Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Lời cảm ơn
Trớc hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân
tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên trong
phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực
phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều
kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật.
1
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Lời mở đầu
Viện Di truyền nông nghiệp đợc thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của
Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện
nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Chức năng chính của Viện là :
-Nghiên cứu, ứng dúng các phơng pháp di truyền học hiện đại và công nghệ
sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống
chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trờng.
-Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lơng thực-
thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền
vững và bảo vệ môi trờng.
-Tăng cờng hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di truyền
và Công nghệ sinh học.
Để thực hiện đợc các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị
nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 ngời trong đó có 3
tiến sĩ , 6 phó giáo s, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ.
Trong những năm qua, Viện đã đạt đợc rất nhiều thành tựu, đã thực hiện và
chủ trì 18 đề tài nhà nớc, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo đợc nhiều
giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các quy trình
tiến bộ kỹ thuật đợc công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án hợp tác
quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO... Nhờ các thành tự trên mà Viện đã nhận đợc

Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thờng gây bệnh bằng cách can thiệp vào
quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, các
chất điều hoà sinh trởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc với cây
chủ, hoặc hấp thụ dinh dỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng của
3
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và phát triển,
sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tất yếu là
làm tắc nghẽn đờng vận chuyển lên xuống của nớc và của đờng. Ngoài ra, các yếu
tố môi trờng cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ngỡng chống
chịu của cây.
Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng đợc phân nhóm theo rất nhiều
tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bị
bệnh ... Hiện nay, phổ biến nhất là ngời ta phân loại bệnh cây dựa vào loại tác
nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm 2 loại: bệnh gây
ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo tiêu
chuẩn này, ta có thể chỉ ra đợc nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển và cách
lan truyền bệnh từ đó suy ra đợc biện pháp phòng trừ bệnh
4
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật
I. Khái niệm chung:
Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi
cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trờng dinh
dỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm:
- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật nh mẩu lá, mẩu rễ, một
đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả...
- Nuôi cấy phôi non (phôi cha phân hoá hoàn toàn), phôi trởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

nguồn cacbon hữu cơ, thờng là đờng mía saccaroza (trong một số trờng hợp
còn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza...).
Ngoài ra, manitol, sorbitol đợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù
và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu.
4. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng
tổng hợp vitamin nhng lợng tổng hợp đợc không đủ nên phải bổ sung
vitamin ngoại sinh vào môi trờng cấy. Vitamin thờng dùng là nhóm B dễ
hoà tan vào trong nớc nh B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
....với hàm lợng từ một đến
một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúc
tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi trờng
nuôi cấy.
*Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (cha đợc xếp vào
vitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có
tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, đợc sử dụng với l-
ợng lớn ~ 100 mg/l.
6
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
5. Chất điều khiển sinh trởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi
trờng nuôi cấy, giúp điều khiển đợc quá trình phân hoá và phản phân hoá
tế bào, thể hiện đợc tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào và mô

nấm men, hợp chất cazein, pepton....để gia tăng các chất dinh dỡng,
các chất có hoạt tính điều khiển sinh trởng và sự phát triển của mẫu
cấy.
7
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
6. Chất làm đông cứng môi trờng: Là giá thể cho mẫu cấy. Thờng
dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với
nớc khi ở nhiệt độ lớn hơn 80
0
C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ
hơn 40
0
C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nớc cao, chỉ cần
6-12 g có thể làm đông đặc 1l nớc và khi ở trạng thái rắn thì tế bào và
mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu đợc các chất dinh dỡng từ môi trờng.
III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:
Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành
công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt đợc khi nó trải qua 5 bớc sau:
Bớc 0: Bớc chuẩn bị
Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:
- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần.
- Có khả năng sinh trởng và phát triển tốt.
- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus.
- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các
cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối u về điều kiện chăm
sóc, dinh dỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.
Bớc 1: Nuôi cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thờng sử
dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ
thuộc từng đối tợng nuôi cấy ngời ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy nh mẩu

tuỳ từng đối tợng nuôi cấy, ngời ta có thể đạt đợc hệ số nhân cao bằng việc kích
thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách
hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Bớc 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt đợc một kích thớc nhất định, các chồi đợc chuyển từ môi trờng trong
bớc 2 vào môi trờng tạo rễ. Thờng sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất
hiện rễ. ở giai đoạn này, ngời ta bổ sung vào môi trờng các auxin vì auxin là nhóm
hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở
một số loài nh chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt đợc trong môi
trờng không có chất điều hoà sinh trởng.
Bớc 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
9
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Giai đoạn đa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bớc cuối cùng của quy
trình nuôi cấy mô tế bào.
Cây lấy ra ống nghiệm phải đợc rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm
nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ
thành công hơn nếu trớc khi đa cây con ra đất ta ơm cây trên cát có độ ẩm 90% từ
10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đợcc sinh ra và bắt đầu
hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thờng.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế
bào.Đó là:
- Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra
hiện tợng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí,
sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận đợc ở ngay giai đoạn
invitro hoặc giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều
khiển và phát triển hình thái, giảm lợng chất điều khiển sinh trởng sử
dụng, từ đó giảm đợc ảnh hởng của chúng. Đồng thời, phải hạn chế

- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống.
- Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có
giá trị kinh tế cao.
- Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh.
Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phơng
pháp nuôi cấy in vitro đợc quan tâm hơn cả. Ngời ta ớc tính có khoảng 300 loại
cây có thể đợc nhân giống bằng phơng pháp này. Lợi ích của nó là ở chỗ: có thể
tạo ra một quần thể cây con với số lợng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ,
đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trởng tốt và cho năng suất
cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể trao đổi
quốc tế nguồn gen và lu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro. Chính nhờ kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào, ngời ta có thể tạo ra đợc hệ số nhân giống cao, sớm phát huy đợc
hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng
11
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
khắc phục đợc những điều kiện bất lợi. Phơng pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với
những loại cây khó nhân giống bằng con đờng hữu tính, các giống quý hiếm có số
lợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh.
ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nớc đã đợc
thành lập và cho đến nay đã thu đợc một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-
Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống
in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu nh lúa, thuốc lá, khoai
lang, dứa sợi... Tại trờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trình
nhân giống khoai tây chất lợng cao, bớc đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phía Nam
đã xây dựng đợc ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quy trình
nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào trong
cả nớc đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây ăn quả,
cây rừng, cây quý hiếm...có giá trị cao.
Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay đợc đa vào trong các chơng
trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinh học

1.Tình hình bệnh hại trên giống cây trồng thực vật ở Việt Nam.
Để đảm bảo an ninh lơng thực đồng thời phát triển nhanh nền kinh tế, trong
những năm gần đây Việt Nam đã nhập nhiều giống cây trồng và hoa cây cảnh từ
nhiều quốc gia trên thế giới. Điều này luôn kèm theo các nguy cơ xân nhập của vi
sinh vật gây hại, đặc biệt là các bệnh hại thực vật thuộc diện KDTV ở Việt Nam.
Trên thế giới cũng nh ở Việt Nam, bệnh hai thực vật gây nên những thiệt hại
vô cùng to lớn và chúng đang làm ảnh hởng đáng kể đến chất lợng sản phẩm cũng
nh năng suất cây trồng. Đặc biệt là bệnh hại do virus gây ra: Virus PVY là virus
gây bệnh thối củ khoai tây, làm giảm năng suất củ tới 80%, nó cũng gây thiệt hại
đáng kể trên cây cà chua, ớt, thuốc lá. Khi thuốc lá bị nhiễm virus này thì năng
suất giảm tới 30%. Trong lĩnh vực hoa cây cảnh còn trầm trọng hơn. Việc áp dụng
những thành tựu khoa học kỹ thuật của CNSH, đặc biệt là sinh học phân tử và
Miễn dịch liên kết gắn enzim vào sản xuất là rất cần thiết nhằm tăng năng suất cây
trồng, chẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân hại cây trồng, đáp ứng đợc đòi hỏi
cấp bách của KDTV.
Một số tác nhân gây bệnh thờng thấy trên cà chua, khoai tây, thuốc lá.
1.1Virus khảm da chuột Cucumber Mosaic Viruses (CMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và biến dạng lá khác nhau, điển hình
nhất là dạng biến dạng hình kim, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong
sản xuất cà chua và thuốc lá. Virus này đợc lan truyền qua Aphis gossyphii.
Nó thuộc nhóm Cucumovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Xuất hiện dịch
bệnh không có quy luật báo trớc.
1.2 Virus khảm thuốc lá - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và phồng lá khác nhau, điển hình nhất là
dạng khảm san hô gây nên những thiệt hại nghêim trọng trong sản xuất cà
chua, gây ảnh hởng đến chất lợng thuốc lá. Virus này đợc lan truyền bằng
14