Phần I
Mở đầu
I. Đặt vấn đề
Trong khi sự an toàn của con ngời đối với thực phẩm biến đổi gen vẫn còn
cha đợc khẳng định chắc chắn thì việc nghiên cứu hệ thống chuyển gen hiệu quả
cho các loài hoa cây cảnh từ đó chuyển đợc các gen mong muốn tạo ra các đặc
tính mới lạ (mầu sắc, cấu trúc hoa, hơng thơm, tuổi thọ của hoa cắm, các đặc
tính kháng sâu và bệnh hại, chống chịu với điều kiện bất thuận) luôn là mong
muốn của các nhà chọn tạo giống.
Lilium thuộc họ liliaceae, có khoảng 85 loài phân bố chủ yếu ở các vùng
ôn đới và cận nhiệt đới thuộc phía bắc bán cầu lily là một trong các loài hoa đẹp
đang rất đợc a chuộng trên thị trờng hoa hiện nay. Với kiểu dáng đẹp sang trọng,
một số chủng loại có hơng thơm quyến rũ và độ bền hoa rất cao (9-15 ngày), dễ
thu hoạch, bảo quản trên thế giới lilium cùng với tulip, freesia là ba loại hoa
dang thân củ chủ yếu, quan trọng trong ngành hoa thơng mại, chiếm 24% giá trị
sản phẩm hoa thơng mại (Robinson và Pizarobady, 1993) ở Việt Nam hiện nay,
hoa lily đã đợc trồng thành công ở nhiều tỉnh ở nớc ta nh Lâm Đồng, Hà Nội và
hầu hết các tỉnh miền Bắc và hiệu quả kinh tế rất cao, có thể xuất khẩu quy mô
lớn. Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, ma nhiều của nơc ta đã tạo điều kiện
rất thuận lợi cho các loài cỏ dại phát triển đây là một trong những yếu tố hạn chế
chủ yếu đến sản xuất hoa lily. Chính cỏ dại làm cho giảm năng xuất, phẩm chất,
đặc biệt nó cạnh tranh dinh dỡng với cây. để có thể trừ bỏ cỏ thì cần tốn nhiều
công lao động, để giảm bớt công lao động con ngời đã phải dùng đến các loại
thuốc trừ cỏ nhng chính điều này đã gây ảnh hởng không nhỏ đến cây hoa lily.
Để có thể vừa trừ đợc cỏ mà lại không gây ảnh hởng đến cây thì việc nghiên cứu
chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ PPT vào cây hoa lily là đòi hỏi của sản xuất ,
xuất
Hoa lily thuộc Liliaceae là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị trên
thị trờng hiện nay. Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gem vào cây lily
đã đợc thực hiện bởi các phơng pháp chuyển gen trực tiếp nh bắn gen (Nishihara
và cộng sự, 1993; Sanford và cộng sự ; 1993 ; Wilmink và cộng sự, 1995 ;

1. Xây dựng hệ thống tái sinh hoàn chỉnh cho cây lily
2. Xác định ngỡng gây chết của PPT đối với mẫu vảy củ, lát cắt thân và
đỉnh sinh trởng của cây hoa lily.
3. Bớc đầu thử nghiệm chuyển gen bar - kháng thuốc trừ cỏ vào cây hoa
lily thông qua vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens.
2
Phần II
Tổng quan tài liệu
2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lily
2.1.1 Nguồn gốc
Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên,
California (Mỹ) và một số nơi khác.
2.1.2 Vị trí phân loại thực vật
Trong hệ thống phân loại thực vật cây hoa lily đợc xếp vào nhóm cây một
lá mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành
(liliaceae), chi lilium (theo Dơng Đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978).
Cây hoa lily là cây thân thảo, thân dạng hành có vảy. Thân thờng mọc đơn
có lá. Lá luôn có hình mũi mác hay hình vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung
quanh thân. Hoa lỡng tính, kích thớc lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn, có rất nhiêu
màu sắc khác nhau. Hoa có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao
hoa 6 mảnh dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, đầu nhụy hình đầu, chia 5 thùy. Quả
nang có 3 góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt.
2.1.3. Giống .
2.1.3.1 - Các nhóm giống trồng trọt
Công tác tạo giống, cải tiến giống hoa lyli đợc thực hiện trên 100 năm nay
do đó nên giống rất phong phú. Trên thị trờng và trong trồng trọt thờng thấy 3
nhóm: dòng lyli thơm, dòng á châu lai, dòng lyli phơng đông lai.
a. Dòng lyli thơm lai (the longi florum hybrids)
Gồm các giống đợc sinh ra từ lyli thơm và lyli Đài Loanvà các giống tạp
giao của chúng, cây cao tứ 120 - 140cm, một số có thể đến 200cm, lá hẹp dài

hoa lớn nhất đờng kính từ 15-20 cm, nụ đa số mọc thẳng rất ít nằm ngang. Hoa
có hình cái bát hoặc hình sao, màu sắc hoa rất phong phú mầu đỏ, phấn hồng, và
màu sắc trắng là chính, hoa có mùi thơm nồng. từ khi trồng đến khi ra hoa 12-20
tuần thay đổi tuỳ theo giống và thời vụ. tính khác nhau và thời tính vụ thu hoạch
cũng ảnh hởng lớn tới thời gian sử lý lạnh phải ngủ nói chung khoảng 4-8 tuần.
các giống trong nớc thờng thấy là: stargazer(sao hoàng tộc), giống nguyên
soái(Acafulco), Sorbonne, Merostar, Siberiamaqssa, starfighter, và tiber
hiện nay trên thế giới đang mở rộng diện trong các giống dòng lai thơm và lai á
châu (L/A)và dòng lai thơm với phơng đông (L/O) để dung hoà u điểm của hai
giống
4
2.1.3.2- Các giống trồng trọt chủ yếu
a-Dòng lai loa kèn thơm
Avito: trồng vào vụ đông xuân cây có thể cao 120cm, thân cứng, lá dài hẹp, màu
xanh đậm, lá phía trên ngắn, thẳng lên trên hình dáng đẹp. Nụ to vừa dài 13-15
cm đẫy, mập nằm ngang hoặc chếch lêu trên.
Hoa hình loa kèn, mở to, đẹp mắt, cánh hoa xếp chặt, đầu cánh hơi cong ra
ngoài, màu trắng trang nhã, là loại hoa cắt tốt, tính chống chịu kém, nhiệt độ hơi
cao nụ teo lại, tỷ lệ bài dục cao, thời gian sinh trởng ngắn lại, cuống hoa ngắn.
SnowQueen cây cao 60-115 cm cây tơng đối cứng, lá dài hẹp, màu xanh đậm, lá
phía trên cuộn lại, nụ hoa dài 13-15 cm, nằm ngang hoặc hơi cong xuống, ngoại
hình đẹp, hoa nở miệng to, dáng đẹp, cánh hoa xếp tơng đối tha,cánh ngoài cuộn
ngợc lại cánh phía trong hơi cong, màu trắng là loại hoa cắt tơn đối đẹp. tính
chống chịu tơng đối yếu
White fox cây cao, trồng vào vụ đông thân cao tới 130 cm thân rất cứng lá dài
hẹp, màu xanh đậm hơi trúc xuống nụ tovừa 13-15 cm, nằm ngang hơi rủ xuống,
nụ to đẫy mập, ngoại hình đẹp,hoa hình loa kèn, miệng to, hình dáng đẹp, cánh
hoa xếp tớng đối khít cánh ngoài cánh trong đều cong ra ngoài màu trắng, đẹp, là
giống làm hoa cắt rất tốt, là giống rất đợc a chuộng , tính chịu nóng kém, nhiệt
độ caonụ hoa nhiều, tỷ lệ bài dục cao, phẩm chất hoa kém, giôngs này tơng đối

cành có một ít đốm nhỏ màu nâu, từ gốc cành kéo dài đến giữa cành có vết đốm
màu vàng cam . cánh hoa xếp tha, tách rời nhau, thời gian sinh trởng ngắn. ở
đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ đông xuân từ 10-14 tuần ra hoa không mẫn
cảm với ánh sáng yếu .
Pollyanna: quảng đông thờng gọi là ly ly vàng. dáng cây dáng hoa màu sắc hoa
rất giống Cordelia nhng có rất nhiều tính trạng hơn cordelia là một giống trong
dòng lai châu á màu vàng đợc a chuộng nhất, có diện tích trồng lớn nhát. giống
này sinh trởng khoẻ cây cao đến 120 cm lá xanh tơi hơi hớng lên trên. nụ tơng
đối to , ít nhánh thứ hai chống bệnh cháy lá và bệnh muội tro mạnh. thời gian
sinh trởng tơng đối ngắn. ở vùng đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ đông xuân.
sau 10-12 tuần ra hoa có sức chịu nóng nhất định.
Elite: cây có thế sinh trởng khoẻ, cao 110-120 cm , thân cành cứng, lá dài, hình
kim, màu xanh tối, mọc ngang, nụ màu cam, dài 8-10 cm, không có cuống cấp
hai. hoa hình cốc nông, hình sao, tơng đối to, cánh hoa tơng đối dày, xếp khít
nhau, cánh hoa màu đỏ cam, ở gốc có một ít đốm đen nhỏ thời gian sinh trởng
ngắn. ở đồng bằng chu Giang trồng vào vụ đông xuân sau 10-13 tuần ra hoa.
giống này ở vùng ấm và nnơi không khí bị ô nhiễm bệnh mụi tro rất nặng, có thể
dẫn đến huỷ diệt. rất mẫn cảm với ánh sáng yếu.
Brunello: cây sinh trởng khoẻ, cao 110 cm thân to cứng, lá dài hình kím sẻ màu
xanh đậm, bóng. nụ dài và to màu cam, dài 8,5-11 cm có nhánh cấp hai. hoa hình
sao to, cánh dày phía ngọn hơi cong, xếp khít nhau, cánh màu đỏ quýt sáng, đều,
6
không có đốm, vệt. thời gian sính trởng ngắn, ở vùng đồng bằng Chu Giang gieo
trồng vào vụ đông xuân sau 9-11 tuần ra hoa, dòng màu cam của giống này có
tính chống chịu mạnh không mẫn cảm với ánh sáng yếu là giống tốt. cảm nhiễm
bệnh muội tro nhẹ.
dòng lai á châu, ngoài các giống màu vàng, màu camcòn có màu đỏ, màu phấn
hồng, màu trắng và nhiều màu nh giống: Amarono, Phanro nhng ở trung quốc ít
thấy .
c- Dòng lai phơng đông.

nên gọi là thân vẩy trần (không vỏ, thân vẩy là củ giống để trồng.)
Bộ phận trên mặt đất là thân, lá ,và hoa,quả, là phần thơng phẩm của lyli. Rễ lyli
có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay trên củ
giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng. Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ và thân
trên mặt đất gọi là rễ thân. Đa số giống sản xuất những thân vẩy( củ) mọc ra từ
rễ này làm thực liệu để nhân giống.
Lá lyli thờng mọc chéo nhau , hình dài, hình trứngkhông có cuống hoặc
cuống rất ngắn, một số ít giống ở nách lá có mầm, có thể dùng nhân giống.
Hoa lyli to mọc riêng rẽ mọc thành chùm hoặc thành cụm trên đỉnh ngọn
thân.Mỗi củ chỉ có một cành hoa, mầm thân của lyli bị rụng đi, hoặc sau khi
ngắt ngọn không thể mọc ra thân mới, cũngkhông thể hình thành cành hoa khác.
Nếu muốn cắt hoa thì không đợc bấm ngọn, hoa có hình loa kèn, hình phễu, hình
sao, hình cái chén nông. Màu sắc hoa rất phong phú, đẹp có màu trắng, màu
vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu đỏ, màu tím và nhiều màu. Màu cánh
thờng là đơn sắc, hoặc có đốm màu nâu, màu tím một số ít có hơng thơm.
Cánh hoa sáu cái, hai vòng, mỗi vòng ba cái, nhị đực sáu cái, vòi nhỏ dài, túi
phấn to có màu tím, ,màu vàng ở giữa có trục hoa nhỏ đầu phình to.
lạnh càng dài thì ra hoa càng sớm.(bản dịch hoa lily)
2.1.5 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng.
Loa kèn có hoa to màu sắc phong phú, hơng thơm - là loại hoa đợc thế giới
a thích, lả loại hoa có lợng lu thông lớn trên thị trờng thế giới, sản lợng đứng
hàng thứ 4 thứ 5 của hoa cắt.
