SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày tháng năm 2010)
N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
NC
C
Ứ
Ứ
U
U

P
P
H
H
Ẩ
Ẩ
M
MĂ
Ă
N
NL
L
I
I
Ề
Ề
N
NT
T
Ừ
Ừ

K
K
A
A
R
R
A
A
)
)B
B
Ằ
Ằ
N
N
G
G

P
P
H
H
Ư
Ư

H
H
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: VÕ THANH TRANG
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 1/ 2010
LỜI CẢM ƠN

này còn chứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng khó làm thực phẩm cho người do có lượng
lớn chất khó ăn như cellulose… Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp khả dĩ có thể tận
dụng được phế phẩm này để phục vụ lại con ng
ười là rất quan trọng. Một trong những
giải pháp đó là sử dụng enzyme vi sinh vật và sinh khối nấm sợi Linh chi. Các chất
dinh dưỡng và hoạt chất sinh học của sinh khối nấm sợi cũng phong phú và có thể so
sánh với tai nấm về thành phần và hàm lượng. Hỗn hợp các chủng vi sinh vật, có tác
dụng hỗ trợ tiêu hóa (probiotic) (B.subtilis, vi khuẩn lactic) và có dược tính (nấm sợi
Linh chi)… được sử dụng để chế biến các s
ản phẩm từ đậu nành có tác dụng tốt cho
sức khỏe, trong việc chế biến và sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng.
Abstract: Soybean and its products, rich in protein, lipid, carbohydrate and
many precious biological active substances such as polyphenols, lecithin, saponin,
phytoestrogen (isoflavonoids, lignans, isoflavones, coumestans …), can save our
health from a lot of serious diseases. Soy protein also may reduce cholesterol and the
risk of heart disease, prevent cancers of the breast, kidney diseases, diabetes, porous
bone diseases, and some pre-menopausal disorders in women… Soy fibers (dietary
fibers) are considered as an agent for absorbing fat in stomach, inhibiting cholesterol
production in liver, slowering suger absorption. Taking adventage and treatment the
fiber of soybean into the easy taken and good organoleptic food are necessary
problems. Meanwhile, in Vietnam, the annual residue of the soymilk processing
industry is numerous. Although that by-product contains a high nutritional component,
it can not be used as a human food because of indigestable substances such as
cellulose…Consequently, an important method which can utilise this residue as a food
supply is using microorganisms’ enzymes such as Linhzhi (G.lucidum) hyphae. The
hyphae’s nutritions and biological substances are equivalent to the mushroom’s. A
complex of microorganisms which has digestive support effect (probiotic) (B.subtilis,
latic acid bacteria) and pharmacological properties (Ganoderma lucidum)… is used to
produced many soy food and funtional food.


1.4.2.1. Giới thiệu……………………………………………………………….9
1.4.2.2. Ứng dụng……………………………………………………………. .10
1.4.3. Nấm Linh chi……………………………………………………………….10
1.4.3.1. Đặc tính sinh học…………………………………………………… 10

1.4.3.2. Dược tính của nấm Linh chi………………………………………… 11
1.4.3.3. Công dụng của nấm Linh chi…………………………………………12
1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn…………………………………12
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………… 15
2.1. Vật liệu………………………………………………………………………… 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………15
2.2.1. Nội dung 1. Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh
vật sử dụng……………………………………………………………… 15

III
2.2.1.1. Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Lactobacillus
sp. ……………………………………………………………… 15
2.2.1.2 . Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Bacillus
subtilis……………………………………………………………… 16
2.2.1.3. Nghiên cứu hình thái, các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh
chi…………………………………………………………………… 17
2.2.2. Nội dung 2. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của các vi sinh vật
sử dụng theo thời gian……………………………………………………………… 19
2.2.2.1. Enzyme amylase của B.subtilis……………………………………… 19

2.2.2.2. Enzyme protease của B.subtilis……………………………………….20

2.2.2.3. Enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) của nấm sợi Linh
chi…………………………………………………… ………………… 21


2.2.6. Nội dung 6. Phân tích chỉ tiêu tổng VSV gây bệnh 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………… 34
3.1. Nội dung 1. Kết quả nghiên cứu hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi
sinh vật sử dụng………………………… 34
3.1.1. Lactobacillus sp. ………………………… 34
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái………………………… 34
3.1.1.2. Đặc điểm sinh lý………………………… 34
3.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa………………………… 35
3.1.2. Bacillus subtilis………………………… 36
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái………………………… 36
3.1.2.2. Đặc điểm sinh lý………………………… 36
3.1.2.3. Đặc điểm sinh hóa
………………………… 37
3.1.3. Nấm Linh chi………………………… 37
3.1.3.1. Hình thái………………………… 38
3.1.3.2. Định tính các chất có hoạt tính sinh học 38
3.1.3.3. Ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của
B.subtils
……………… ………… 39
3.2. Nội dung 2. Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật 40
3.2.1. Hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis theo thời gian 40
3.2.1. Hoạt tính enzyme protease của B.subtilis theo thời gian 39
3.2.3. Hoạt tính enzyme cellulase của nấm Linh chi theo thời gian 40
3.3. Nội dung 3. Chế biến sản phẩm 41

IV
3.3.1. Xử lý nguyên liệu 41
3.3.1.1. Thí nghiệm 3.1: xay mịn okara 41
3.3.1.2. Thí nghiệm 3.2: xác định độ ẩm của nguyên liệu 42
3.3.1.3. Thí nghiệm 3.3: khả năng biến tính nguyên liệu của một số tác nhân 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 61

V
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
HCSH Hoạt chất sinh học
ADI
Acceptable daily intake
Liều dùng hàng ngày chấp nhận được
CBTP Chế biến thực phẩm
SP Sản phẩm
FDA
Food and Drugs Administration
Tổ chức thuốc và thực phẩm
BHT Butyl hydroxy toluen VI
DANH SÁCH BẢNG
SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG
1.1. Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi 11
2.1.
Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát
triển của B.subtilis
17

3.1. Khuẩn lạc Lactobacillus sp. 34
3.2. Tế bào Lactobacillus sp. 34
3.3. Khả năng làm đông tụ sữa của Lactobacillus sp. 34
3.4. Kết quả định tính acid lactic 34
3.5. Thử nghiệm catalase 35
3.6. Thử nghiệm oxidase 35
3.7. Thử nghiệm nitratase 35
3.8. Thử nghiệm khả năng lên men glucose 35
3.9. Khuẩn lạc B.subtilis 36
3.10. Tế bào B.subtilis 36
3.11. Thử nghiệm catalase 37
3.12. Thử nghiệm nitratase 37
3.13. Phản ứng thủy phân tinh bột 38
3.14. Phản ứng thủy phân casein 38
3.15. Hình thái nấm sợi Linh chi 38
3.16. Định tính saponin - phản ứng Liebermann-Burchard 38
3.17. Định tính alkaloid 39
3.18. Định tính steroid - phản ứng Salkowki 39
3.19. Vòng phân giải CMC 39
3.20. Vòng kháng vi khuẩn B.subtilis của nấm Linh chi 39
3.21. Bột okara trước khi xay 41
3.22. Bột okara xay khô có bổ sung BHT 41
3.23. Bột okara xay ướt có bổ sung BHT 41
3.24. Bột okara xay ướt không bổ sung BHT 41
3.25. Sản phẩm 1 - phomai nấu 45
3.26. Sản phẩm 2 – phomai Linh chi 45 VIII
DANH SÁCH ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ

của sản phẩm theo thời gian 47
3.10. Sự biến đổi hàm lượng đường tổng của sản phẩm theo thời gian 48
3.11. Sự biến đổi hàm lượng đường khử của sản phẩm theo thời gian 48
3.12. Sự biến đổi hàm lượng lipid của sản phẩm theo thời gian 49
3.13. Sự biến đổi chỉ số peroxide của sản phẩm theo thời gian 49

