, do đó chúng trở nên các công cụ hữu ích trong nghiên
cứu ung thư, neuromuscular và rối loạn tâm lý (Bingham, 2010).
Superfamily A gồm 4 họ độc tố: α-, αA-, κA- và ρ-conotoxin. Trong đó α-,
và αA-conotoxin là các nAChR đối kháng, κA- conotoxin tấn công vào các kênh
K
+
trong khi ρ-conotoxin là các antagonist ưa thích tấn công vào các a
1B

adrenoceptor. α-conotoxin làm ngăn cản các thụ thể acetylcholine nicotinic
(nAChR). Các α-conotoxin có chứa từ 12 đến 25 acid amin và có 4 cystein, tạo nên
hai liên kết disulfid. α-conotoxin SII có chứa 6 cystein và 3 liên kết disulfid. Việc
ức chế các thụ thể này cho thấy có liên quan trúc tiếp đến việc học, antinoception,
nghiện nicotin, và rối loạn thần kinh thuộc bệnh Parkinson và Alzheimer.
Superfamily M nhỏ hơn, có hai họ là µ- và ψ-conotoxin. Psi (ψ)-conotoxin
tấn công vào kênh nAChR, không cạnh tranh trong khi mu (µ)-conotoxin làm nghẽn
kênh natri phụ thuộc điện thế (voltage) Na
v
trong các tế bào excitable như cơ, tim,
mô cơ xương và mô thần kinh. Với kích thước trung bình, 22 acid amin, µ-
conotoxin có 6 cystein và 3 liên kết disulfid.
Superfamily O là lớn nhất và có 5 họ: µO-, δ-, ω-, κ- và γ-conotoxin. Cả hai
họ µO- và δ-conotoxin tấn công kênh Na
v


I.2. TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU
(bản đồ địa lý về sự phân bố các vùng biển Việt Nam được mô tả ở hình 1.10)
I.2.1. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm
và ven bờ Quảng Nam.
Quảng Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, chỉ có 2 mùa là mùa mưa và
mùa khô, chịu ảnh hưởng của mùa đông lạnh miền Bắc. Nhiệt độ trung bình năm
20-21
o
C, không có sự cách biệt lớn giữa các tháng trong năm. Lượng mưa trung
bình 2000-2500mm, nhưng phấn bố không đều theo thời gian và không gian, mưa ở
miền núi nhiều hơn đồng bằng, mưa tập trung vào các tháng 9 - 12, chiếm 80%
lượng mưa cả năm.
Nhiệt độ nước biển dao động trong khoảng từ 22,5 – 30,5
o
C. Nhiệt độ nước
biển cao nhất thường xảy ra vào tháng 7, 8 hàng năm, nhiệt độ nóng nhất ghi nhận
được là 30,8
o
C (tháng 7 năm 2002).
17 Cù Lao Chàm là một cụm đảo xã đảo Tân Hiệp, thành phố Hội An, tỉnh
Quảng Nam, nằm cách bờ biển Cửa Đại 15km. Cù Lao Chàm bao gồm 8 đảo: Hòn
Lao, Hòn Dài, Hòn Mồ, Hòn Khô mẹ, Hòn Khô con, Hòn Lá, Hòn Tai, Hòn Ông.
Do địa thế các đảo chụm lại với nhau tạo thành vịnh kín, đồng thời cũng là bức
tường bảo vệ các rạn san hô, nhờ thế mà nơi đây tạo thành hệ sinh thái, nó còn là
nơi trú ngụ của nhiều loài ốc như ốc đụn, ốc cối.
Các hệ sinh thái bãi triều ven bờ Quảng Nam: Theo kết quả nghiên cứu của

o
29’ - 12
o
48’ vĩ độ
Bắc. Đây là một vịnh lớn, sâu và tương đối kín của Việt Nam. Tổng diện tích của
vịnh khoảng 46.000ha trong đó diện tích mặt nước khoảng 41.000ha, diện tích các
đảo khoảng 5.00ha (bao gồm đảo Hòn Lớn, Hòn Bịp, Hòn Mỹ Giang, Hòn Hèo và
các đảo nhỏ khác ở Bắc và Tây Bắc Hòn Lớn). Phần diện tích có độ sâu nhỏ hơn
10m là 16.750 ha chiếm hơn 36 %, còn lại 64% diện tích của vịnh có độ sâu từ
10m – 40m .
Vịnh Vân Phong nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa Nam
Trung Bộ với hai mùa gió chính thịnh hành trong năm (gió mùa Đông Bắc và gió
mùa Tây Nam) và chịu ảnh hưởng mạnh bởi chế độ gió địa phương (gió Tu Bông
khô lạnh, gió tây khô nóng và cả gió đất biển). Đây là vùng có độ ẩm, lượng mưa
thấp và số giờ nắng cao nhất tỉnh Khánh Hòa.
Nhiệt độ nước biển dao động trong khoảng từ 23,8 – 30,6
o
C. Là khu vực có
chế độ nhiệt cao hơn hẳn so với các khu vực khác thuộc Trung Bộ. Nhiệt độ nước
biển cao nhất thường xảy ra vào tháng 5 – 9 hàng năm, bao gồm hai đỉnh tháng 5-6
và đỉnh tháng 9, trong đó đỉnh tháng 5-6 thường là cực trị chính. Nhiệt độ nóng nhất
ghi nhận được là 30,6
o
C (tháng 5 năm 2006). Mùa khô kéo dài từ tháng 10 đến
tháng 3 năm sau tương ứng với thời kỳ rét và khô, lượng mưa không đáng kể, nhiệt
độ nước giảm thấp vào tháng 1 đến tháng 3 hàng năm, nhiệt độ thấp nhất ghi nhận
được vào tháng 1 năm 2006 là 23,6
o
C.
Lượng mưa cao nhất thường xảy ra vào tháng 10, 11. Lượng mưa cao nhất