Loa kèn tợng trng cho sự tốt lành, đoàn kết, mỹ mãn nên càng đợc ngời
Trung Quốc a chuộng và trở thành loại hoa phát triển mạnh, sản lợng và giá trị
ngày càng cao.(bản dịch hoa lily)
Hoa tơi là một sản phẩm hàng hóa đặc biệt của ngành Nông Nghiệp. Hiện
nay trồng hoa đã trở thành một ngành sản xuất phát triển khắp thế giới. Trong đó
8
hoa loa kèn đóng góp một phần không nhỏ. Với u thế rất phong phú về hình
dạng, màu sắc, hơng thơm. Hoa loa ken có giá trị kinh tế cao trong sản xuất lẫn

9
học. Trong đó, 2 phơng pháp đầu tỏ ra hữu hiệu hơn cả. Vào năm 1983, cây biến nạp
gen đầu tiên ra đời đó là cây thuốc lá kháng kháng sinh. Năm 1985, một số cây chuyển
gen kháng sâu, bệnh virus và bệnh nấm lần lầu tiên đợc đa ra thử nghiệm ngoài đồng
ruộng.
Đến nay, sự biến nạp gen vào cây trồng không còn là vấn đề phải tranh cãi nữa
mà đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen
đợc chuyển vào cây trồng và ít nhất khoảng 400 loài đã đợc kiểm tra ngoài đồng
ruộng. Đối với các loài cây rau, chuyển gen đã thành công ở cà chua, cà rốt, khoai tây,
rau diếp, cần tây, súp lơ, da chuột, dâu tây, cải xanh, cải bắp, măng tây, ở các cây
trồng ngũ cốc nh lúa nớc, lúa mạch, lúa mỳ, ngô và cả những cây công nghiệp nh cây
bông việc nghiên cứu chuyển gen cũng đã thu đợc nhiều kết quả khả quan [1].
Những cây trồng đợc chuyển gen vẫn giống cây trồng truyền thống nhng chúng
có thêm một số đặc điểm đợc cải thiện. Vì vậy ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
nhằm cải tạo giống cây trồng đã đem lại nhiều lợi ích rõ rệt trong phát triển sản xuất
nông nghiệp và phục vụ đời sống con ngời. Có thể điểm những lợi ích đó nh:
- Tăng sản lợng
- Giảm chi phí sản xuất
- Tăng lợi nhuận nông nghiệp
- Cải thiện môi trờng
Ngày nay, các nhà khoa học đang hớng tới tạo những cây chuyển gen thế hệ thứ
2 có đặc điểm tăng giá trị dinh dỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công
nghiệp chế biến. Những lợi ích này hớng trực tiếp hơn vào ngời tiêu dùng nh:
- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt
- Khoai tây tăng hàm lợng tinh bột
- Vacxin ăn đợc ở ngô và khoai tây
- Những giống ngô trồng đợc trong điều kiện nghèo dinh dỡng
- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành và cải dầu [no1]
2.2.2. Những thành tựu chuyển gen ở thực vật trên thế giới và trong nớc
Trên thế giới, diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 11

khả năng chống chịu sâu đục thân rất tốt.
- Chống chịu các bệnh nấm
Đang phân lập gen 1,3-glucanase (mã hóa enzym phân hủy thành tế bào của các
mầm bệnh nấm) từ thực vật kháng bệnh để chuyển vào các loài mẫn cảm.
- Thay đổi thành các axit béo
11
Ngời ta làm tăng hàm lợng axit béo đơn không bão hòa và các thành phần dầu
thực vật. Cây đậu tơng chuyển gen axit oleic có hàm lợng axit oleic cao, một axit béo
có một liên kết không no. Theo các nhà dinh dỡng thì chất béo không no đợc xem là tốt
hơn so với chất béo no, đợc tìm thấy ở thịt bò, lợn, phomat và một số thức ăn thờng
ngày khác.
Cải dầu chuyển gen có hàm lợng Laurate cao, đợc dùng trong công nghiệp thực
phẩm để làm lớp phủ ngoài kẹo chocolate, bánh ngọt, lớp kem, bơ. Đợc trồng ở Canada
và Mỹ. Cải dầu có hàm lợng axit oleic cao đợc trồng ở Canada.
- Làm chậm chín quả ở cà chua
Cây cà chua mang một gen chuyển làm chậm quá trình làm mềm quả tự nhiên
khi quả chín. Đây là loại thực phẩm chuyển gen đầu tiê n đợc sản xuất ở các nớc phát
triển. Giống cà chua này có thời gian lu trên giá bán hàng dài hơn.
Ngoài ra giống chuyển gen có các đặc tính nh:
- Điều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột để làm chủ mức tinh bột trong sản phẩm.
- Cải thiện chất lợng đạm tích lũy trong hạt.
- Tăng hàm lợng vitamin A trong hạt gạo.
ở nớc ta, một số phòng thí nghiệm lớn đã và đang đi sâu vào công tác cải thiện
giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen. Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ Sinh học, các bớc cơ bản trong giai đoạn chuẩn bị đã đợc thực hiện. Đó là:
(1) Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị nh gen CryIA(b), CryIA(c), gen ức chế
tryspin để trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi khuẩn, gen chịu lạnh, gen protein giàu
tryptopha; (2) Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ
thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trực tiếp
bằng súng bắn gen. Đến nay, nhiều dòng lúa chuyển gen Xa21, CryIA(c), đu đủ

Tóm tắt
Hệ thống tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium cho cây
Oriental hybrid lily Lilium cv. Acapulco đã đợc nghiên cứu. Callus xuất phát từ
ống phấn đợc đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium dòng EHA101/plG 121
Hm, chứa véc tơ mang các gen nptH,
hyg
r+
, uidA trong vùng T-DNA. Đã thu
đợc 6 dòng kháng hyg từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thơng callus với giấy
ráp (sandpaper) trớc khi đồng nuôi cấy, callus đợc đồng nuôi cấy trên môi trờng
MS không có NH
4
NO
3
, sử dụng Hyg trong môi trờng chọn lọc. Các dòng tái sinh
kháng hyg tạo chồi sau đó phát triển thành cây khi chuyển sang môi trờng MS
không bổ sung chất điều tiết sinh trởng. Tất cả các cây đợc kết luận chuyển gen
nhờ GUS histochemical assay và phân tích inverse PCR.
2.3.3 Sakae SUZUKI anh Masaru NAKANO, 2002, Agrobacterium-
Mediated transformation in Liliaceous ornamental plant. JARQ 36(3), 119-
127(2002) http://www.jircas.affrc.go.jp
13
Tóm tắt
Đã nghiên cứu chuyển gen cho 3 giống cây thuộc họ Liliace, Lilium
formosanum, Agrobacterium đã đợc sử dụng, cả ba dòng đuểu cha binary vector
mang gen nptII, hpt và gus trong vùng T-DNA. Với Lilium formosanum, không
thu đợc mô hoặc cây chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn
Agrobacterium mặc dù có sự biểu hiện tạm của gen gus trong callus trong quá
trình đồng nuôi cấy. Tuy nhiên, đã thu đợc một số cụm tế bào có khả năng kháng
hygromycin của giống Agapanthus praecox ssp. Orientalis và Muscarri

cứu chuyển gen đã đợc thực hiện bằng sử dụng thiết bị bắn gen Finertype
bombardment trên callus có 3 hoặc 10 tháng đợc duy trì trong môi trờng lỏng ở
điều kiện bóng tối. Các hạt vàng đợc bọc bới plasmid pUBQ3 gen GUS bao gồm
gen uidA đợc điều khiển bởi UBQ3 promoter. Thí nghiệm đợc lặp lại 3 lần mỗi
lần một đĩa, 10000 đến 15000 điểm biểu hiện của gen gus. Callus nuôi cấy trên
môi trờng lỏng cho phép thu đợc cây chuyển gen bền vững cao hơn từ 50-70 lần
so với môi trờng đăc. Đã tái sinh đợc 81.6+3.7 cây/ 1g callus tơi từ callus nuôi
cấy trong môi trờng lỏng lắc có chiếu sáng. ở đầu giai đoạn tái sinh có sự hình
thành phôi soma ở mức độ cao. Kanamycin có hiệu quả chọn lọc tốt hơn so với
bialaphos. Đã thu đợc 10 cây chuyển gen bền vững của Lilium longiflorum
Thumb. cn. Snow Queen. Gần đây nhất, các tác giả đã sản xuất đợc hàng trăm
cây chuyển gen khác nhau sử dụng pCAMBIA2301 bao gồm gen rol B dới sự
điều khiển của Lat 52 promoter để chống lại sự phát triển của phấn hoa. Gen gus
đã đợc biểu hiện rất mạnh trong các cây chuyển gen. Các phân tích về gen của
những cây này đang đợc tiến hành.
2.4 kỹ thuật chuyển gen vào thực vật.
2.4.1 khái niệm về chuyển gen
kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đa một hay nhiều gen lạ đã đợc thiết kế ở
dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ ở cây trồng nói riêng và ở các vi sinh vật nói
chung (vi sinh vật, động vật) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng Plasmid tái tổ
hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động
tổng hợp nên các protein đặc trng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ
thể chuyển gen.
2.4.2 Sự tái sinh cơ thể thực vật cơ sở thành công của chuyển gen
2.4.2.1 Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh của thực vật
a, Tính toàn năng của tế bào.
Haberlandt (1902), lần đầu tên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiêm tàng để phát triển thành một cơ
thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã
phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó.

một chơng trình đã đợc mã hóa trong cấu trúc của một tế bào khiến quá trình
sinh trởng phát triển của cơ thể thực vật luôn đợc hài hòa.
16
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối cơ thể thờng bị ức chế bở các tế
bào xung quanh khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thớc của khối mô sẽ
tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất
là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. kỹ thuật nuôi cấy
mô tế bào cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi nuôi cấy tác rời trong điều kiện vô trùng) một cách định hớng dựa
vào sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào
thực vật. Điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngời ta thờng bổ
xung vào môi trờng nuôi cấy cả hai nhóm chất điều tiết sinh trởng thực vật là
auxin và cytokinin.
Tùy theo mục đích nghiên cứu đặt ra nh tạo mô sẹo, tạo chồi phụ, tạo rễ,
tạo phôi vô tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy mà môi trờng thích
hợp là cần thiết nhất (Bajaj và cộng sự, 1975).
2.4.2.2 Vai trò của việc xây dựng hệ thống tái sinh.
Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì những đối tợng thờng
đợc sử dụng để chuyển gen là: Mô lá, mô thân, mô callus hay những tế bào tách
rời những vật liệu này sau khi đã đợc biến nạp thành công, các tế bào đã dung
nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho các tế bào này tái sinh đợc
thành cây hoàn chỉnh bằng cách đặt nó vào môi trờng tái sinh phù hợp. Nếu nh,
sự tái sinh này thành cây hoàn chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu
đã đợc biến nạp đó sẽ trở nên vô nghĩa. Chính vì vậy sự thành công của kỹ thuật
chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế bào. do vây, việc lựa chọn và điều
chỉnh môi trờng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đóng vai trò hết sức quan trọng,
mang tính quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí nghiên biến nạp,
bên cạnh đó, vấn đề sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục
tiêu nghiên cứu không kém phần quan trọng (potrykus, 1991).

2.4.1 Chuyển gen bằng PEG (pholyethylene glycol).
PEG là chất có ái lực lớn với nớc. Ơ nồng độ cao, PEG là cho DNA không còn ở
trạng thái hòa tan mà kết dính vào màng nguyên sinh của tế bào sau đó bị tế bào
nuốt theo cơ chế của Amip. Có nhiều chất có ái lực lớn nh PEG nhng PEG là
chất ít gây độc cho tế bào nhất nên đợc sử dụng phổ biến.
Chyển gen qua PEG là một phơng pháp thực hiện khá đơn giản mà lại hiệu quả
cao. Trong cùng một thí nghiệm ta có thể xử lý một lợng khá lớn tế bào, có thể
thu đợc hàng nghìn cá thể chuyển gen riêng biệt. Hơn nữa lại không có những
18
hạn chế về dãy vật chủ nên đợc sử dụng phổ biến để nghiên cứu các cơ chế điều
hòa sự biểu hiện gen.
Nồng độ ion Mg++ hoặc Ca++ trong hỗn hợp ủ, trọng lợng phân tử và nồng độ
PEG là những thông số quan trọng nhất tác động đến hiệu quả của phơng pháp
này.
2.4.2 Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm (Micro injection).
Qua kính hiển vi, DNA plasmid có thể đợc tiêm vào tế bào vi sinh vật và
protoplast đối với tế bào thực vật dới áp lực cao để tiến hành chuyển gen. Ngời ta
đã thực hiện chuyển gen thành công ở khá nhiều đối tợng thực vật, vi sinh vật
cũng nh động vật bằng phơng pháp này.
Tuy nhiên, phơng pháp này ít đợc sử dụng ở phòng thí nghiệm vì thao tác
vi tiêm dới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác cực nhạy, rất đắt tiền. Sự thành
công phụ thuộc nhiều vào sự khéo tay và kiên nhẫn của ngời thao tác.
2.4.3 Chuyển gen bàng xung điện:
Phơng pháp này sử dụng những xung điện ngắn trong một điện trờng cực
mạnh để tạo một lỗ thủng tạm thời trên màng tế bào làm tăng khả năng xâm
nhập của DNA vào tế bào.
Protoplast hoặc các tế nguyên vẹn đợc đặt giữa hai tấm kim loại cách nhau
1-4 mm trong một cuvette bằng nhựa. ơ điện thế cao, xung điện tạo các lỗ tạm
thờ (cỡ 30 nm) trên màng protoplast và DNA bên ngoài có thể xâm nhập vào bên
trong tế bào.

- Công việc chuẩn bị vật liệu tốn nhiều thờ gian.
- Thiết bị đăt tiền.
2.4.5 Chuyển gen qua trung gian là các virus vector:
Do virus có kích thớc nhỏ, cấu trúc đơn giản chỉ gồm vỏ protein và lõi
DNA hoặc RNA lại có khả năng xâm nhiễm tự nhiên vào các vật chủ nên ngời ta
đã nghĩ đến việc sử dụng chúng làm vector chuyển gen.
Có hai loại virus thờng đợc sử dụng làm vector chuyển gen là:
- Gemini virus: có phổ ký chủ động (có cả cây hòa thảo)
- Caulimosaic virus: virus hại cây họ cải, có khả năng tải và chuyển gen tốt,
có promotor mạnh.
20
Tuy nhiên phơng pháp này vẫn còn ít đợc sử dụng do những gen đợc chuyển
nhờ virus không di truyền qua hạt nên không di truyền cho các thế hệ sau đ-
ợc. Muốn di truyền đợc cho các thế hệ sau phải tiến hành nhân vô tính nên
không phải loại cây nào cũng thực hiện đợc. Mặt khác việc lựa chọn các
chủng virus phải thỏa mãn một số yêu cầu sau:
- Cấu trúc di truyền phải là DNA.
- Không có tính độc hoặc tính độc thấp.
- Khả năng tải lớn.
- Có phổ ký chủ rộng.
2.4.6 Phơng pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium.
Vi khuẩn Agrobacterium là một tác nhân chuyển gen rất hiệu quả trên đối
tợng thực vật. Có hai chủng đợc sử dụng phổ biến là:
- Agrobacterium tumefaciens: vectơ mang là Ti-plasmid.
- Agrobacterium rhizogens: vectơ mang là Ri-plasmid.
Trớc đây ngời ta cho rằng phơng pháp chuyển lạp gián tiếp này chỉ thực hiện
có hiệu quả đối với cây hai lá mầm vì trong tự nhiên các vi khuẩn này không
có khả năng gây bệnh ở cây một lá mầm. Tuy nhiên, gần đây nhiều nhà khoa
học đã tiến hành chuyển gen thành công trên đối tợng cây một lá mầm nh:
lúa, ngô nhờ Agrobacterium. Chính vì vậy phơng pháp này đợc sử dụng khá

pháp khá đơn giản.
2.5.2 Các hớng chính tạo cây chuyển gen:
Tạo cây chống chịu bệnh virus nhờ chuyển gen:
Bệnh virus là bệnh không chữa đợc và gây tổn hại lớn đến năng suất cũng nh
chất lợng của cây trồng. Do đó hớng nghiên cứu này rất quan trọng.
Đa số virus hại cây có cấu trúc gồm một vỏ bọc protêin và phần lõi là axit
nucleic (AND, ARN). Gen mã hóa cho protein vỏ đợc gọi là các gen CP (Coat
protein genes). Giáo s Beachy ở viện nghiên cứu SCRIPP tại Sandiego (My)
là ngời đầu tiên nhận thấy nếu chuyển gen CP vào bộ gen của cây thì cây trở
lên kháng hoàn toàn với loại virus tơng ứng. Cơ chế của hiện tợng này còn
cha đợc sáng tỏ tuy nhiên ngời ta đã giả định sự d thừa protein vỏ virus nh tín
hiệu ngừng tổng hợp phần tổng hợp axit nucleic của virus. Chính vì thế khi có
mặt sẵn protein vỏ do gen CP sản sinh, virus mới xâm nhiễm sẽ không thể
nhân lên đợc. Lợi dụng tính chất này ngời ta đã tiến hành chuyển gen mã hóa
quá trình tổng hợp protein vỏ virus vào cây để giúp cây chống chịu bệnh
virus. Hớng chuyển gen này rất thành công đối với cây họ cà: thuốc lá. khoai
tây, cà chua, đu đủ.
Tạo cây kháng sâu:
22
Sâu là một tác nhân gây hại rất lớn cho ngành nông nghiệp. Hàng năm một l-
ợng lớn thuốc trừ sâu hóa học đã đợc sử dụng để hạn chế các dịch hại cây
trồng. Nhng biện pháp này có hại cho sức khỏe con ngời và ô nhiễm môi tr-
ờng nên cần thay thế bằng một phơng pháp khác an toàn hơn.
Từ đầu thế kỷ 20 đã phát hiện vi khuẩn đất Bacillus thuringens có khả
năng tổng hợp độc tố có bản chất protein gọi là Bt toxin, chất này có khả
năng diệt sâu non của côn trùng mà không ảnh hởng đến động vật có xơng
sống (Nguyễn văn Uyển, 1997) [10]. Các protein độc tố thờng ở dạng tinh thể
protein hình quả trám gọi tắt là Cry. Hiện nay đã phát hiện đợc trên 50 loại từ
CryI đến CryIX. Các Cry khác nhau có cơ chế gây hại khác nhau. Theo thống
kê cho thấy 525 loài sâu thuộc 13 bộ côn trùng có thể bị nhiễm bệnh do B.

trò vừa nh một gen chọn lọc vừa nh một gen hữu dụng tạo đồng thời tính
kháng thuốc trừ cỏ cho cây.
Thuốc trừ cỏ tác động lên sự quang hợp của cây bằng cách ức chế enzim
quang hợp, làm ngừng trệ quá trình quang hợp làm cho cây bị chết. Hiện nay
thuốc trừ cỏ phổ biến, có hiệu có hiệu quả cao, không độc với môi trờng là
chất Glyphosat: chất này tác động lên enzim biến đổi sản phẩm thứ cấp của
quang hợp Enolpyruvat sikimat phosphat synthetaza (EPSPS). Nếu enzim này
bị hỏng sẽ ảnh hởng đến sự tổng hợpc các hợp chất mạch vòng nh: axit
sikimic tiền chất để tạo axít amin mạch vòng, các chất kích thích sinh trởng
làm cho cây bị chết. Loại thuốc diệt cỏ này cũng có tác dụng tiêu diệt không
chọn lọc cho nên khi sử dụng các loại cây trồng cũng bị ảnh hởng. Hiện nay
đã phân lập gen mã hóa gen tổng hợp enzim EPSPS từ vi khuẩn Salmonella
typhimurium và Escherichia coli có hoạt tính tổng hợp rất cao chuyển vào cây
làm tăng hoạt tính của enzim lên trên 20 lần và cây chiệu đợc nồng độ thuốc
diệt cỏ cao hơn 4 lần (Monica A.Huges, 1995)[19].
Đây là hớng nghiên cứu hiện đang đợc nghiên cứu rộng rãi. theo thống kê
từ năm 1986 đến 1993 tổng cộng đã có 214 thử nghiệm chuyển gen kháng
thuốc trừ cỏ cho 5 loại cây điển hính sau: 16 thử nghiệm với khoai tây, 94 thử
nghiêm với cây có hạt chứa dầu, 29 với thuốc lá, 54 với ngô, 21 với cà chua
(Monica A.Huges, 1995)[19].
Chuyn gen to mu sc cho hoa: hoa l mt sn phm rt cú giỏ tr kinh
t v xut khu. Hoa c dựng trang trớ nờn rt cn cú s phong phỳ
a dng v mu sc. Tuy nhiờn hng nghiờn cu ny khỏ phc tp v
hin nay cũn cha tỡm hiu ht. Mt vi vớ d: chuyn gen tng hp sc t
xanh Delphinidium Daniella vo hoa hng to ra hoa hng cú mu xanh
da tri; chuyn gen tng hp sc t antocyan ca ngụ cho rt nhiu loi
hoa to ra nhiu mu sc khỏc nhau.
Chuyn gen tng hp cỏc protein ng vt vo thc vt: to protein ng
vt phi thụng qua chn nuụi tn kộm hn so vi chm súc cõy trng nờn
ngi ta ó chuyn gen mó húa cho vic tng hp cỏc protein ng vt

sau: A.tumefacients gây bệnh sần cây, A.rhizogenes gây bệnh rễ lông và
A.radiobacter không độc. Chúng có khả năng sâm nhập vào cây qua vết thương
và gắn một đoạn DNA của chúng vào bộ gen của tế bào thực vật, đây là những
gen mã hóa cho việc hình thành khối u và tổng hợp ra những chất dinh dưỡng
đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Người ta đã tìm thấy những axit amin lạ
25