Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG TÁI SINH
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.)
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH
THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

i
LỜI CAM ĐOAN
học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Các số liệu, kết quả
trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận
văn này.
Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm 2014
Tác giả luận văn
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
1
2
2
4. Ý nghĩa khoa học 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Sơ lƣợc về cây ngô 3
3
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây ngô 6
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 7
10
1.2.1. Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới 10
1.2.2. Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam 14
1.3.Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng và thành phần môi trƣờng
đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô 14
1.3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng 14
của thành phần môi trƣờng 17
1.3.3. in vitro 19
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
21
2.2. Hóa chất và thiết bị 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/


PHỤ LỤC 63Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
STT
Chữ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
1
BAP
6 – benzylaminopurine
2
đtg

3
IAA
Indole-3-acetic acid
4
IBA
Indole-3-butyric acid
5
MS
Murashige & Skoog, 1962
6
NAA
1 - naphthaleneacetic acid
7
Nxb

3

45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

vii
-
48
51

in vitro sau 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

5
3.1. ở ổi phôi đế từ phôi
non 885
29
3.2. ở đế
từ phôi non
LVN 885 32
35
3.4. ở
885


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỞ ĐẦU
1.
Cây ngô (Zea mays L.) là cây lƣơng thực giàu dinh dƣỡng có vai trò
quan trọng trong nền kinh tế t .
- -
hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Cây ngô đƣợc gieo
. Theo thống kê của FAO, năm 2012 cây ngô
diện tích 177,38 triệu ha, [56
.
Những năm gần đây, nhờ việc sử dụng phƣơng pháp chuyển gen đã tạo
ra nhiều giống ngô mới có giá trị dinh dƣỡng cao [38], [53]; có khả năng
chống chịu với các điều kiện môi trƣờng hạn,
, …
. Thực tế
nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy in vitro gô
. Mặt khác, nguồn vật
liệu , quá trình tái sinh ngô thƣờng chỉ đƣợc
thực hiện thông qua sự tái sinh phôi hoặc mô sẹo [41]. Trong đó, mô sẹo đƣợc
hình thành từ phôi non hay từ lát cắt của thân cây non.
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu
môi trường tái sinh của một số giống ngô (Zea mays L.) phục vụ chuyển gen”.
2.
Xác định đƣợc các điều kiện thích hợp để tái sinh cây từ phôi non và từ

(theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn).

năm 1920, Sturtevantel đi
(c ) sau đây [6]:
1- Ssp amilaceae - ngô bột
2- Ssp indentata - ngô răng ngựa
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3- Ssp indurate - ngô đá rắn
4- Ssp everta - ngô nổ
5- Ssp saccharata - ngô đƣờng
6- Ssp ceratina -
7- Ssp tunicate -
Đây là cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngoài ra ngô còn
đƣợc phân loại theo nông học, sinh thái học, thời gian sinh trƣởng và thƣơng
phẩm [10].

-
phận sau: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt.

: rễ
mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ mầm (rễ tạm thời, rễ hạt) mọc từ trụ lá
mầm, chức năng chính của rễ này là hút nƣớc, thức ăn khi cây còn non
-
dƣới lên trên. Rễ đốt giúp cây hút nƣớc và dinh dƣỡng. Rễ chân kiềng (rễ
chống) mọc quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây
chống đổ, bám chặt vào đất, tham gia hút nƣớc và thức ăn cho cây. Thân
cây đặc và khá chắc, chia nhiều lóng (dóng) to dần từ dƣới lên, nằm giữa

đƣợc ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọn
giống, công nghệ sinh học, cơ giới hóa, điện khí hóa và tin học vào công tác
nghiên cứu và sản xuất [12].
. Với tỷ -
nguyên liệu cho công nghiệp. gƣời ta đã sản xuất
khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lƣơng thực - thực
phẩm, công nghiệp dƣợc và công nghiệp nhẹ
ngô xu
. Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng trong thức
ăn tổng hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho gia
súc, đặc biệt là bò sữa -
-
tỷ
tỷ lệ này rất cao nhƣ Mỹ 76%, Bồ Đào Nha 91%,
Malaysia 91% (CIMMYT, 2001).
, cần khoảng 4 triệu
tấn ngô mỗi năm. Riên 2,33
[57]
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ilin, Streptomicin,
sản xuất axit acetic.
nhƣ aceton, nhựa hóa học. Phôi ngô chứa 17,2 - 56,8% lipid nên có thể
dùng để ép dầu [2].
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam
1.1.3.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
Ngô là cây trồng có địa bàn phân bố rộng, đƣợc gieo trồng khắp trên
thế giới với sản lƣợng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lƣơng thực nào. Năm

108,5
Châu Á
53,5
53,7
54,81
43,8
45,8
49,41
234,5
246,1
270,9
Châu Mỹ
61,4
63,1
64,5
71,9
71,0
67,96
441,5
447,9
438,4
Thế giới
158,8
161,9
170,39
51,6
52,1
51,84
819,7
844,4


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Năng suất
(tạ/ha)
1975
0,267
0,28
10,51
1990
0,432
0,67
15,54
2000
0,730
2,01
27,47
2006
1,033
3,85
37,31
2007
1,096
4,30


lai và đang ở giai đoạn đầu đi vào công nghệ cao (công nghệ gen, nuôi cấy
bao phấn và noãn) [2], [12].
Bên cạnh những thuận lợi và thành tựu đã đạt đƣợc, ngành
. Sản lƣợng ngô
trong nƣớc không đủ phục vụ cho con ngƣời và phát triển ngành chăn nuôi.
Hàng năm, Việt Nam vẫn phải nhập khẩu lƣợng lớn ngô để chế biến thức ăn
gia súc. Vì vậy, việc nghiên cứu tạo giống ngô có năng suất cao, khả năng
chống chịu tốt, đồng thời đáp ứng yêu cầu chất lƣợng là nhiệm vụ rất quan
trọng và cấp thiết đối với các cơ quan nghiên cứu, chọn tạo giống.

1.2.1. Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới
Nuôi cấy in vitro cây ngô đƣợc bắt đầu từ rất sớm vào những năm
1930, khi Lampe và Mills nuôi cấy nội nhũ và phôi non trong môi trƣờng có
bổ sung dịch chiết khoai tây nhƣng mô chỉ sinh trƣởng có giới hạn [48]. Larue
(1949) đầu tiên nuôi cấy liên tục trong một thời
gian dài phôi non và phôi ngô trƣởng thành để xác định nhu cầu dinh dƣỡng
cho sinh trƣởng và phát triển.
Tái sinh cây từ phôi non hoặc bộ phận khác của những loài ngũ cốc lần
đầu tiên đƣợc miêu tả trong những năm 1960 đến 1980 [49]. Phôi non đƣợc
sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ngô. Lu
sử dụng phôi có kích thƣớc 1 - 1,5 mm thu đƣợc sau 2 tuần thụ phấn cấy
vào môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 0,25 - 2,0 mg/l và sucrose 3 - 12% [37].
Năm 1975, Green và Phillips
ngô [32].
11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ai loại mô sẹo của phôi : mô sẹo loại I có đặc

CML-327. Phôi non đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng N6, tỷ lệ tạo 56,33
12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

- 72,0%. Kết quả cho thấy môi trƣờng đạt tỷ lệ cao nhất (72,0%) là
môi trƣờng N6 có bổ sung L-proline 2,3 g/l, hydrolysate casein 200 mg/l và
2,4-D 1,0 mg/l [42].
Năm 2004, Huang và Wei
7 dòng ngô
-
-
tƣơng đối cao
(19,8 - 32,4%), đặc biệt dòng Mo17 đạt 25,6% [34].
Binott (2005) nuôi cấy phôi non từ 12 dòng ngô bố mẹ thuần chủng và
con lai tƣơng ứng của chúng để đánh giá khả năng tạo , phôi hóa và tái
sinh cây. Hạt non thu ở các giai đoạn 10, 15, 18, 21 và 24 ngày tuổi sau khi
thụ phấn và đƣợc khử trùng bề mặt. Phôi non đem cấy trên môi trƣờng tạo
bao gồm N6 bổ sung 2,4-D 0 - 2 mg/l, L-proline 2,87 g/l, hydrolysate
casein 0,1 g/l, glycine 2 g/l, sucrose 30 g/l và gelrite 3 g/l. nồng độ 2 mg/l
hình thành từ 80 đến 90% đối với phôi non của con lai và từ 50 đến
80% đối với phôi non của dòng bố mẹ. Khả năng phôi hóa đƣợc tiến hành ở 6
dòng thuần và 4 dòng lai. chỉ 4 dòng thuần và 3 dòng lai
tái sinh [34].
Năm 2011, Gorji nghiên cứu dòng ngô thuần khả năng tạo mô
sẹo và tái sinh cây. Kết quả trong môi trƣờng N6 tần số tạo cao nhất
khi bổ sung dicamba 2 mg/l, trong môi trƣờng MS có bổ sung 2,4-D ở nồng
độ 1 mg/l. Môi trƣờng N6 bổ sung dicamba thúc đẩy quá trình tạo cao
13


14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1.2.2. Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam
ngô, đó là: “nghiên cứu môi
trƣờng nuôi cấy in vitro phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen ở ngô
(Zea mays [11].
Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trƣờng N6 bổ sung 2,4-D 7 mg/l; casein 100
mg/l; L-prolin 2,88 mg/l; sucrose 40 g/l; agar 8 g/l cho tạo cao
nhất. 25 - 27 ngày đối với vụ đông,
phôi 18 - 20 ngày đối với vụ hè.
dòng
2 dòng
ngô HR8 và HR9 đạt lần lƣợt là 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9%
và 21,4% [14].
Nguyễn Văn Đồng (2009), tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từ
phôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô nếp và ngô
ngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năn

[4].
1.3. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng và thành phần môi
trƣờng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô
1.3.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng