SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM CÁC
TÝP HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS)
Ở PHỤ NỮ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : TS.BS Vũ Thò Nhung BV Hùng
Vương
CƠ QUAN PHỐI HP CHÍNH :
1.Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG-HCM, Khoa Sinh học,
bộ môn Vi sinh-sinh học phân tử
2.Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, Khoa Y, bộ môn Vi sinh.
CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI :
Sở Khoa Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội Đồng nghiệm thu đề tài ngày
15/9/2006)
B) XÉT NGHIỆM TẦM SOÁT HPV……………………………………………………………… 16
CHƯƠNG II : ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ………………………. 21
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ………………………………………………………………………………………………………………. 39
CHƯƠNG IV : BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………………………………………. 50
KẾT LUẬN…………………………………………………………………………………………………………………… ……………………… 58
ĐỀ NGHỊ ………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………………………………………………. 60
PHỤ LỤC ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65 iiiDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASCUS Atypical squamous cells of undetermined significance
CIN
Cervical Intraepithelial Neoplasia
CIN1 grade 1
Cervical Intraepithelial Neoplasia

CIN2 grade 2
Cervical Intraepithelial Neoplasia

CIN3 grade 3
Cervical Intraepithelial Neoplasia

CNV Công nhân viên
CTC Cổ tử cung

CIN2 Dò sản vừa
CIN3 Dò sản nặng
HSIL Tổn thương trong thượng mô gai mức độ cao
IARC Cơ quan nghiên cứu Ung thư Thế giới
LSIL
Tổn thương trong thượng mô gai mức độ thấp
Pap Phết tế bào âm đạo – cổ tử cung
WHO Tổ chức Y tế Thế giới v DANH MỤC CÁC BẢNG

Hình Tên hình Trang 1 Cấu trúc, hình dạng HPV 4
2 Cấu trúc bộ gene của HPV 5
3 Bộ gene HPV dạng mạch thẳng 7
4 Sự tiến triển của tổn thương cổ tử cung do HPV 11
5 Chu kỳ sống của HPV 12
6
Quy trình phát hiện và đònh type HPV 17
7 Quy trình tầm soát tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 19

1
Mở đầu

Ung thư cổ tử cung là bệnh lý phổ biến, đứng hàng thứ ba trong số các ung thư

âm hộ, âm đạo và dương vật cũng như một số ung thư vùng hầu họng. Người ta phân
biệt các týp có nguy cơ thấp ít khi làm tiến triển đến ung thư và các týp nguy cơ cao
thường gây ung thư. Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu dòch tễ học mang tính đại
diện được tiến hành trên đề tài này.
Như vậy , việc tìm hiểu về tình trạng nhiễm các genotýp HPV ở phụ nữ là vấn đề
rất đáng quan tâm vì nhờ đó có thể góp phần tiên lượng khả năng diễn tiến bệnh khi

2
chưa tiến đến ung thư để các Bác só lâm sàng có thể có thái độ xử trí thích hợp , có lợi
cho ngươi bệnh Đó là lý do chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát tình hình
nhiễm các týp HPV (Human Papilloma Virus) ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh
bằng kỹ thuật sinh học phân tử”
Mục tiêu nghiên cứu :
• Mục tiêu tổng quát :
Nghiên cứu dòch tễ học các genotýp HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ
tuổi 18-69.
• Mục tiêu chuyên biệt :
1.Xác đònh tỉ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi 18-69.
2.Xác đònh tỉ lệ nhiễm các týp HPV nguy cơ cao.
3.Xác đònh mối tương quan giữa hình ảnh tế bào học, mô bệnh học với các týp
HPV.
4. Đánh giá xét nghiệm PCR chẩn đoán và đònh týp HPV.
lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao
chép. Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chòu trách
nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion. Khi đó, capsid chứa DNA tế
bào chủ được gọi là Virion giả hay Pseudovirion
[14]
.
4

Hình 1: Cấu trúc, hình dạng HPV
2. Bộ gen HPV
2.1. Cấu trúc bộ gen của HPV
Đó là một DNA mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại ở dạng siêu xoắn hình vòng,
chứa khoảng 7800-8000 cặp base, có 10 khung đọc mở ORF
[22]
. Sự sao chép, phiên
mã xảy ra trên một mạch và theo một chiều duy nhất.
Bộ gen được phân làm 3 vùng
[22]
:
• Vùng điều hoà URR (Upstream Regulatory Region) hay cũng còn gọi
là vùng điều hoà dài LCR (Long Control Region): chiếm 10% chiều
dài bộ gen, chứa khoảng 800-1000 cặp base tùy từng týp. Đây cũng
là vùng biến động nhất trong bộ gen HPV. Trình tự vùng URR bao
gồm:
o Trình tự tăng cường: là nơi gắn của các nhân tố phiên mã (AP-
1, NF1, oct 1, TEF1, TEF2, YY1 …).
o Promoter (gen khởi động) cho sự phiên mã tổng hợp RNA

u khiển sự sao
chép và biểu hiện
gen của virus
Protein
capsid
Sự sao chép
của virus
Phóng thích HPV

Protein tín hiệu màng
Sự biểu hiện gen
6
thấp, E2 tăng cường sự phiên mã, nhưng ở nồng độ cao, nó lại ức chế sự phiên mã. Sự
chèn DNA virus vào bộ gen của vật chủ thường làm gián đoạn gen E2 làm ảnh hưởng
tới khả năng ức chế sự biểu hiện protein E6, E7.
2.2.3. Gen E4:
Gen E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò trợ giúp trong sự trưởng thành
và phóng thích HPV ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ.
2.2.4. Gen E5:
Để có thể xâm nhập và tồn tại trong tế bào chủ, HPV sẽ rất cần đến sản
phẩm protein E5 do gen này sản xuất. Protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu
của sự xâm nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của nhân tố tăng trưởng
và biệt hóa, từ đó kích thích sự phát triển của tế bào. Mặt khác, protein E5 còn có vai
trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào khi có sự sai
hỏng DNA do chính virus gây ra.
2.2.5. Gen E6:
Gen này mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thư,


Nguồn: Expert Reviews in Molecular Medicine

Hình 3: Bộ gen HPV dạng mạch thẳng8
yếu và không gắn với DNA. Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lượng
phân tử 49-60 kDa, lại được phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA.

Hiện nay, xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) và lai DNA là
những phương pháp ít tốn công nhất và có thể dùng thường qui trong phòng xét
nghiệm để tìm HPV. HPV gồm hơn 100 týp, Vò trí xâm nhập và khu trú đầu tiên là
vùng thượng bì (tầng trên của lớp biểu mô), chủ yếu ở những biểu mô sừng hoá hay
những biểu mô gai vì HPV có tính hướng rất cao với tế bào biểu mô da và niêm mạc,
nhất là ở những vùng niêm mạc ẩm ướt, nhầy
[44]
.chúng có thể gây những tổn thương u
nhú dạng mụn cóc thường lành tính ở thanh quản, da tay, chân, niêm mạc miệng, bộ
phận sinh dục .Tuy nhiên, có một số týp thường kết hợp với ung thư. Nhiễm HPV là
một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất. Có trên 30 týp
lây truyền từ người sang người qua quan hệ tình dục. Người ta chia HPV ra làm 2
nhóm : nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp. Những nhóm nguy cơ cao thường có
mối liên hệ với bệnh ung thư cổ tử cung.
3. Dòch tễ học của HPV
Hầu hết các trường hợp nhiễm HPV không có triệu chứng. Đó là lý do tại
sao số trường hợp mắc bệnh không được ghi nhận. Ngoài ra, những xét nghiệm tầm
soát HPV cũng mới được thực hiện nên những báo cáo về các trường hợp bệnh mới
mắc thường thấp hơn thực tế. Vì vậy, dự đoán về số ca mới hàng năm vào khoảng
900.0000 người. Theo thống kê có được thì có vào khoảng 269 triệu phụ nữ trên thế

và những dạng dễ thay đổi. Được xếp vào týp phụ khi bộ gen của chúng khác nhau 2-
10% trong cùng 1 týp đã biết. Nếu sự khác nhau chiếm 1-2% nằm trong vùng mã hóa,
hoặc 5% trong vùng không mã hóa thì được xem là dạng dễ thay đổi. Mỗi týp có một
sự thích nghi cao với một loại biểu mô nhất đònh. Ví dụ như týp 1, 2, 3, 10, 27 …
thường gây bệnh ở da, còn týp 16, 11, 18 … lại chủ yếu tấn công cơ quan sinh dục
người. Điều này phụ thuộc vào cách tác động khác nhau của những vùng gen khác
nhau ở mỗi týp đối với protein bao phủ tế bào chủ tại những vò trí khác nhau trên cơ
thể
[19,44]
. Người ta xác đònh có đến hơn 38 týp HPV xâm nhiễm tế bào biểu mô gai ở
vùng cơ quan sinh dục người. Trong đó, phổ biến nhất là các týp 6, 11, 16, 18, 42, 43,
44, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56. . .
[22]

Tùy thuộc vào khả năng dẫn đến ung thư (tạo khối u ác tính) người ta chia
các týp HPV làm 2 nhóm:

10
• Nhóm “nguy cơ thấp” (low-risk): những týp HPV thuộc nhóm này chỉ
gây những mụn cóc hoặc khối u lành tính. Bộ gen của chúng tồn tại độc
lập với tế bào chủ. Các týp HPV trong nhóm nguy cơ thấp thường gặp là
:
 L1 : 6, 42,43,81
 L2 : 11, 61,70,71
• Nhóm “nguy cơ cao” (high-risk): bao gồm những týp có khả năng gắn
xen DNA của chúng vào bộ gen của người, gây ra những rối loạn hình
thành các khối u ác tính. Mối liên quan giữa HPV và ung thư cổ tử cung
được nói đến lần đầu tiên vào những năm 70. Những yếu tố nguy cơ
chính là týp HPV (16, 18, 31, 45), lớùn tuổi và mức độ tổn thương cổ tử
cung

trong 93-100% các trường hợp carcinom tế bào gai ở cổ tử cung. Một số týp gây nên
những u nhú quanh bộ phận sinh dục, hậu môn thường gọi là bệnh mào gà
(condylomata acuminatum) đó là týp 6, 11 thường xuất hiện vài tuần hoặc nhiều
tháng tế bào nhân to, nhiều thùy nhiều năm sau khi tiếp xúc. Khảo sát vi thể các tổn
thương gây ra do HPV cho thấy lớp tế bào bề mặt có hình ảnh nghòch sừng
(dyskeratosis), cận sừng (parakeratosis)ù và những tế bào rỗng (koilocyte) có nhân to,
đa nhân, tăng sắc là đặc trưng của tế bào nhiễm HPV
[25]
.
Loại ung thư cổ tử cung thông thường nhất là ung thư tế bào gai và thường do
HPV 16,18. Ung thư tế bào tuyến thì ít , chủ yếu có liên quan đến HPV 18
[25]
.

12
Sự tiến triển của bệnh
Niêm mạc
bình thường
Nhiễm HPV;
Tế bào rỗng
CIN I
Tổn thương thượng mô gai mức
độ thấp (LSILs)
CIN II
CIN III
Tổn thương thượng mô gai mức
độ cao (HSILs)
Carcinoma
Tầm soát
Điều trò

những tế bào đáy này là rất cao. Sau đó, chính sự làm lành lặn ở chỗ vết trầy xướt
này bằng việc kích thích sự phân chia những tế bào đáy sẽ dẫn đến làm tăng nhanh
thêm sự sao chép của HPV trong tế bào chủ vì đây là giai đoạn mà HPV chỉ sao chép
được khi tế bào chủ sao chép. Chính vùng dễ bò tổn thương nhất trong cơ quan sinh
dục trở thành nơi phổ biến nhất cho virus phát triển.
Giai đoạn tiềm ẩn:
Đây là giai đoạn có sự xâm nhiễm của HPV nhưng các kỹ thuật xét nghiệm
tế bào học, hình thái học, soi phóng đại đều cho kết quả tế bào bình thường. Chỉ
Chu trình sống HPV

Xâm nhiễm
Các tế bào biểu
mô phát tán virus.Virus được
“đóng gói”
Tế bào
bình
thường

DNA virus tồn
tại trong tế bào
dạng episome
Lớp tế bào
đáy
Thành lập
Papilloma
nguyên vẹn. Chỉ khi có những tổn thương tế bào (do cọ xát hay hóa chất điều trò) làm
lộ HPV cho hệ miễn dòch nhận diện. Khi đó, hệ thống miễn dòch sẽ được hoạt hóa và
tấn công các tế bào bò nhiễm, khởi đầu là hoạt động của các đại thực bào
(macrophages), bạch cầu đơn nhân (monocytes)… Chúng sẽ giải phóng các cytokine
như interferon α, β, γ, interleukine… Interferon có tác dụng làm chậm sự phát triển
của virus, làm giảm những sản phẩm xâm nhiễm của chúng. Cytokine thì tấn công
như là một tác nhân hóa học bằng những phần tử dính kết lên tế bào cạnh mạch máu,
kêu gọi bạch cầu đến tiêu diệt vùng bò nhiễm.
Kết quả của tất cả những hoạt động này là sự gia tăng cytokine của những tế
bào langerhan hay tế bào nhánh (dendritic) . Tế bào dendritic hoạt động di chuyển
qua mạch lymphô đến vùng hạch lympho, nơi mà chúng thể hiện kháng nguyên HPV
lên bề mặt để lympho T nhận diện. Khi đó sẽ hình thành các dòng lympho T đặc hiệu
HPV, chúng di chuyển theo dòng máu đến vùng bò nhiễm. Đầu tiên, chúng sẽ tiếp cận
các tế bào nội mô trong những mạch máu bên dưới vùng rối loạn do HPV gây ra
thông qua phân tử dính kết trên bề mặt kháng nguyên, từ đó, theo sự khác biệt nồng
độ cytokine qua thành mạch máu vào bên trong biểu mô nhiễm HPV. Tế bào T đặc
hiệu và tế bào giết tự nhiên (natural kill cell) sẽ vào bên trong những mụn cóc, tiêu
diệt tế bào bò nhiễm HPV. Bạch cầu đơn nhân và đa nhân sẽ tiêu huỷ những mảnh
vụn tế bào, bao gồm cả DNA của HPV. Sự liên kết những yếu tố này giúp làm giảm
kích thước mụn cóc, làm sạch vùng bò nhiễm. Tế bào T đặc hiệu sẽ trở thành tế bào
nhớ ngăn chặn sự xâm nhiễm trở lại.
Sau khoảng 9 tháng, bệnh nhân được chia thành 2 nhóm: hết bệnh hoặc bệnh
vẫn tiếp diễn. Tuy nhiên ở những bệnh nhân hết bệnh, khả năng hết hoàn toàn HPV

16
và khả năng HPV quay lại giai đoạn tiềm ẩn là không xác đònh được, nên vẫn phải
tiếp tục theo dõi và hạn chế lây nhiễm. Còn ở những bệnh nhân không thuyên giảm
thì khả năng chuyển sang ung thư ác tính là cực kỳ cao.
6. Những yếu tố nguy cơ nhiễm HPV :
 Hành vi quan hệ tình dục : số bạn tình, bạn tình bò nhiễm HPV, mắc


Thực hiện PCR
Mồi MY11/09
(Bauer & cs, 1992)

Điện di

Mẫu dương tính
Giải trình tự
kiểm chứng
Thực hiện PCR
đánh dấu DIG
Thực hiện ELISA
đònh group
Thực hiện PCR
đònh týp

18
 Tình hình nghiên cứu trên thế giới :
Một số kỹ thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được phát
triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của DNA HPV trong tế bào cổ tử cung. Các
kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác đònh được các týp và phân biệt các thương tổn
cổ tử cung không liên quan đến HPV. Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc
hiệu cao, được phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09-MY11
(Bauer & cs, 1992) và hệ GP5+-GP6+ (Snijders & cs, 1990). Các hệ primer này được
thiết kế dựa trên trình tự gen L1, cho phép phát hiện sự hiện diện của nhiều týp HPV
trong bệnh phẩm.
Nhằm xác đònh chính xác các týp HPV hiện diện trong mẫu khảo sát, nhiều
công trình sử dụng phối hợp các bộ mồi consensus và mồi đặc hiệu týp trong phản
ứng nested PCR (Harwood & cs, 1999
[9]

[9]
dùng phản ứng nested PCR; Nelson
&cs (2000)
[21]
phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzym giới hạn.
Tháng 4/2002 Hiệp hội Soi cổ tử cung và Bệnh học cổ tử cung của Mỹ
(American Society for Colposcopy and Cervical Pathology) đã đưa ra hướng dẫn lâm
sàng khuyến cáo thử HPV-DNA cho những phụ nữ có kết quả Pap test không xác
đònh. Các tác giả Hàn quốc (Lee và Seo 2002)
[13]
tầm soát ung thư cổ tử cung theo 3
giai đoạn : tầm soát ban đầu, trong quản lý bệnh nhân có tế bào học bất thường ở mức
độ thấp, và trong theo dõi sau điều trò những tổn thương tiền ung thư nêu ra thử
nghiệm HPV-DNA có độ nhạy cao hơn tế bào học kinh điển bởi vì nó đánh giá chính
tình trạng nhiễm HPV. Các tác giả Đức (Petry & cs 2003)
[18]
đưa xét nghiệm HPV-
DNA vào tầm soát thường quy ung thư cổ tử cung ở phụ nữ trên 29 tuổi chứng tỏ
HPV-DNA có giá trò trong việc tầm soát hay loại trừ tân sản trong biểu mô cổ tử
cung (CIN).

Kết quả HPV và PAP

HPV (-) HPV (+) HPV (-) HPV (+) PAP
PAP (-) PAP (- ) ASC-US ASC-US ≥
≥≥
≥ LSIL