T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

1
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase
KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
Bùi Th Lan Hương
1
, Nguyn Th Trưng
4
, Vũ Duy Thanh
2
,
Nguyn Th Kim Lý
2
, Nguyn c Doanh
2
, Phan T Phưng
2
,
Nguyn Hng Minh
3
, Lê Th Ánh Hng
2SUMMARY
Study of antifungal genetransformation on tomato
Tomato is a major vegetable crop that has tremendous popularity over the last century. It is grown
in almost every country of the world. Development of protocols for in vitro selection can provide
new advances for the production of stress tolerant cultivars.

còn to ra cây chuyn gen có kh năng kháng
bnh cao hơn vi ph rng hơn so vi nhng
cây trng ưc chuyn tng gen ơn l
(Jongedyk e và cs., 1995; Zu và cs., 1994;
Lawrence và cs., 2000).
Ni dung trình bày dưi ây là mt s
kt qu nghiên cu bưc u v chuyn gen
vào ging cà chua P375 thông qua chng vi
khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105
có cha plasmid pCAMBIA 1300 mang gen
kháng nm Chitinase (ngun tách t u
Pysium), ưc tin hành ti Phòng Bnh phân
t thc vt; Vin Di truyn N ông nghip.
Ghi chú:
1
Viện Môi trường ông nghiệp, Hà ội,
2
Viện Di truyền ông nghiệp,

3
Trường Đại học ông nghiệp Hà ội,
4
Trường Trung cấp ông nghiệp, Hà ội
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

2
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
- Các ging cà chua P375 ưc la

trong phòng ti trong 36, 48 và 60 gi. Sau
ó mu ly ra dùng vào bin np gen.
- Chuyn gen gián tip qua
Agrobacterium tumefaciens: Theo quy trình
ca Swapan K. Datta và cs., 1997.
- ánh giá hiu xut chuyn gen: Xác
nh s mu sng sót, s cây tái sinh thu
ưc, s cây tái sinh ưc chuyn gen.
- S liu thí nghim x lý bng phương
pháp Duncan's.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. ghiên cứu khả năng tái sinh của
giống cà chua
Nhng kt qu nghiên cu ca ca
các nhà khoa hc (Shahin và cs.,1986;
Chyi và Phillips, 1987; Mc. Cormick,
1991; Van Roekel và cs., 1993; Shen và
cs., 1998; Krasnyanski và cs., 2001) cho
thy, kh năng tái sinh ca cây cà chua
liên quan n kiu gen ca ging, b
phn s dng  nuôi cy, tui ca cây,
các t hp và nng  các cht kích thích
sinh trưng, iu kin nuôi cy v.v
Trong iu kin nuôi cy in vitro, s
“óng, m” và hot hoá gen vi mt cơ
ch còn chưa rõ hoc thích hp, hoc
không thích hp s dn n s tái sinh
cây vi t l cao hoc thp  các ging
cà chua khác nhau.
Trong thí nghim, chúng tôi s dng

hot hoá gen thông qua tác nhân trung gian
là các cht kích thích sinh trưng như BAP,
NAA và mt s yu t ngoi cnh khác.
2. ghiên cứu chuyển gen kháng bệnh
nấm Chitinase vào cà chua P375
a. Kết quả biến nạp gen Chitinase
Tin hành bin np gen Chitinase có
kh năng kháng nm gây bnh cây vào
ging cà chua P375 bng phương pháp gián
tip thông qua vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens (theo quy trình ca Swapan K.
Datta và cs., 1997). Ct nh các mu cy 
to vt thương, nhim vi khuNn vào mu.
Quá trình chuyn np gen Chitinase vào t
bào cà chua ưc thc hin thông qua vi
khuÈn Agrobacterium tumefaciens ưc
nhim vào các t bào b thương ang phân
chia mnh trong môi trưng giàu auxin. Khi
vi khuNn Agrobacterium tumefaciens tip
xúc vi t bào b thương chúng tit ra cht
transzeatin  giúp quá trình bin np trong
t bào thc vt và quá trình bin np gen
ưc thc hin. Sau khi bin np, mu ưc
chuyn sang môi trưng cng MS1 có b
sung ng thi 2 loi kháng sinh Cefotaxim
và Hygromicin. Cefotaxim nhm hn ch s
phát trin tr li ca vi khuNn, trong ó
kháng sinh Hygromicin là kháng sinh ch
th  chn lc các t bào và các mô ã
ưc bin np.

T kt qu thí nghim cũng có th thy
rng, các kháng sinh có nh hưng c ch
khá rõ n sinh trưng và phát trin cũng
như làm gim kh năng phát sinh cơ quan
ca t bào và mô, ngoài ra ôi khi cũng còn
gây ra nhng bin d soma làm gim tc 
phát trin và sc sng ca mô.
c. ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ
vi khun và thời gian đồng nuôi cấy đến
hiệu quả biến nạp
Nhng nghiên cu ca Fillatti và cs.,
(1997) ã xác nh nng  vi khuNn và
thi gian tin nuôi cy có nh hưng ln
n hiu qu bin np i vi cây cà
chua. Cơ ch ca quá trình này ưc thc
hin trên cơ s vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens khi nhim vào các t bào
ang phân chia mnh trên môi trưng
nuôi cy, vi khuNn Agrobacterium
tumefaciens tit ra cht transzeatin giúp
cho quá trình bin np gen ưc thc
hin. Các tác gi như Sung. Park (2003);
Pravda et al., 2005; Gorinova et al., 2005
cho rng nng  vi khuNn o  bưc sóng
600 nm vi OD = 0,2 - 0,6 và thi gian x
lý trong vòng 36 - 60 ting cho hiu qu
chuyn gen vào cà chua là cao nht.
Thí nghim bin np gen vào ging cà
chua P375 ưc chúng tôi tin hành vi
nng  vi khuNn  dng huyn phù ưc

Bảng 2. Hiệu quả biến nạp gen với các nồng độ vi khun
và thời gian đồng nuôi cấy khác nhau ở cà chua P375
Mẫu thí nghiệm và công thức
Số lượng
mẫu thí
nghiệm
Số mẫu tái sinh
Tổng số
mẫu tái
sinh
Hiệu suất biến
nạp (%)
Bộ phận lấy
mẫu
Nồng độ vi
khuẩn
36 giờ 48 giờ 60 giờ
Cuống lá mầm
1: 10

300 1 1 - 2 chết
1: 15 266 1 5 1 7 2,63
1: 20 333 2 2 - 4 1,20
Lá mầm
1: 10

300 1 2 - 3 1,00
1: 15 301 3 9 1 13 4,32
1: 20 265 2 3 1 6 2,24
Cộng 1 765 35

cây có b r phát trin, cây kho mnh.
b. Kiểm tra kiểu gen
Tin hành phân tích v phân t i vi
s biu hin ca gen, PCR (Shen, 1998;
Bhat và Srinivasan, 2002), bng các
enzyme c trưng HindIII, Pstl  xác nh
các vùng có trng lung phân t tương ng
vi gen Chitinase. Phn ng PCR ưc
hoàn thành trong 50 µl ca mi mt hn
hp phn ng chuNn vi enzym Taq ADN
polimeraza, các nucleotid và vi cp mi
c trưng ca gen Chitinase.
CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’
CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’

Kt qu in di cho thy trong 12 cây
cà chua to ưc trên môi trưng chn lc
ch có 2 cây biu hin có mt gen
Chitinase, gen chuyn ưc khuych i
tương ng 788 bp. (hình 2).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (-)

Hình 1. Kt qu kim tra s có mt ca gen Chitinase
trong các cây ưc chuyn gen
788 bp
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
IV. KT LUN
1. Kết luận
Kt qu bưc u nghiên cu s dng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA