Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
––––––––––––
NGUYỄN THỊ HẢI NGHIÊN CỨU TÍNH NHẠY CẢM
KHÁNG SINH CỦA TRỰC KHUẨN MỦ XANH
(PSEUDOMONAS AERUGINOSA) Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số: 60 42 30
L
L
U
U
Ậ
Ậ
I
I
N
N
H
HH
H
Ọ
Ọ
C
C
Người hướng dẫn khoa học: TS.BS. LƯU THỊ KIM THANH
THÁI NGUYÊN - 2010
dụng của kháng sinh cũng như đặc tính của vi khuẩn và mức độ nhạy cảm với
kháng sinh của chúng đóng vai trò góp phần hết sức quan trọng trong việc điều trị
bệnh cho bệnh nhân.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
Trước yêu cầu của thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính
nhạy cảm kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)”
nhằm những mục tiêu nghiên cứu sau:
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ nhiễm trùng do Trực khuẩn mủ xanh trên bệnh nhân và tỉ lệ
ô nhiễm Trực khuẩn mủ xanh ở môi trường bệnh viện.
- Định loại Trực khuẩn mủ xanh.
- Xác định mức độ đơn kháng và đa kháng kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập P.aeruginosa từ một số bệnh phẩm (mủ vết thương, dịch mũi
họng, nước tiểu), từ môi trường (nước, không khí, bề mặt dụng cụ y tế đang sử
dụng) trong bệnh viện.
- Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của P.aeruginosa dựa trên kết quả
kháng sinh đồ của các chủng P.aeruginosa phân lập được.
bệnh rất phổ biến và kháng lại hầu hết các kháng sinh đang dùng. Vì vậy, nó thu hút rất
nhiều đề tài nghiên cứu của các nhà khoa học và các y bác sĩ trong cũng như ngoài nước.
Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P.aeruginosa gây ra tại Viện Bỏng
Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P.aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn
huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) [10].
Năm 2002, Chu Anh Tuấn, Nguyễn Văn Huệ, Lê Đức Mẫn nghiên cứu căn
nguyên gây nhiễm khuẩn huyết và yếu tố bệnh lý liên quan tại Viện Bỏng Quốc Gia
đã cho thấy P.aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm hàng đầu (74,3%) [24].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh
thường gặp ở Việt Nam thì P.aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi
khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% [11].
Hoàng Kim Tuyến và cộng sự nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi
khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) đã chứng
minh được P.aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi tại bệnh viện với
tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) [25].
Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y) đã
nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P.aeruginosa đa giá, tinh chế và đánh giá
hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng [12].
Theo một nguồn tin mới đây, một loại vaccine đường uống có thể bảo vệ cơ
thể người kháng lại P.aeruginosa mang tên Pseudostat - 1 đã được công bố bởi các
nhà khoa học Anh và Úc vào tháng 6/2006. Đây là một loại vaccine sử dụng
P.aeruginosa tinh chế đã bất hoạt [26].
Ngoài ra, còn rất nhiều nghiên cứu khác ở trong nước và trên thế giới đánh
giá tình trạng nhiễm trùng và mức độ kháng thuốc của loài vi khuẩn này.
1.1.2. Đặc điểm sinh vật học của P.aeruginosa
1.1.2.1. Hình thái, cấu tạo
tế bào vật chủ trong quá trình lây nhiễm.
Nhân:
Vật chất di truyền của P.aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tại
trong nguyên sinh chất. Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa khoảng 65% là
(Guanine + Cytosine). Ngoài ra, P.aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài
nhân đó là các plasmid. Các plasmid chứa các đoạn gen như TEM, OXA, PSE mã hóa
sinh ra enzyme betalactamase làm phá huỷ vòng betalactam của chất kháng sinh dẫn
tới P.aeruginosa kháng lại với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này. Do vậy mà rất
khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P.aeruginosa gây ra [35].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6
1.1.2.3. Phân bố
Trực khuẩn mủ xanh được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong môi trường sống
như: trong đất, nước, các bể bơi, hồ tắm nước nóng…nhưng phổ biến nhất là những
nơi ẩm thấp. Ở người, chúng có thể sống ở vùng da ẩm như nách, háng và một số ít
sống trong ruột. Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phát hiện sống bám bên ngoài của
thực vật, động vật, kể cả trong bệnh viện [28].
Ít khi có nhiễm trùng do P.aeruginosa ở người khỏe mạnh. Chúng là căn
nguyên quan trọng nhất trong các nhiễm khuẩn ở bệnh nhân bị bệnh nặng như bệnh
tăng bạch cầu, u xơ bàng quang và bệnh nhân có bỏng rộng. Trong điều kiện ướt,
nước và nếu thêm yếu tố giàu chất khoáng, giàu dinh dưỡng thì rất thuận lợi cho sự
tồn tại và phát triển của trực khuẩn P.aeruginosa (như dụng cụ làm ẩm oxy, ống
hút, lavabo rửa tay, nước lưu cữu…). Vi khuẩn chứa trong các hạt khí dung khi
được hít vào cơ thể thì có thể tránh được những cơ chế bảo vệ bình thường của
đường hô hấp để gây ra nhiễm khuẩn. Có nhiễm khuẩn do P.aeruginosa sinh trưởng
ngay trong các thuốc dùng cho điều trị. Thậm chí vi khuẩn này tồn tại được ngay cả
trong một số chất tẩy uế. Bồn và các dụng cụ làm thông khí có thể ô nhiễm nặng và
là nguồn gây nhiễm ra môt trường. Tuy nhiên, nguy cơ chính bị nhiễm khuẩn do
tím có bước sóng 400nm, tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc. Ngoài
trực khuẩn mủ xanh chỉ có một số loài Psedomonas tạo sắc tố này.
+ Pyorubrin: Sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố này.
+ Pyomelanin: Sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng trực khuẩn mủ xanh
sinh sắc tố Pyomelanin.
Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh không sinh sắc tố.
1.1.3. Một số tính chất sinh hóa cơ bản
- Hiếu khí tuyệt đối, oxidase (+), lên men đường glucoza, không lên men đường
lactose, xitrat simmons (+), mannit (+), idol (-), H2S (-), LDC (-), ODC (-), ADH (-).
1.1.4. Sức đề kháng
Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố ở ngoại cảnh,
chúng có thể tồn tại được ngay cả trong một số chất tẩy uế. Trong số các vi khuẩn,
Trực khuẩn mủ xanh có sức kháng lại mạnh nhất với các thuốc kháng sinh. Mức độ
kháng thuốc này là do cấu trúc các lỗ porin của màng ngoài làm hạn chế các thuốc
kháng sinh đi vào khoảng trống của màng bào tương hơn so với những vi khuẩn
Gram âm khác[6].
1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên
Vi khuẩn có kháng nguyên H và kháng nguyên O chịu nhiệt.
- Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của vi khuẩn. Kháng nguyên có
đặc điểm: Không chịu được nhiệt, bị cồn 50% và các men tiêu protein phá hủy, chịu
được tác động của focmol 0,5%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8
- Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân, đã có đến 16 loại do đó dựa vào
kháng nguyên O để phân chia P.aeruginosa thành 16 typ huyết thanh ký hiệu từ P1
đến P16. Kháng nguyên O có đặc điểm: Chịu được nhiệt, rất độc, kháng cồn,
bị phá hủy bởi focmon 0,5%.
1.1.6. Độc tố
1.1.7. Khả năng gây bệnh của P.aeruginosa
Mặc dù P.aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhưng nó là vi khuẩn có
độc lực đặc biệt. Khi tuyến phòng thủ đầu tiên (hàng rào bảo vệ không đặc hiệu ở
da, niêm mạc) bị phá vỡ (như khi bị vết thương) hoặc vi khuẩn được đưa vào cơ thể
tắt qua hàng rào này (như theo dụng cụ nội soi hoặc ống thông khí quản…) thì gây
ra nhiễm khuẩn. Đầu tiên vi khuẩn bám dính vào bề mặt tế bào biểu mô và giai đoạn
này cần đến vai trò của pili và polisaccharide ngoại bào. Các chủng nhầy phân lập
từ bệnh nhân bị xơ phế nang tạo ra các polisaccharide chứa nhiều vi khuẩn làm tăng
sự kết dính của vi khuẩn với biểu mô đường hô hấp và giúp chúng kháng lại thực
bào. Sau khi xâm nhập, sự bảo vệ dựa vào thực bào và vỏ nhầy do polisaccharide
có đủ khả năng và đủ thời gian để sản xuất collagenase, elastase, pyocyanin và các
sản phẩm khác để làm lan truyền và phá hủy tổ chức cục bộ. Ngoại độc tố A có thể
là nhân tố góp phần quan trọng gây tổn thương tổ chức và tác dụng làm lan tỏa
nhiễm khuẩn. Nghiên cứu in vitro gần đây đã cho thấy sắc tố pyocyanin ức chế sự
sản sinh superoxide của bạch cầu đa nhân. Có thể các nhân tố này rất quan trọng
làm thuận lợi cho việc hình thành, lan tỏa và kéo dài nhiễm khuẩn.[6]
Nhiễm trùng thường xảy ra ở những người mà cơ chế bảo vệ bị tổn thương
như sử dụng corticoit hay kháng sinh dài ngày, bỏng nặng hoặc tiêm tĩnh mạch ma
túy…Vị trí nhiễm trùng thông thường là đường tiểu và vết thương hở (nhất là vết
bỏng). Tại chỗ xâm nhiễm chúng gây viêm có mủ màu xanh, ở những cơ thể suy
giảm sức đề kháng chúng có thể xâm nhập vào sâu hơn bên trong cơ thể và gây
viêm ở các phủ tạng như các nhiễm trùng nung mủ và những áp xe ở những phần
khác nhau của cơ thể người. Những trường hợp viêm màng trong tim, viêm phổi,
viêm màng não tuy hiếm nhưng cũng xảy ra hoặc gây bệnh toàn thân như nhiễm
khuẩn huyết, nhiễm khuẩn ở trẻ mới sinh thường gây bệnh rất trầm trọng. Nhiễm
khuẩn huyết thường gây chết ở những cơ thể suy nhược [29].
P.aeruginosa là tác nhân gây viêm tai ngoài, thường là những người hay đi
bơi. Loài vi khuẩn này có thể xâm nhập vào mắt (qua chấn thương hoặc do đưa
thuốc bị nhiễm khuẩn vào) gây viêm màng kết mạc mắt, viêm giác mạc mắt hoặc
bị tiêu diệt, còn những chủng kháng thuốc sẽ sống sót, tiếp tục sinh trưởng, phát
triển. Cuối cùng làm thay đổi hoàn toàn bản chất vi sinh của bệnh và vô hiệu hóa tác
dung điều trị của kháng sinh đó.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
11
Đề kháng thu được:
Là khả năng kháng thuốc của vi sinh vật xuất hiện sau khi chúng tiếp xúc với
kháng sinh.
Nguyên nhân của đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ
chỗ không có trở nên có gen đề kháng với kháng sinh. Những biến cố này bao gồm
đột biến gen và nhận được gen kháng thuốc.
* Đột biến gen: Biến cố này xảy ra trước hoặc sau khi vi khuẩn tiếp xúc với
kháng sinh.
+ Đột biến một bước: mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ
kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng
rất cao. Đột biến kháng streptomycin, lincomycin và isoniazid là những đột biến
kiểu một bước.
+ Đột biến nhiều bước: mức độ đề kháng có liên quan tới nồng độ kháng
sinh. Trong trường hợp này kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột
biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu sẽ cao hơn lần trước. Đột
biến kháng penicillin, cephalosporin, tetracycline, chloramphenicol, aminoglycoside,
sulfamide và colistin là những đột biến kiểu nhiều bước.
Gen đề kháng xuất hiện do đột biến sẽ được lan truyền từ thế hệ này sang thế
hệ khác cùng với sự phân chia của tế bào vi khuẩn. Xác suất xuất hiện một đột biến
rất nhỏ (10
-6
- 10
-11
phân chia của tế bào vi khuẩn.
+ Tiếp hợp: là hiện tượng hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau và truyền
cho nhau đoạn DNA có mang gen đề kháng.
+ Biến nạp: là hiện tượng xảy ra khi vi khuẩn đề kháng bị li giải, giải phóng
các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào các tế bào vi khuẩn khác.
+ Tải nạp: là hiện tượng phage mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang nạp
vào tế bào vi khuẩn khác
1.2.3. Cơ chế tác động của kháng sinh lên vi khuẩn
Ức chế tổng hợp thành tế bào: Kháng sinh ức chế thành tế bào thực chất là
ức chế một bước nào đó của tổng hợp peptidoglycan của vi khuẩn. Khi mất thành
phần peptidoglycan cứng xung quanh tế bào vi khuẩn, tế bào thường bị chết do
trương nước, sưng lên hoặc bị nổ và khi không có thành tế bào chúng cũng dễ bị các
tế bào thực bào tiêu diệt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13
Gây rối loạn chức năng thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương: Làm
cho các thành phần cần thiết bên trong tế bào thoát ra ngoài và nước đi vào trong
khiến tế bào bị vỡ.
Ức chế tổng hợp protein: Bằng cách gắn vào ribosom 70S của vi khuẩn.
Kháng sinh gắn vào tiểu phần 30S (như Steptomycin) sẽ ngăn cản hoạt động của ARN
thông tin hoặc ức chế chức năng của ARN vận chuyển (như Tetracyclin). Kháng sinh
gắn vào tiểu phần 50S (như Erythromycin, chloramphenicol), làm cản trở sự liên kết,
hình thành các chuỗi acid amin tạo phân tử protein cần thiết cho tế bào sống.
Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic: Ngăn cản sự sao chép DNA (nhóm
Quinon), ức chế sao mã RNA (Rifampicin) hay ức chế sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa cần thiết để ngăn cản hình thành nên các nucleotid như Sunfamid và
Trimethorpim.
1.2.4. Biện pháp hạn chế sự kháng thuốc
tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi
sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc
điểm hình thái.
Các phƣơng pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:
Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái dẫn đến nhiều
nghiên cứu tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho các vi sinh vật riêng
biệt. Sự khác biệt của các phản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh vật.
- API20E KIT
Nguyên tắc: Dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi
vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều
nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gen quyết định phản ứng sinh hóa
nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng
giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả.
Phân biệt bằng thực khuẩn thể
Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn
thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành
các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm
nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật
chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để
phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15
Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết
là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện
ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực
khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do
đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
- Phân biệt theo Typ huyết thanh
sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen. Và được ưu tiên
chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà
khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều cặp mồi chung dùng cho nhiều
nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là
thuận lợi lớn chi các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã
hóa 16S rRNA, [18][16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng P.aeruginosa phân lập được từ các
bệnh phẩm và môi trường bệnh viện.
* Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên.
que cấy, khay men hoặc sắt không rỉ, giá để ống nghiệm…
* Hóa chất
- Thuốc nhuộm Gram: Thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch lugol, cồn 90
0
,
dung dịch fucsin kiềm.
- Thuốc thử tính chất sinh vật hoá học: Thuốc thử oxidase. Dung dịch xanh
brommothymol 1,5% trong cồn 90
0
. Dung dịch đỏ methyl: Đỏ methyl 0,1g + cồn
95
0
.Thuốc thử kowaca (thử tính chất sinh indol).
- Thuốc thử phản ứng VP: Dung dịch A: α naphton 6% trong cồn 90
0
, để tủ
lạnh trước khi dùng. Dung dịch B: NaOH 16% trong nước.
- Nước muối NaCl 9‰
- Các hóa chất và thiết bị, máy móc sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học Môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen -
Viện Công nghệ Sinh học.
Các khoanh giấy kháng sinh
- Các khoanh giấy kháng sinh được sử dụng của hãng Bio - Rad (Pháp)
bao gồm:
Ampicillin (AM), Piperacine (PIP), Cefalexine (CN), Cefotaxime (CTX),
Cephalothin (CF), Cefazoline (CZ), Ceftazidime (CAZ), Ceftriaxone (CRO),
Gentamycine (GM), Amikacine (AN), Netromycine (NET), Tobramycine (TM), Co-
trimoxazol (SXT), Ciprofloxacine (CIP), Norfloxacin (NOR), Pefloxacine (PEF),
Doxycylin (DO), Chloramphenicol (C), Rifamycine (RA), Nitrofurantoin (FT).
0
C
trong 15 phút. Đổ môi trường ra các
đĩa Petri.
Thạch
máu
Thạch thường
Máu thỏ đã loại tơ huyết
250ml
15ml
Đun nóng chảy 250 ml thạch
thường đựng trong bình cầu, để
nguội khoảng 55
0
C - 66
0
C. Cho 15
ml máu thỏ vào bình thạch. Lấy tay
lắc xoay tròn cho máu tan đều. Đổ
môi trường vào đĩa Petri.
Chocolate
Thạch thường
Máu thỏ đã loại tơ huyết
250ml
15ml
Làm như thạch máu rồi đun cách
thuỷ 80
0
1g
20g
10ml
Đun sôi tất cả các thành phần môi
trường cho đến khi tan hoàn toàn.
Điều chỉnh pH: 7,2. Thêm dung dịch
xanh brommothymol, môi trường sẽ
có màu xanh lá cây. Đổ môi trường
ra các ống nghiệm, hấp ở 110
0
C
trong 30 phút sau đó đem ra để
nghiêng cho môi trường đông lại.
Thạch
mềm
Pepton
Cao thịt
Muối tinh khiết
Cao men
Thạch
10g
3g
5g
6g
6g
Đun sôi cho tan hoàn toàn các chất.
Điều chỉnh pH = 7,6. Hấp ở 110
0
C
trong 30 phút. Đổ ra các ống
1000ml
Cho thạch vào nước, đun sôi cho
đến khi tan hoàn toàn. Thêm các
hoá chất còn lại vào để hoà tan.
Điều chỉnh pH: 7,4. Cho 6ml dung
dịch đỏ phenol 0,5%, khuấy đều rồi
phân phối vào các ống nghiệm
12nm mỗi ống khoảng 3ml. Hấp
110
0
C trong 30 phút, đem ra để ống
môi trường nằm nghiêng, sao cho
mặt nghiêng và mặt đứng dài
khoảng 2 - 2,5cm.
Mannitol
di động
Pepton
Thạch
Manitol
Kalinitrat
Dung dịch đỏ phenol 1%
trong nước
20g
4g
10g
1g
4 ml
Đun sôi, khuấy đều để hoà tan hoàn
toàn các hoá chất. Điều chỉnh pH:
7,6. Thêm dung dịch đỏ phenol,
Urê
Nước cất
Dung dịch đỏ phenol
trong cồn
3g
5g
1g
20g
1000ml
2ml
Đun nóng 50 - 60
0
C để hoà tan các
chất. Điều chỉnh pH 7,2. Phân phối
vào các ống nghiệm mỗi ống 1 -
2ml. Hấp ở 110
0
C trong 30 phút.
Muller -
Hinton
Muller - Hinton
Nước cất
pH 7,0 - 7,2.
15g
0,3l
Đun cách thủy môi trường cho tan
thạch. Hấp ở 121
0
C trong 15 phút.
Để nguội 45
ngửa một góc 30
o
). Cầm tăm bông vô trùng đưa vào mũi của bệnh nhân đến vùng tỵ
hầu, xoay nhẹ, lấy ra. Làm tương tự với lỗ mũi bên kia.
+ Bệnh phẩm nước tiểu: Dùng sonde vô trùng đưa vào đường tiết niệu của
bệnh nhân hoặc có thể lấy trực tiếp bằng cách bỏ nước tiểu đầu, lấy nước tiểu giữa
dòng cho vào ống vô trùng.
Đối với mẫu lấy từ môi trường:
- Mẫu nước: (lấy mẫu nước máy chưa sử dụng): Lấy vào lọ thuỷ tinh nút mài
vô khuẩn, trước khi lấy mẫu phải đốt vòi bằng ngọn lửa đèn cồn, vặn cho vòi nước
chảy 3 - 5 phút. Lấy xong đốt miệng lọ để sát khuẩn và đậy nút ngay.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
22
- Mẫu không khí:
+ Đặt các đĩa môi trường cách sàn nhà 20cm (thường đặt giữa phòng hay các
góc tường).
+ Mở nắp đĩa thạch để khoảng 10 phút rồi đóng nắp hộp lồng lại đem nuôi cấy.
+ Mẫu từ các mặt phẳng dụng cụ y tế đang sử dụng: (lấy ở đầu ống hút dịch,
dao kéo, bông, gạc vô trùng): Dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ướt bằng nước
muối sinh lý quệt vào bề mặt các dụng cụ nghi ngờ có nhiều vi khuẩn [15].
2.3.2.2. Kỹ thuật phân lập
Nhuộm soi sơ bộ
Sau khi lấy được bệnh phẩm, đem nhuộm soi để quan sát hình thể, tính chất
bắt màu, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn. Thông qua kết quả nhuộm soi sơ
bộ có thể định hướng cho việc nuôi cấy.
Phương pháp nhuộm: Sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram
+ Soi dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với độ phóng đại 100.
+ Nhận định kết quả:
100 lần trong nước muối sinh lý, cách làm như sau:
+ Lấy pipet vạch chuẩn hút ra 0,5ml nước tiểu cho vào ống nghiệm 1 (chứa
4,5ml nước muối sinh lý) tạo thành nước tiểu pha loãng 10
-1
, tiếp tục dùng pipet hút
ra 0,5ml dung dịch ở ống nghiệm 1 vừa pha cho vào ống nghiệm 2 (chứa 4,5ml
nước muối sinh lý) sẽ thu được nước tiểu pha loãng 10
-2
.
- Cách cấy nước tiểu:
+ Lấy pipet Pasteur hơ trên ngọn lửa đèn cồn, bẻ cong đầu que cấy tạo thành
góc 90
0
C.
+ Dùng pipet vạch chuẩn lấy ra một giọt bệnh phẩm đã pha loãng 10
-2
cho
vào môi trường nuôi cấy.
+ Dùng phần đầu của pipet Pasteur, dàn bệnh phẩm trên bề mặt môi trường.
+ Nuôi cấy trong tủ ấm 37
0
C từ 18 - 24 giờ.
- Cách cấy mẫu nước:
+ Nhỏ một giọt nước vào môi trường nuôi cấy.
+ Dùng tăm bông vô trùng dàn đều trên bề mặt môi trường.
+ Nuôi cấy trong tủ ấm 37
0
C trong 18 - 24 giờ.
Kỹ thuật cấy chuyển
Bệnh phẩm sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, dựa vào đặc
- Đối với ống 1 và 2 chứa môi trường thạch nghiêng ta có cách cấy như sau:
+ Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trong đĩa thạch cho vào ống thạch
nghiêng, kéo từ đáy ống lên phần trên của mặt thạch nghiêng, vừa kéo vừa đưa que
cấy sang ngang theo những vạch chữ chi và tránh ria sát vào thành ống. Ở ống 2,
phần thạch đứng ta dùng que cấy lấy khuẩn lạc chọc thẳng xuống rồi rút que cấy lên
sau đó ria cấy trên bề mặt môi trường thạch nghiêng.
Copyright: Tài liệu đại học ©