1
MỞ ĐẦU

Bã đậu nành (okara) là phần bã và các chất dinh dưỡng khác không tan trong
nước, còn lại sau khi đã tách khỏi dịch các chất tan hoặc huyền phù trong nước của
công nghiệp sản xuất sữa đậu nành hay đậu hũ, chứa một lượng lớn protein,
carbohydrate, lipid, có cả calci, sắt, riboflavin. Tuy nhiên, trong việc xử lý okara để bổ
sung vào thực phẩm hay để chế biến thực phẩm từ okara thường gặp một số khó khăn
như thành phần protein trong okara rất cao (t
ừ 30-40%), chủ yếu là protein không tan
nên tạo cảm giác khó chịu về cơ học khi nhai và làm khó ăn. Hàm lượng xơ chủ yếu là
xơ không tan với thành phần chính là xơ tinh thể trong bã đậu nành khá cao tạo cảm
giác nhám, cứng do đó khó nuốt khi ăn. Vì vậy để dễ chế biến thực phẩm từ okara phải
giảm lượng xơ không tan, thủy phân protein thành dạng dễ tan, tăng tỷ lệ peptide và
đường khử.
Bên cạnh đó sinh kh
ối của một số loại VSV được dùng để xử lý okara (tơ nấm
Linh chi, B.subtilis, vi khuẩn lactic) có khả năng sinh tổng hợp các enzyme
peroxydase (hoặc catalase), polyphenoloxydase… có thể làm giảm lượng và hoạt tính
của các chất oxy hóa ở nơi chúng tồn tại. Mặt khác có thể cũng vì lý do này nên ở
phần ruột già các VSV yếm khí phân hủy xơ có thêm điều kiện để hoạt động mạnh hơn

khác (cơ học và hóa học) trong chế biến các loại thực phẩm mới từ các phụ phế liệu
của công nghiệp chế biến thực phẩm từ đậu nành.
Nội dung:
+ Giải quyết hiện tượng oxy hoá trong quá trình xử lý okara để chế biến thực
phẩm. Chọn các đi
ều kiện thích hợp nhất để chống oxy hóa cho sản phẩm được chế
biến từ okara.
+ Thủy phân okara bằng các enzyme thương phẩm.
+ Thủy phân okara bằng sinh khối B.subtilis (nguyên liệu được dùng là mẫu sau
khi được thủy phân bằng enzyme thương phẩm).
+ Biến tính toàn diện okara
Okara sau khi được xử lý cơ học và được thủy phân bằng enzyme cellulase
thương phẩm (celluclast), được dùng để chế biến thực phẩm bằng phương pháp vi
sinh.
+ Nghiên cứu các giống VSV dùng để chế biến thực phẩm từ okara bằng
phương pháp vi sinh (Lactobacillus sp., B.subtilis, Ganoderma lucidum.) về đặc điểm
hình thái và khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học.
+ Chế biến 2 sản phẩm từ okara đã được biến tính toàn diện bằng phương pháp
lên men VSV có bổ sung gia vị.
+ Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh của nguyên liệu và của sản phẩm
+ Phân tích ATVSTP của sản phẩm (định lượng VSV có hạ
i tạp nhiễm)
+ Nghiên cứu thời gian bảo quản và hiện tượng thoái hóa chất lượng sản phẩm.
+ Đánh giá cảm quan sản phẩm
+ Xác lập các tiêu chuẩn chính của sản phẩm
nghiên cứu
+ Chọn giống nấm sợi phù hợp nhất để
dùng làm vỏ bọc sinh học cho sản phẩm
- Chế biến 2 sản phẩm từ okara
+ Sản phẩm “phomai” nấu
+ Sản phẩm “phomai” có vỏ bọc sinh
học
- Nghiên cứu thời gian bảo quản sản
phẩm
- Phân tích sinh hóa (đạm, đường,
béo…)
- Đánh giá cảm quan s
ản phẩm
- Kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh
- Xử lý cơ học okara bằng máy xay chà
2 mặt đá
+ Xay khô
+ Xay ướt
(có và không có bổ sung BHT)
- Xử lý sinh học nguyên liệu okara
+ Với enzyme celluclast
+ Với B.subtilis
- Xử lý hóa học okara
+ Với muối kiềm
+ Với CaO
+ Với muối polyphosphate
+ Với chitosan
- Nghiên cứu vi sinh
+ Vi khuẩn lactic Lactobacillus
+ Vi khuẩn B.subtilis

