!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG
ĐỖ TRUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ
PHÂN TỬ SÁN LÁ RUỘT NHỎ TRÊN NGƯỜI Ở
MỘT SỐ TỈNH VÀ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ
TẠI CỘNG ĐỒNG, NĂM 2010-2013

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Hà Nội, 2014


Hà Nội, 2014 i
L ỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy hướng dẫn GS.TS.
Nguyễn Văn Đề và PGS.TS. Lê Thanh Hoà, những thầy giáo thực sự tâm
huyết đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian truyền đạt kiến thức, trao
đổi, định hướng, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS. TS. Nguyễn Mạnh
Hùng, nguyên Viện trưởng, TS. Trần Thanh Dương, Viện trưởng; Ban Lãnh
đạo Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương và các cán bộ, các
đồng nghiệp của các khoa, phòng của Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng
Trung ương đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn BS. Nguyễn Thị Hợp, CN. Nguyễn Thu
Hiền, các bạn đồng nghiệp của Khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét-Ký sinh
trùng-Côn trùng Trung ương, chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Khuê và
các cán bộ Phòng Miễn dịch, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi khi
thực hiện các công việc thu mẫu, thí nghiệm nghiên cứu hình thái học, sinh
học phân tử cho nghiên cứu này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS. Jitra Waikagul, TS. Urusa
Thenkham đã tài trợ và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm tại phòng thí
nghiệm của Bộ môn Ký sinh trùng, khoa Y học nhiệt đới, trường Đại học
Mahidol, Bangkok, Thái Lan.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ một phần kinh phí để thực hiện
thẩm định sinh học phân tử, của Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc
gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.06-2012.05 “Nghiên cứu xác định
loài và đặc điểm phân tử ký sinh trùng gây bệnh động vật lây sang người
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện.
Các số liệu, kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa
từng được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót tôi xin
hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Tác giả
Đỗ Trung Dũng
iv
MỤC LỤC Mục
Nội dung
Trang
Lời cảm ơn
i
Lời cam đoan
iii
Mục lục
iv
Danh mục các chữ viết tắt
ix

Đặc điểm chu kỳ phát triển (vòng đời).
12
1.1.7.
Một số nghiên cứu về một số loài sán lá ruột nhỏ họ
Heterophyidae và Echinostomatidae trên thế giới.
16
1.1.8.
Tình hình nghiên cứu một số loài sán lá ruột nhỏ họ
Heterophyidae và Echinostomatidae ở động vật và người ở
Việt Nam.
20
1.2.
Tổn thương giải phẫu bệnh, triệu chứng lâm sàng, chẩn
đoán, điều trị và phòng chống sán lá ruột nhỏ
23

v
1.2.1.
Tổn thương giải phẫu bệnh.
23
1.2.2.
Triệu chứng lâm sàng
25
1.2.3.
Chẩn đoán
26
1.2.4.
Điều trị
28
1.2.5.

Đối tượng nghiên cứu.
40
2.1.2.
Địa điểm nghiên cứu.
40
2.1.3.
Thời gian nghiên cứu
41
2.2.
Phương pháp nghiên cứu
43
2.2.1.
Thiết kế nghiên cứu
43
2.2.2.
Cỡ mẫu nghiên cứu
44
2.2.3.
Quy trình thu thập mẫu sán lá trưởng thành
47
2.2.4.
Nội dung nghiên cứu đặc điểm hình thái sán lá ruột nhỏ
trưởng thành
48

vi
2.2.5.
Nội dung ghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử của một
số loài sán lá nhỏ
50

Kết quả thu thập mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành tại các
tỉnh
65
3.1.3.
Đặc điểm hình thái học một số loài sán lá ruột thu được
trong nghiên cứu
68
3.2.
Kết quả thẩm định phân tử của các loài sán lá nhỏ thu được
77
3.2.1
Thu nhận chuỗi gen ty thể cox1
77
3.2.2.
Thu nhận chuỗi gen nhân 28S
78
3.2.3.
Kết quả thẩm định loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và
Echinostomatidae sử dụng chỉ thị gen ty thể cox1
82
3.2.4.
Kết quả thẩm định loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và
Echinostomatidae sử dụng chỉ thị gen nhân 28S ribosome
88
3.2.5
Nghiên cứu về gen cox1 của Haplorchis taichui tại 3 tỉnh
Hà Giang, Thanh Hoá và Quảng Trị
87
3.3.
Kết quả đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng.

chuỗi gen tương ứng của các loài sán lá ruột nhỏ khác.
115
4.2.2.
Mối quan hệ phả hệ về loài giữa các chủng sán lá ruột nhỏ
của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự gen cox1.
117
4.2.3.
So sánh trình tự nucleotide của gen 28S các chủng nghiên
cứu với chuỗi gen tương ứng của các loài sán lá khác
119
4.2.4.
Mối quan hệ phả hệ của các chủng sán lá nghiên cứu dựa
trên một phần trình tự gen 28S
120
4.2.5.
Đặc điểm sinh học phân tử của 3 quần thể sán lá ruột nhỏ H.
taichui tại Hà Giang, Thanh Hoá và Quảng Trị
122
4.3.
Hiệu quả điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng
126
4.3.1.
Nhiễm phối hợp sán lá ruột nhỏ và sán lá gan nhỏ trên người
tại Việt Nam
126
4.3.2.
Chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ
129
4.3.3.
Hiệu quả điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng sử dụng liều

Khoảng tin cậy (Confidence Interval).
COI, cox1
Gen ti thể Cytochrome C oxidase I
CS
cộng sự
EPG
Số trứng trong một gram phân (Egg per gram)
et al
và những người khác
ETS
External Transcribed Spacer
ITS
Internal Transcribed Spacer
kb
Kilobase
MDA
Phát thuốc điều trị tại cộng đồng (Mass Drug
Administration).
NIMPE
Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương
(National Institute of Malariology, Parasitology and
Entomology)
OR
Tỉ xuất chênh (Odds ratio)
PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain
Reaction).
RAPD
Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên (Random
Amplified Polymorphic ADN).

2.3.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho gen cox1
52
2.4.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho gen nhân 28S
52
2.5.
Thành phần của phản ứng PCR nghiên cứu gen cox1 cho
H. taichui
56
2.6.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho gen cox1 cho H.
taichui
56
2.7.
Danh sách các chủng sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae
và Echinostomatidae thu nhận từ Ngân hàng gen cung
cấp chuỗi gen tham chiếu cox1 (gen ty thể) và 28S
ribosome (gen nhân) trong nghiên cứu thẩm định loài và
phân tích phả hệ các mẫu của Việt Nam.
61
3.1
Kết quả nhiễm sán lá nhỏ dựa trên xét nghiệm Kato-Katz
tại các tỉnh tiến hành nghiên cứu
65
3.2.
Kết quả thu mẫu sán trưởng thành từ các bệnh nhân sau
khi điều trị bằng thuốc Praziquantel 25mg/kg cân nặng
66
3.3.

81
3.10.
Sự sai khác về thành phần và trình tự các đoạn
oligonucleotide trong một đoạn gen cox1 (350 bp) giữa
các chủng so sánh
84
3.11.
Số lượng các chủng H. taichui của các tỉnh Hà Giang,
Thanh Hoá và Quảng Trị nghiên cứu sử dụng gen cox1.
93
3.12.
Kết quả xét nghiệm Kato-Katz đánh giá tình hình nhiễm
sán lá nhỏ trước điều trị tại 2 xã thuộc tỉnh Nam Định.
100
3.13.
Tỉ lệ nhiễm sán lá trước điều trị, sau điều trị 2 tuần, 4
tháng, 7 tháng và 15 tháng theo giới tính tại xã Nghĩa
Hồng
101
3.14.
Tỉ lệ nhiễm sán lá trước điều trị, sau điều trị 2 tuần, 4
tháng, 7 tháng và 15 tuần theo giới tính tại xã Hải Hoà
102
3.15
Tỉ lệ nhiễm sán lá trước điều trị, sau điều trị 2 tuần, 4
tháng, 7 tháng và 15 tháng theo giới tính chung cả 2 xã
103
3.16.
Hiệu quả của Praziquantel 50mg/kg cân nặng điều trị sán
lá nhỏ trên ngườ i tại cộ ng đồng

3
1.2.
Hình ảnh sán lá ruột heterophyid trưởng thành
7
1.3.
Một số loài sán trưởng thành thuộc họ Echinostomatidae
9
1.4.
Chu kỳ của sán lá ruột nhỏ
12
2.1.
Bản đồ tỉnh Nam Định và các điểm nghiên cứu can thiệp
42
2.2.
Sơ đồ nghiên cứu hình thái học và sinh học phân tử
43
2.3.
Sơ đồ thời gian nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị
sán lá tại cộng đồng
44
3.1.
Bản đồ các tỉnh thu mẫu sán lá ruột nhỏ
64
3.2.
Hình ảnh Haplorchis taichui trưởng thành ký sinh ở
người nhuộm Semichon’s acetocarmine và gai ở giác
bụng sinh dục
68
3.3.
Hình ảnh Haplorchis pumilio trưởng thành ký sinh ở

gen cox1
87
3.10.
Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng
sán lá ruột nhỏ dựa trên trình tự gen 28S
92
3.11.
Cây phả hệ biểu hiện mối quan hệ của 3 quần thể H.
taichui xây dựng bởi phương pháp kết nối lân cận
(Neighbor-joining method).
95
3.12.
Mạng lưới kiểu đơn (Haplotype) của 3 quần thể H.
taichui tại Việt Nam thể hiện mối liên quan tới nguồn
gốc về địa lý
96
3.13.
Sơ đồ qúa trình nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị
sán lá nhỏ tại cộng đồng
99
3.14
Tỉ lệ nhiễm sán lá nhỏ trước và sau khi điều trị 2 tuần, 4
tháng, 7 tháng và 15 tháng.
104

!
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ước tính có khoảng hơn nửa tỷ người có
nguy cơ nhiễm các loại ký sinh trùng truyền qua thức ăn [160], [161]. Theo

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu về ấu trùng sán lá ruột trên vật chủ
trung gian như ốc, cá và mộ t số phát hiện về sán lá ruột nhỏ ký sinh trên đ ộ ng
vật như chó, mèo, chim, gà đã được thông báo [6], [14], [106], [108], [149].
Một số loài sán lá ruột ký sinh trên người cũng đã được khảo sát dịch tễ học,
vấn đề nhiễm phối hợp sán lá gan nhỏ và nhiều loài sán lá ruột nhỏ trên người
ở nhiều điểm dị ch tễ sán lá gan nhỏ trước đây tại như tại Nam Định, Ninh
Bình, Phú Thọ…đã được đề cập [2], [5], [15], [118] và vấn đề này liên quan
rất nhiều đến chiến lược điều trị và phòng chống bệnh sán lá nhỏ tại cộ ng
đồng. Bên cạnh đó các dữ liệu về đặc điểm hình thái học và sinh học phân tử
của sán lá ruột nhỏ trưởng thành tại Việt Nam còn thiếu hoặc chưa được
nghiên cứu một cách đầy đủ.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn việc phân tích hình thái học, phân tích
đặc điểm phân tử mộ t số gen ty thể và gen nhân của sán lá ruột nhỏ ký sinh
trên người tại các vùng khác nhau sẽ đóng góp cho nguồn dữ liệu trong
nghiên cứu cơ bản về phân loại và phân bố các loài sán lá ruột nhỏ ở Việt
Nam và trên thế giới, và đề xuất biện pháp điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng là
rất cần thiết góp phần không nhỏ vào nghiên cứu phòng chống các ký sinh
trùng gây bệnh ở người tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử sán lá ruột nhỏ trên người ở
một số tỉnh và hiệu quả điều trị tại cộng đồng, năm 2010-2013” với mục tiêu:
1. Xác định thành phần loài, mô tả đặc điểm hình thái sán lá ruột nhỏ
trên người tại mộ t số tỉnh của Việt Nam.
2. Thẩm định loài sán lá ruột nhỏ bằng phương pháp sinh học phân tử.
3. Đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ ở người bằng praziqantel liều
50mg/kg tại cộng đồng.!
!
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


Cơ quan tiêu hóa: bắt đầu từ lỗ miệng, nằm ở đáy giác miệng, tiếp đến
hầu (3), thực quản (4) và hai nhánh ruột tịt (5) kéo dài về phía sau cơ thể, ở
một số loài hai bên hai nhánh ruột có nhiều mấu bên, mấu phía ngoài nhánh
ruột phân nhánh hình cành cây (ví dụ Fasciola gigantica). Cặn thức ăn được
thải ra ngoài qua lỗ miệng. Sán lá không có hậu môn vì dinh dưỡng của sán
chủ yếu là hình thức thẩm thấu các chất dinh dưỡng qua bề mặt của sán. Do
vậy, trên thân sán có rất nhiều tuyến dinh dưỡng.
Cơ quan bài tiết (màu vàng): cấu tạo theo kiểu nguyên đơn thận gồm 2
ống (7) chạy dọc cơ thể và nối với nhau tạo thành túi (ống) bài tiết chính (8)
mở ra ở lỗ bài tiết (9) ở mút sau cơ thể, mỗi ống bài tiết có nhiều nhánh bé
(6), tận cùng có tế bào ngọn lửa thực hiện chức năng bài tiết. Các tế bào ngọn
lửa thường được sắp xếp đối xứng. Vị trí và số lượng của tế bào ngọn lửa
được sắp xếp như công thức, công thức tế bào ngọn lửa được sử dụng để phân
biệt loài trong giai đoạn ấu trùng. Kích thước và hình dạng của túi bài tiết
cũng hiệu quả trong định loại các loài sán.
!
5
Cơ quan sinh dục đực: tinh dịch được sản xuất từ một, hai hoặc nhiều tinh
hoàn (10), qua ống dẫn tinh (11) đổ vào ống dẫn tinh chung (12) tập trung vào
túi chứa tinh (13) được giải phóng ra qua gai giao phối (15), tiếp theo túi chứa
tinh là tuyến tiền liệt (14) bao quanh ống phóng tinh, bao quanh gai giao phối
và các tuyến sinh dục như túi chứa tinh, tuyến tiền liệt là túi sinh dục (16). Lỗ
sinh dục (17) mở ra ở mặt bụng, thường ở trước giác bụng. Lỗ sinh dục có thể
là chung của cơ quan sinh dục đực và cái như trong hình vẽ hoặc cơ quan sinh
dục đực và cái mở độc lập. Phần cuối của cơ quan sinh dục có cấu trúc phức
tạp đặc trưng cho từng loài.
Cơ quan sinh dục cái: vòi trứng ngắn từ buồng trứng (18) gặp túi nhận tinh
(19) và ống Laurer (20) mở ở phía mặt lưng, tiếp theo đến ootype (21) được
bao quanh bởi đảo Mehlis (22). Tiếp đến tử cung (23), tử cung dài với nhiều
gấp khúc tới lỗ sinh dục chung (17). Ống nhỏ từ các tuyến noãn hoàng (24),

Procerovum varium
Centrocestus armatus
Stellantchasmus falcatus
Centrocestus formanus
Heterophyes dispar
Centrocestus formosanus
Heterophyes heterophyes
Centrocestus longus
Họ Echinostomatidae bao gồm một số loài thường gặp:
Echinochasmus japonicus
Echinostoma revolutum
Echinostoma malayanum
Echinostoma ilocanum
1.1.3. Đặc điểm phân loại hình thái học về sán lá ruột nhỏ trưởng thành
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái học phân loại giống Haplorchis, Procerovum.
và Stellantchasmus [115]
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân loại các giống sán lá ruột nhỏ thuộc họ
Heterophyidae

Giống
Đặc điểm
Haplorchis
Procerovum
Stellantchasmus
Giác bụng sinh
dục
Có gai
Có gai rất nhỏ
Không có gai
Tinh hoàn

H. pumilio: Sán trưởng thành có dạng hình quả lê, giác bụng sinh dục
có 32-40 gai có hình chữ I hoặc hình chữ A, thùy trước bên không nổi rõ có
một số gai nhỏ, thùy lư ng giữa xuất hiện có nhiều gai nhỏ.
H. parapumilio: Giác bụng sinh dục có 23-32 gai bảo vệ hình chữ I
hoặc A. Thùy bên trước nhô lên cùng với một vài gai nhỏ, thùy lưng giữa xuất
hiện với một vài gai. Phía trước cơ thể nhỏ mỏng có hình thìa, phía sau cơ thể
phình to có hình quả lê.
H. paravanissimus: Túi lưng có gai bảo vệ, giác bụng đơn giản, không
phân chia thành thùy và những vành gai gắt quãng.
!
8
H. vanissimus: Túi lưng có gai bảo vệ, giác bụng chia làm 4 thùy có
nhiều gai nhỏ nối liền ở bề mặt giác bụng.
H. taichui: Giác bụng có 12-16 gai to lên tới 30 µm chiều dài (xếp
thành hình nải chuối), ruột phân 2 nhánh kéo dài đến vị trí tinh hoàn.
H. parataichui: Giác bụng có 15-21 gai kính thước lớn nhất lên tới 17
µm chiều dài. Ruột phân 2 nhánh không kéo dài xuống đến vị trí tinh hoàn.
H. wellsi: Túi lưng không có gai, giác bụng rất to có 3 thùy hiện rõ.
H. yokogawai: Giác bụng nhỏ hơn giác miệng, giác bụng có thùy bụng
rất to cùng nhiều gai nhỏ li ti, có 3 thùy nhỏ. Ruột phân 2 nhánh kéo dài
xuống vị trí giữa của tinh hoàn.
H. sprenti: Giác bụng có một thùy bụng lớn và một thùy xoắn trái nhỏ,
cả 2 đều có nhiều gai nhỏ, ruột phân nhánh không kéo dài tới vị trí giữa của
tinh hoàn.
1.1.3.3. Đặc điểm phân loại một số loài thuộc giống Procerovum [115]
P. cheni: Túi mầm sinh dục (expulsor) ngắn hơn l00 µm chiều dài, túi
chứa tinh có 2 vách mỏng tách biệt. Ruột kéo dài tới vị trí giữa của tinh hoàn.
P. varium: Túi mầm sinh dục có kích thước 112 (96-140) µm chiều dài,
ruột kéo dài tới vị trí trước của tinh hoàn.
P. calderoni: Túi mầm sinh dục dài hơn 200 µm: Ruột kéo dài tới phần H. pumilio
E. japonicus
E. ilocanum
E. revolutum
E. malayanum

Hình 1.3. Một số loài sán trưởng thành thuộc họ Echinostomatidae