1.1. Okara
Bã đậu nành (tên tiếng Nhật là okara và “okara” đã trở thành thuật ngữ quốc tế
để gọi bã đậu nành) còn gọi là “soy-pulp” (sẽ gọi tắt là okara) là phần bã và các chất
dinh dưỡng khác không tan trong nước còn lại sau khi đã tách khỏi dịch các chất tan
hoặc huyền phù trong nước của công nghiệp sản xuất sữa đậu nành hay đậu hũ. Okara
là thứ bã màu trắng hay trắng ngà, thường nằm trên mặt lưới lọc sữa đậu nành, sau khi
sấy khô có màu vàng
|8
| Nhiều người không nhận ra rằng phần bã này là một sản phẩm
giàu dinh dưỡng, rất giàu xơ tan và xơ không tan, cũng như chứa một lượng lớn
protein, lipid…
|
27|

Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g):
|
27|

Năng lượng: 77kcal, protein: 3.22g, béo tổng số: 1.73g, béo bão hòa: 0.193g,
béo 1 nối đôi: 0.295g, béo nhiều nối đôi: 0.755g, tro: 0.88g, carbohydrate: 12.54g, Ca:
80mg, Fe: 1.30mg, Mg: 26mg, P: 60mg, K: 213mg, Na: 9mg, Zn: 0.56mg, Cu: 0.2mg,
Mn: 0.4mg, Se: 10.6mcg, Thiamin: 0.02mg, Riboflavin: 0.02mg, Niacin: 0.1mg,
Pantothenic acid: 0.088mg, Vitamin B6: 0.115mg.
Okara tươi, mới có thể được dùng ngay hay có thể giữ 2-3 ngày trong tủ lạnh
hoặc hơn 4-5 tháng nếu đông lạnh.
Tuy nhiên, phần lớn thợ làm đậu hũ ở Nhật thường bỏ okara hoặc thải cho trại
nuôi heo. Ở Thụy Sĩ, okara được dùng nuôi bò.
|8|
Bột okara khô có giá trị ở Nhật, Châu Á nhờ lợi ích về dinh dưỡng của nó.
Okara tươi hoặc khô được dùng để chế bíên nhiều loại thức ăn mềm, mịn với nước

nghiên cứu dùng nấm sợi của
các loại nấm lớn (Linh chi (Ganoderma lucidum), Bào ngư (Pleurotus florida)) xử lý
okara để chế biến bánh bistcuit, trà túi lọc
Lê Chiến Phương và CTV (2004)
|15|
xử lý okara bằng nấm mốc Mucor và vi
khuẩn lactic. Ngô Đại Nghiệp dùng Asp.oryzae chế biến okara thành tương xay
|14|
. Lại
Mai Hương và CTV dùng enzyme kết hợp với phương pháp cơ học xử lý cellulose

5
trong okara để sản xuất chế phẩm giàu chất xơ bổ sung vô một số thực phẩm
|8|
. Chưa
có sản phẩm nào trong số các sản phẩm nêu trên được triển khai sản xuất thử ở quy mô
công nghiệp.
Điều này cho thấy ở Việt Nam ngay cả nơi có sản xuất okara ở quy mô công
nghiệp, hiện đại như công ty sữa Việt Nam, loại phụ phế liệu đậu nành này vẫn chưa
được tận dụng có hiệu quả vào các mục đích khác ngoài thức ăn chăn nuôi.
1.2. Các tác nhân hóa học và sinh họ
c
Trong sản xuất chế biến thực phẩm, phụ gia có tác dụng làm tăng độ giòn, dai,
thơm, tươi, chống vi sinh vật tạp nhiễm khiến người ăn cảm thấy ngon hơn và bảo
quản được lâu hơn. Nhưng thời gian gần đây, do thiếu hiểu biết thậm chí cố ý, một số
nhà sản xuất đã dùng thái quá cả một số loại phụ gia trôi nổi trên thị trường không
được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm như formol, hàn the… Những chất này
gây tác hại trước mắt và lâu dài đến sức khỏe người dùng
|13|
. Vì thế việc ứng dụng các


6
những sản phẩm ăn kiêng có chứa chitosan để làm giảm cholesterol, giảm cân nặng,
chống béo phì (bánh mì, khoai tây chiên…). Năm 1983, FDA chấp nhận chitosan được
dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm và dược phẩm.
1.2.2. Muối kiềm và muối polyphosphate
Muối polyphosphate rất tốt cho cơ thể người. Theo các nghiên cứu gần đây cho
thấy muối polyphosphate cũng có tác dụng tương tự như hàn the trong việc làm dai
thực phẩm nhưng không gây độc hại cho sức khỏe con ng
ười.
Muối kiềm tốt nhưng nếu sử dụng nhiếu sẽ làm cho sản phẩm có độ pH cao, tạo
vị oi nồng, gắt cho sản phẩm, không tốt về mặt cảm quan.
1.2.3. Butyl hydroxy toluen (BHT)
BHT là chất chống oxy hóa được Bộ Y tế cho phép sử dụng trong thực phẩm ở
mức ADI: 0-0,125
|21|
. BHT thường được bổ sung trong dầu mỡ (giới hạn tối đa cho
phép 75mg/kg), magarin (giới hạn tối đa 100mg/kg).
1.2.4. Enzyme cellulase
|11|
- Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật và chúng được thực vật tổng hợp
với số lượng nhiều nhất trong tự nhiên. Cellulose cũng là một trong những chất hữu cơ
có trong tự nhiên chỉ bị vi sinh vật phân giải. Thực hiện quá trình phân giải cellulose
trong điều kiện tự nhiên là các loại enzyme cellulase, được các nhà khoa học phân ra
làm ba nhóm chủ yếu:
• 1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91). Enzyme cắt đầu không khử
của chuỗi cellulose
để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có các tên khác
như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và
avicellase. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà

7
Xơ không tan
|17, 23|
: loại xơ này chiếm khoảng 2/3 lượng xơ trong thực phẩm.
Chủ yếu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose, lignin, cutin… Chất xơ không hòa
tan có đặc tính thẩm thấu nước trong ruột, trương lên tạo điều kiện cho chất bã thải dễ
thoát ra ngoài.
• Cellulose: là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, được cấu tạo bởi
các β-D glucose-pyranose, các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết
glycoside. Cellulose không tan trong nước (cả nước nóng và nước lạ
nh), tan trong
acid và kiềm. Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose sẽ chuyển thành
glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo nên disaccharide
cellobiose. Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì không tiêu
hóa được ở ống tiêu hóa. Động vật nhai lại có thể tiêu hóa dễ dàng cellulose vì
trong ruột của chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme cellulase là
enzyme thủy phân cellulose.
• Hemicellulose: là nhóm polysaccharide không tan được trong nước, chỉ tan được
trong dung dịch kiềm. Hemicellulose cũng là thành phần c
ủa thành tế bào thực vật
và tồn tại chủ yếu ở các phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu. Khi thủy phân
hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose (như manose,
galactose) và nhóm pentose (như arabinose, xilose). Trong thiên nhiên, loại
hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ…
Xơ tan
|17,23|
: gồm pectin, β-glucan, galactose, mannan, gum… Chất xơ hòa tan
khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất dinh dưỡng
vào máu, và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa.
• Pectin: là polysaccharide có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây. Trong thực vật, pectin

ở trong ruột, chất xơ còn tạo môi trường có tính khử cao, chống lại các chất oxy hóa,
chất độc phát sinh trong quá trình chuyển hóa thức ăn ở đại tràng.
Chất xơ còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ. Với những
phụ nữ có chế độ ăn nhiều chất xơ, ít chất béo và đạm thì nguy cơ ung thư vú có liên
quan đến oestrogen giảm đáng kể. Ở những trẻ em gái có chế
độ ăn như vậy, tuổi xuất
hiện kinh nguyệt cũng muộn hơn và vì thế sẽ ít bị ung thư vú hơn khi trưởng thành.
- Giảm mỡ máu: khi các chất xơ không hòa tan hút nước, chúng giữ luôn một
phần muối mật nên kích thích cơ thể tăng cường sản xuất muối mật để bù vào lượng
thiếu hụt, vì thế mà tăng sử dụng cholesterol. Lượng cholesterol tích lũy sẽ giảm
đi
kéo theo lượng cholesterol trong máu cũng giảm. Còn các chất xơ hòa tan tác động lên
quá trình chuyển hóa lipid nên giảm nguy cơ xơ vữa động mạch. Các chuyên gia
khuyên rằng những người bị tăng cholesterol máu nên tăng lượng chất xơ trong khẩu
phần hằng ngày.
- Phòng ngừa và điều trị tiểu đường: chất xơ làm hạn chế tăng đường huyết sau
khi ăn (nhất là các chất xơ hòa tan) do có khả năng tăng tính nhạy c
ảm của insulin. Nó
tham gia chuyển hóa triglycerid nên giúp kiểm soát nồng độ đường trong máu một
cách hiệu quả. Đường sẽ được giải phóng từ từ vào máu, duy trì được nồng độ
đường/máu một cách ổn định. Đây chính là mục đích của việc phòng ngừa và kiểm
soát bệnh tiểu đường.
- Chống béo phì: chất xơ không có giá trị dinh dưỡng nên chỉ tạo cảm giác no
mà không tăng lượng calo cho cơ thể. Vì thế, nó rất l
ợi cho những người bị béo phì.
Mặt khác, do chất xơ có thể hạn chế và kiểm soát lượng đường trong máu nên không
tạo ra tình trạng thừa đường để chuyển hóa thành mỡ dự trữ. Ngay trong quá trình tiêu
hóa thức ăn, cả chất xơ hòa tan và không hòa tan đều làm tăng tốc độ vận chuyển thức
ăn trong ruột, hạn chế được sự hấp thu các chất dinh dưỡng nên cũng hạn chế tăng cân.
- Điề

9
bào tử. Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm
lên men chua)… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh
học.
1.4.1.2. Hệ enzyme của Bacillus subtilis
• Hệ enzyme protease
|11, 25|

B. subtilis được nuôi trên môi trường lỏng để kích thích việc sinh tổng hợp
enzyme protease (trung tính và kiềm). Điều kiện tối ưu cho việc sinh tổng enzyme
protease là : nồng độ cơ chất: 0,5%, thời gian ủ: 30 giờ, nhiệt độ ủ: 40
o
C, pH: 7, dung
dịch đệm: đệm phosphate, môi trường dinh dưỡng: nước chiết thịt bò có bổ sung muối,
nguồn C: lactose, nguồn N: (NH
4
)
2
SO
4
, nguồn acid amin: valine; các acid hữu cơ như
acid acetic, acid lactic, acid citric ở các nồng độ khác nhau có thể làm giảm khả năng
sinh tổng hợp protease. Enzyme protease được tinh sạch bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
và
màng lọc sephadex G200.

vi trùng gây bệnh.
- Người ta cũng thường thu
α
- amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp
dệt để tách hồ tinh bột trên vải từ B. subtilis.
Chế phẩm amylase từ vi khuẩn B. subtilis được thay thế đại mạch nảy mầm
(malt) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột.
Amylase của B. subtilis chỉ được tạo thành ở giai đoạn đã hoặc đang kết thúc
quá trình sinh trưởng, bền nhiệt hơn so với enzyme của n
ấm mốc.
- Các enzyme thủy phân protein được tìm thấy ở khắp nơi, trong tất cả các sinh
vật sống, quan trọng cho sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào. Mặc dù có nhiều loài vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng chỉ có vài loài sinh tổng hợp được
enzyme protease có giá trị thương mại, trong đó B.subtilis có vai trò nổi bật trong các
ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, sữa, dược, dệt.
Protease là một trong những nhóm enzyme công nghiệp quan trọ
ng nhất, chiếm
gần 60% tổng lượng enzyme được bán ra, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy

10
rửa khô, sản xuất các loại thuốc tiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng hay do
tác nhân virus
|25|
.
1.4.2. Lactobacillus
|22|

1.4.2.1. Giới thiệu
Tế bào hình que ngắn, thường có kích thước 0,5 – 1,2 x 1 – 10µm, đôi khi có
dạng hình cầu kết thành chuỗi ngắn. Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm

khỏe. Khái niệm “probiotics” được biết vào đầu thập kỷ 1900, cho đến năm 1965,
thuật ngữ này chính thức được Lilly và Stillwell sử dụng. Probiotics là những vi sinh
vật sống mà khi được đưa vào cơ thể người hay động vật, nó có những tác động có lợi
lên sức khỏe vật chủ và làm tăng khả năng hoạt động hệ vi sinh vật của vật chủ
(Havenaar và Huis in’t Veld, 1992)
Mộ
t số loài vi sinh vật được sử dụng như probiotics là: Lactobacillus
acidophilus, L.plantarum, L.casei, L.casei subsp. rhamnosus, L.delbrueckii subsp.
bulgaricus, L.fermentum, L.reuteri, Lactococcus lactis subsp. lactis, Bifidobacterium
bifidum. B.infantis, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Enterococcus
faecalis, Saccharomyces boulardii. (Nguồn: Conway, 1996)
 Một số ứng dụng khác
Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir,
phomai,
Ứng dụng trong muối chua rau quả: bắp cải muối, dưa chuột muối…
Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi.
Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại mu
ối lactate.
Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp
chất dẻo, công nghiệp thực phẩm.

11
Lactate calci là loại dược phẩm bổ sung calci dưới dạng dễ hấp thu, lactate sắt
dùng để chữa bệnh thiếu máu, lactate đồng dùng làm dung môi…
1.4.3. Nấm Linh chi
1.4.3.1. Đặc tính sinh học
|16|
Nấm Linh chi đã nổi tiếng từ ngàn xưa ở các nước Á Đông, phiên âm theo tiếng
Trung Quốc gọi là Lingzhi, theo tiếng Nhật là reishi, ở Việt Nam thì hay gọi là nấm
Lim. Nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác như: Bất lão thảo, Vạn niên nhung, Mộc

đặc biệt là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP), đã được xác định chính
xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi. Có thể khái quát trong bảng
sau:
Bảng 1.1. Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi
Hoạt chất Nhóm Hoạt tính dược lý
Cyclooctasulfur Ức chế giải phóng histamine
Adenosine dẫn xuất Nucleotide Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn
cơ, giảm đau
Lingzhi-8 Proteine Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa
miễn dịch
*** Alcaloid Trợ tim
Ganodosterone Steroide Giải độc gan
Lanosporeric acid A Steroide Giảm cholesterol
Lanosterol Steroide Ức chế sinh tổng hợp
II, III, IV, V Steroide Giảm cholesterol

12
Ganoderans A, B, C Polysaccharide Hạ đường huyết
Beta-D-Glucan Polysaccharide Chống ung thư, tăng tính miễn dịch
BN-3B: 1, 2, 3, 4 Polysaccharide
D-6 Polysaccharide Tăng tổng hợp protein, tăng chuyển
hóa acid nucleic
*** Polysaccharide Trợ tim
Ganoderic acids R, S Triterpenoid Trợ tim
Ganoderic acids B, D, F,
H, K, Y
Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE
Ganoderic acids Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol
Ganodermadiol Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE
Ganodermic acids Mf Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

cúm để nâng cao sức kh
ỏe.
1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn
Trong việc xử lý okara để bổ sung vào thực phẩm hay để chế biến thực phẩm từ
okara thường gặp một số khó khăn chính như sau:
 Vì thành phần protein trong okara rất cao (từ 30-40%), chủ yếu là protein không
tan (lượng protein tan hầu hết đã được dùng làm sữa đậu nành). Đây là thành phần
chính tạo nên giá trị của okara. Chính thành phần protein không tan này tạo cảm giác
khó chịu v
ề cơ học khi nhai và làm khó ăn vì sau khi bị sấy khô protein không tan rất

13
khó trương nước để mềm trở lại, dù được nấu sôi lâu, kỹ, nhất là ở pH acid. Điều này
cũng gây khó khăn trong việc chế biến không chỉ các thực phẩm từ okara mà cả những
thực phẩm khô từ protein đậu nành.
Để khắc phục nhược điểm đó, đề tài đã sử dụng các nhóm tác nhân như muối
kiềm, hệ enzyme của các vi sinh vật để xử lý okara. Ngoài ra còn có một phát hiệ
n mới
có lợi trong trường hợp này: B.subtilis có thể sinh tổng hợp một loại dịch nhớt trong
quá trình sống, làm cơ chất nhão ra, giảm được độ cứng cố hữu.
 Hàm lượng xơ chủ yếu là xơ không tan với thành phần chính là xơ tinh thể
trong bã đậu nành khá cao, từ 9,0 – 19,0% tạo cảm giác nhám, cứng do đó khó nuốt
khi ăn. Vì vậy để dễ chế biến thực phẩm từ okara phả
i giảm lượng xơ không tan và
biến tính một phần thành xơ tan và đường khử.
Nghiên cứu của Vũ Văn Độ và CTV (2004) đã nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi và
Bào ngư (là 2 loại nấm hoại gỗ có hoạt tính enzyme phân hủy xơ cao nhất trong số
những loại nấm ăn được) trên cơ chất okara sau đó sấy khô và nghiền thành bột mà
không dùng sinh khối tươi sống.
Nghiên cứu của Lê Chiến Phương và CTV (2004) đã nuôi sinh kh

mong đạt được kết quả toàn diện hơn trong việc xử lý 2 thành phần chủ yếu và cũng là
khó khăn nhất của okara là protein không tan và xơ thô.
 Ngoài giá trị dinh dưỡng cao (giàu protein, lipid) và khả năng hỗ trợ tiêu hóa
(nhiều xơ) thì giá trị về thực phẩm chức năng của các nguyên liệu và sản phẩm từ
okara chưa được chú ý giữ gìn và nâng cao đúng m
ức.

14
 Trong okara hàm lượng chất béo còn khá cao (9,0-22,0%) mà phần lớn chất béo
của đậu nành là không no và nhiều nối đôi. Trong quá trình chế biến từ đậu nành hạt
tới okara thô đã có một số công đoạn làm tăng khả năng oxy hóa chất béo (ngâm, xay
các kích cỡ hạt, lọc…) Vì vậy trong quá trình xử lý tinh tiếp theo để ngăn chặn và
giảm bớt hiện tượng oxy hóa phải tiến hành xử lý chống oxy hóa ngay từ đầu.
 Phát hiện kh
ả năng chất xơ (cellulose) có thể đóng vai trò của chất chống oxy
hóa nhờ bản thân chất xơ có tính khử. Mạch phân tử cellulose càng ngắn, hoạt tính khử
chung của khối lượng xơ cố định càng cao vì đầu mạch có tính khử tăng.
 Bên cạnh đó sinh khối của một số loại VSV được dùng để xử lý okara (tơ nấm
Linh chi và các loại nấm sợi khác, B.subtilis, VK lactic và propionic) có khả năng
sinh t
ổng hợp các enzyme peroxydase, (hoặc catalase), polyphenoloxydase… có thể
làm giảm lượng và hoạt tính của các chất oxy hóa ở nơi chúng tồn tại.
 Mặt khác có thể cũng vì lý do này nên ở phần ruột già các VSV yếm khí phân
hủy xơ có thêm điều kiện để hoạt động mạnh hơn do đó xơ được phân hủy nhiều hơn,
tạo thêm dinh dưỡng cho cơ thể.
Trong trường hợp này xơ và các enzyme chống oxy hóa đóng vai trò prebiotic
(tạo đ
iều kiện phù hợp cho các VSV có sẵn trong đường ruột hoạt động mạnh hơn).
 Các sản phẩm từ okara có chứa sinh khối VK B.subtilis, lactic, nấm sợi Linh
chi. Một phần của sinh khối B.subtilis là những bào tử có sức chịu đựng cao trong

sử dụng
2.2.1.1. Nghiên cứu hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Lactobacillus sp.
 Quan sát hình thái bằng phương pháp nhuộm Gram
|4, 5|

Nguyên tắc:
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và
iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là:
Vi sinh vật có màu tím đậm là Gram dương.
Vi sinh vật có màu hồng, đỏ nhạt là Gram âm.
Cách tiến hành:
- Làm vết bôi trên lame
- Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa
trôi thuốc nhuộm dư với nước.
- Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước.
- Tẩ
y màu bằng cồn 96
o
từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận
nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm
chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước.
- Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và để yên trong vòng 30 giây. Rửa với nước.
- Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới
kính hiển vi với vật kính dầu x100.
 Phương pháp định tính acid lactic

Nguyên tắc:
- Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Ufermen sẽ đổi màu từ xanh tím sang màu
vàng.
Cách tiến hành: