BỘ Y TẾ
BÁO CÁO
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Tên đề tài:
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ XÂY DỰNG KIT ĐỂ
CHẨN ĐOÁN CÁC LOÀI KÝ SINH TRÙNG CHỦ YẾU Ở
VIỆT NAM Chủ nhiệm đề tài
PGS.TS LÊ THANH HÒA
Cơ quan chủ trì đề tài
BỘ Y TẾ
thể, đặc biệt là ở đường ruột, tồn tại ở dạng trưở
ng thành hoặc/và các dạng đang phát
triển khác. Một số loại KST nói trên còn có giai đoạn tồn tại phát triển tại vật chủ trung
gian (cá, ốc, cua, tôm) duy trì nguồn gen ký sinh. Nếu sử dụng các phương pháp truyền
thống là hình thái học hoặc/và huyết thanh học để chẩn đoán xác định, thì sẽ có nhiều
lúc chưa chính xác, đặc biệt có một số KST gây bệnh có biểu hiện bệnh lý tương tự
nhau, có hình thái gần giống nhau hoặc đ
ang ở trong vật chủ trung gian ở dạng ấu trùng
(metacercaria) rất khó phân biệt. Bất kỳ ở đâu, đơn hay đa nhiễm, dạng trứng, ấu trùng
hay trưởng thành, riêng rẻ hay lẫn lộn (ví dụ: trong đường ruột gồm trứng/con trưởng
thành của nhiều loại khác nhau; hay tập hợp metacercaria trong cá/cua/tôm), KST đều
cung cấp nguồn gen đích làm khuôn cho phản ứng phát hiện gen đặc hiệu của từng loài.
Multiplex-PCR, một loại hình chẩn đ
oán phân tử đa gen và đa mồi, ứng dụng phát hiện
cùng lúc gen đặc hiệu của nhiều loài, sẽ cho kết quả chính xác từng loài KST gây bệnh
để có hướng chẩn đoán nhanh nhất, tiết kiệm nhất, điều trị và phòng chống đúng đắn
nhất. 2
Đề tài cấp Bộ: “Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kit để chẩn đoán các
loài ký sinh trùng chủ yếu ở Việt Nam”, đã được Bộ Y tế phê duyệt, cấp kinh phí, cho
thực hiện trong giai đoạn 2010 – 2011, với một số chủ đích như sau:
Mục tiêu chung của đề tài: Có được các bộ kit chẩn đoán đa gen đối với một số
ký sinh trùng thường gặp.
Cụ th
ể:
1. Xây dựng được kit sinh học phân tử chẩn đoán và phân biệt đối với ký sinh
trùng thường gặp trên người ở Việt Nam là sán lá gan lớn (fascioliasis), sán lá gan nhỏ
(clonorchiasis), sán lá ruột nhỏ (haplorchiasis), sán lá phổi (paragonimiasis), sán dây và
được các kit multiplex-PCR chẩn đoán ký sinh trùng đăng ký trong đề tài: 2 loài sán lá
gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), 2 loài sán lá gan lớn (Fasciola 3
gigantica; F. hepatica), 2 loài sán lá phổi (Paragonimus heterotremus; P. ohirai), 2
loài sán lá ruột nhỏ (Haplorchis taichui; H. pumilio), 3 loài sán dây/ấu trùng sán lợn
(Taenia solium; T. saginata; T. asiatica). Gen đích chủ yếu tập trung vào chỉ thị phân
tử hệ gen ty thể
, dựa vào dữ liệu nucleotide của toàn bộ hệ gen ty thể sán lá gan nhỏ
(Clonorchis; Opisthorchis); của sán lá gan lớn Fasciola spp; của sán lá ruột nhỏ
Haplorchis spp; và của sán lá phổi Paragonimus spp.
Cơ sở dữ liệu gen/hệ gen ty thể có thể tìm thấy tại GOBASE (xem:
/>) (O’Brien et al., 2009), bao gồm nhiều dữ liệu do
chúng tôi và đồng nghiệp xây dựng (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006). Mặt khác,
nhiều dữ liệu gen/hệ gen ty thể được cập nhật trong quá trình thực hiện đề tài của sán lá
ruột nhỏ Haplorchis spp (Le et al., chưa công bố; De and Le, 2011). Sử dụng chỉ thị
phân tử ty thể từ nguồn dữ liệu này, các bộ kit đã được nghiên cứu và thực hiện.
Tám bộ kit
đã được xây dựng, đó là:
i) Bộ kit số 1, ký hiệu bộ kit A(Cs+Ov), 2 loài: Giữa sán lá gan nhỏ Clonorchis
sinensis và Opisthorchis viverrini;
ii) Bộ kit số 2, ký hiệu bộ kit B(Fg+Fh), 2 loài: Giữa sán lá gan lớn Fasciola
hepatica và F. gigantica;
iii) Bộ kit số 3, ký hiệu bộ kit C(Ht+Hp), 2 loài: Giữa sán lá ruột nhỏ Haplorchis
taichui và H. pumilio;
iv) Bộ kit số 4, ký hiệu bộ kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg), 4 loài: Giữa sán lá gan nhỏ
C. sinensis và
O. viverrini và sán lá gan lớn F. gigantica và F. hepatica;
v) Bộ kit số 5, ký hiệu bộ kit AC(Cs+Ov+Hp+Ht), 4 loài: Giữa sán lá gan nhỏ
ế thế giới.
Sự bùng nổ/tái xuất/đa nhiễm/kháng thuốc/đột biến của nhiều loài KST gây bệnh đã đặt
ra yêu cầu cần có nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác, kinh tế và tiết
kiệm thời gian (Hotez et al., 2008; King, Bertino, 2008).
Một số đối tượng KST thường gặp gây bệnh ở Việt Nam gồm các loài truyền lây
từ động vật sang người qua thức ăn (foodborne trematodes/cestodes), là đối tượng để
xây dựng kit chẩn đoán multiplex-PCR thuộc phạm vi đề tài này. Hơn nữa, các đối
tượng nghiên cứu ở đây thuộc loại tồn tại trong thức ăn (cá, cua, tôm) và có nhiều dạng
sinh trưởng tồn tại trong ruột (trứng, sán trưởng thành), rất thuận lợi cho việc phát hiện
phân tử bằng kit PCR đa mồi.
1.1.2 Một số bệnh thường gặp là đối tượng nghiên cứu của đề tài
1.1.2.1 Sán lá gan nhỏ và bệnh sán lá gan nhỏ
Sán lá gan nhỏ làm đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 2 loài. Clonorchis
sinensis phân bố ở Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và phía
Đông nước Nga. Opisthorchis viverrini phân bố ở Đông Nam Châu Á, gặp trên người
Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam, Campuchia và Trung Quốc. Bệnh thường gặp nhất
và có vai trò dịch tễ học quan trong nhất của châu Á và thế giới là bệnh sán lá gan nhỏ 5
(clonorchiasis/opisthorchiasis) do C.sinensis và Opisthorchis viverrini gây ra. Một điều
đặc biệt hết sức lưu ý là O. viverrini và C. sinensis được coi là yếu tố tham gia tích cực
trong cơ chế tiến triển gây ung thư biểu mô túi mật (cholangiocarcinoma) với gần như
100% tử vong ở người (Sripa, 2007). Xu hướng phân bố của cả hai loài này là ở châu Á,
trong đó C. sinensis là ở vùng Đông – Bắc và O. viverrini ở vùng Đông – Nam của châu
Á. Việt Nam là vùng địa lý có sự tồ
n tại cả hai loài, cho đến nay, C. sinensis phát hiện ở
các tỉnh phía Bắc đến Nghệ An; O. viverrini phát hiện ở các tỉnh miền trung và phía
A
B
A
B
A
B
A
B6
khoảng 600 µm, đường kính của mồm hút phía sau khoảng 500 µm. Ống tiêu hoá chạy
dọc hai bên thân. Lỗ sinh dục ở gần mồm hút vùng giữa. Tinh hoàn chia nhánh gần
chiếm hết phía thân sau. Buồng trứng ở khoảng giữa thân, tử cung là một ống ngoằn
nghèo gấp khúc (Hình 1.1A). Trứng sán C. sinensis thường có hình bầu dục hoặc hình
bóng đèn điện, màu vàng nâu, kích thước trung bình khoảng (27 x 15) µm (Hình 1.1B).
Số lượng trứng C. sinensis đẻ hàng ngày phụ thuộc vào vậ
t chủ và thời gian nhiễm.
Sán lá gan nhỏ O. viverrni trưởng thành còn sống màu trong suốt và có màu hồng
hoặc màu đỏ, đầu phía trước nhỏ có hấp khẩu miệng nằm gần tận cùng, một hấp khẩu
bụng hình chén nằm ở mặt bụng, khoảng 1/5 về phía trước cơ thể. Kích thước trung
bình của sán trưởng thành dài 7,4 mm (5,5 – 9,55 mm) và rộng 1,47 mm (0,77 – 1,65
mm) (Hình 1.2A). Trứng của sán lá gan nhỏ O. viverrini và C. sinensis rất giống nhau,
khó phân biệt về hình thái. Trứng hình oval hay bóng
đèn, màu vàng nhạt, có nắp nhô
lên, kích thước trung bình (27 – 15 µm) ( Hình 1.2B).
1.1.2.2. Sán lá gan lớn và bệnh sán lá gan lớn
Bệnh sán lá gan lớn là bệnh chung của người và gia súc chủ yếu do hai loài
2004; Itagaki et al., 2005; Le et al., 2008; Mas-Coma et al., 2009). Toàn bộ hệ gen ty
thể của F. hepatica và F. gigantica đã được giải mã (Le et al., 2001; 2002) cũng như rất
nhiều chuỗi ITS-2 trong Ngân hàng gen cung cấp dữ liệu quan trọng và chính xác để
thẩm định loài của quần thể Fasciola spp (xem Le et al., 2008).
Hình 1.3. Sán lá gan lớn F. hepatica trưởng thành (A), F. gigantica trưởng thành (B) và trứng sán
Fasciola spp trên tiêu bản thu nhận bằng phương pháp Kato-Katz (B).
Sán lá gan lớn trưởng thành hình chiếc lá, thân dẹt, bờ mỏng, kích thước 20-30 x
10-12 mm, màu trắng hồng hoặc xám đỏ; ở người, sán ký sinh trong đường mật, bất
thường có thể ký sinh lạc chỗ như trong cơ bắp, dưới da, phúc mạc (Le et al., 2007;
2008) (Hình 1.3A,B). Sán lá gan trưởng thành tồn tại 2 thể: nhị bội (diploid) và tam bội
(triloid), đẻ trứng theo đường mật xuống ruột và ra ngoài theo phân. Trứng có dạng hình
oval thường chụm lại với nhau (Hình 1.3C). Trứng xuống nước, nở
ra ấu trùng lông
(miracidium), khi nhiệt độ thích hợp (15 - 25°C), trong vòng 9 - 21 ngày. Miracidium
tiếp tục ký sinh trong ốc thuộc giống Lymnaea và phát triển thành ấu trùng đuôi
(cercaria), sau đó cercaria rời khỏi ốc và bám vào các thực vật thủy sinh để tạo nang
trùng (metacercaria) hoặc bơi tự do trong nước (khoảng 1 giờ). Người hoặc trâu bò ăn
phải thực vật thủy sinh hoặc uống nước lã có ấu trùng này sẽ bị nhiễm sán lá gan lớn
(Mas-Coma et al., 2005; 2009; Ashrafi et al., 2006). Metacercaria vào vật chủ
chính qua
đường miệng, thoát kén, xuyên thành ruột, xuất hiện trong ổ bụng, tiếp tục xuyên vào
gan, đến gan vào ngày thứ 6 sau khi thoát kén, sau đó chúng di hành đến ký sinh trong
Hình 1.4. Sán lá ruột nhỏ trưởng thành và trứng của H. pumilio (A); Sán trưởng thành và trứng của H.
taichui (B).
Haplochis spp. là loài sán lá ruột nhỏ để hoàn thành vòng đời chúng phải trải qua
nhiều loài vật chủ phức tạp (vật chủ chính, vật chủ trung gian) nên thường ít được quan
tâm (kể cả y tế, thú y và thủy sản). Sán trưởng thành ký sinh ở ruột, đẻ trứng và trứng
theo phân ra ngoài, rơi vào môi trường nước, trứng nở ra ấu trùng lông chui vào ốc để
A
B
A
B9
phát triển thành ấu trùng đuôi. Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi
phát triển thành nang trùng rồi ký sinh ở trong thịt hoặc mang của cá (mắt thường khó
nhìn thấy). Người hoặc động vật ăn phải cá có ấu trùng nang chưa được nấu chín, ấu
trùng này chui vào dạ dày, đến ruột phát triển thành sán trưởng thành và ký sinh tại đây.
1.1.2.4. Sán dây và ấu trùng sán lợn
Dịch tễ, bệnh học, chẩn đoán và đi
ều trị sán dây và ấu trùng sán lợn trên toàn thế
giới đã được nghiên cứu khá đầy đủ (Hoberg, 2006). Họ sán dây Taeniidae Ludwig,
1886 có rất nhiều loại, gồm các loài thuộc giống Taenia; giống Multiceps; giống
Echinococcus. Trong đó, quan trọng nhất là giống Taenia với sán dây lợn T. solium và
ấu trùng sán dây lợn (cysticercosis), sán dây bò T. saginata và sán dây người T. asiatica
(Willingham, Engels, 2006; Eom, 2006). Taenia có người là vật chủ chính duy nhất và
vật chủ trung gian là trâu bò (T. saginata) và lợn (T. solium và T. asiatica) là một trong
nh
dày, màu sẫm, nhân có vết móc (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010).
d) Ấu trùng sán lợn: Bệnh ấu trùng sán lợn (cysticercosis) ở người do ăn phải
trứng sán dây lợ
n, ấu trùng chủ yếu ký sinh ở cơ vân, cơ tim, trong não, trong mắt, dưới
da. Nang ấu trùng hình bầu dục, màu trắng đục, chứa dịch trắng đục và đầu sán với 4
giác bám và 2 vòng móc. Ấu trùng sán lợn ở lợn có kích thước 0,3 mm sau gây nhiễm 6
ngày; kích thước 6 – 9 mm sau gây nhiễm 60 – 70 ngày; kích thước 8 – 15 mm sau gây
nhiễm 177 – 325 ngày. Nang ấu trùng sán lợn khi ký sinh ở người có kích thước to hơn
khi ký sinh ở lợn, nang dưới da kích thước từ 0,5 x 1,5 – 2 mm, có nang sau hàng chục
năm phát triển tới kích thước 10 – 15 cm và chứa 50 ml dị
ch (Nguyễn Văn Đề, Lê
Thanh Hòa, 2010).
Bệnh sán dây/ấu trùng sán lợn phân bố rải rác nhiều nước trên thế giới với
khoảng 100 triệu người nhiễm bệnh, bắt đầu tăng mạnh vào những năm 1980. Một số
quốc gia ở châu Âu có số ca mắc cao là Tây Ban Nha, Mexico. Hình 1.5. Sán dây trưởng thành (A) và trứng của sán dây bò T. saginata (B).
Hiện nay, tại Việt Nam, theo báo cáo từ các nhà khoa học đã phát hiện có ít nhất
51 tỉnh, thành có ca bệnh sán dây/ấu trùng sán lợn, bao gồm các tỉnh Lai Châu, Lào Cai,
Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Bắc Cạn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Lạng Sơn,
Tuyên Quang, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên, Bắc Giang, Ninh Bình,
Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ
An, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Đăk Lăk, Khánh Hòa,
Lâm Đồng, Bình Thuận, Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Bình Dương, thành phố Hồ
AB
là loài P. westermani phát hiện trên vật chủ trung gian (Doanh et al., 2009). Như vậy
cho đến nay, ít nhất có 4 loài, trong đó có một loài (P. heterotremus) gây bệnh trên
người tại Việt Nam. Do đặc điểm địa lý, Việt Nam có thể còn có một số loài gây bệnh
trên người khác cần phát hiện, kể cả P. westermani và P. ohirai (Doanh et al., 2009).
Sán lá phổi trưởng thành dài 8 – 16 mm, chiều ngang 4 – 8 mm, dày 3 – 4 mm,
có màu nâu đỏ, có thể thấy bằng mắt thường và rất giố
ng như một hạt cà phê (Hình 1.5).
Trứng sán rất nhỏ và có nắp, màu sẫm, dài từ 80 – 100 cm, chiều ngang từ 50 – 67 cm,
chỉ phát hiện được dưới kính hiển vi (Hình 1.5). 12
Hình 1.6. Sán lá phổi trưởng thành (A); và trứng của sán (B) (Nguồn: CDC).
Sán lá phổi trưởng thành thông thường khu trú ở phổi của ký chủ ký sinh cuối
cùng là các loài có vú, trong đó có người, chủ yếu là ở các nước châu Á, một số nước
Nam Mỹ và vài nước châu Phi. Ước tính có khoảng 20 triệu người bị nhiễm sán phổi
(Toscano et al., 1995) ngày nay có thể trên 30 triệu (Blair et al., 2005). Loài quan trọng
nhất gây nhiễm hàng chục triệu người ở châu Á là P. westermani Kerbert, 1878, tiếp
đến là P. skrjabini Chen, 1959 và P. heterotremus Chen and Hsia, 1964. Cho đến nay,
có nhiều các bài viết đề cập đến sán lá ph
ổi với nhiều khía cạnh khác nhau của sán phổi
(Paragonimus) và bệnh sán phổi (paragonimiasis), do tầm quan trọng ngày càng lớn của
loại ký sinh trùng này và có trên 1000 công trình nghiên cứu về sán phổi được công bố
n chẩn đoán (của cùng loài hay khác loài), nếu
sản phẩm PCR thu được có kích thước chênh lệch nhau, thì khi hiển thị sản phẩm trên
agarose, rất dễ dàng đánh giá phân biệt (Deng et al., 2000; Kaderali, 2007). Nhờ những
lợi thế đó, multiplex-PCR đã chứng tỏ là phương thức chẩn đoán phân tử tiết kiệm thời
gian, công sức, nguồn khuôn từ bệnh phẩm, đa dụng, phát hiện đa bệnh, dễ làm, tiện ích
(Edwards, Gibbs, 1994; Elnifro et al., 2000). Chính vì vậy, ngày nay, chẩn
đoán phân tử
dựa trên cơ sở chuỗi nucleotide (DNA và RNA) bằng kỹ thuật đa mồi PCR (đối với
khuôn là DNA) hoặc/và RT-PCR (đối với khuôn là RNA), kể cả kỹ thuật định lượng
nguồn gen (real-time PCR) đã được ứng dụng, trong đó có phân tích gen/hệ gen, phân
tích đa hình, chẩn đoán và phân tích nhiễm sắc thể, chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh, ký
sinh trùng, nấm, vi khuẩn, độc tố, kháng thuốc, định lượng RNA, đánh giá chất l
ượng
sản phẩm, xác định sinh vật chuyển gen và nhiều mục đích khác (Deng et al., 2000;
Kubista et al., 2006; Ono et al., 2007; De Lellis et al., 2008).
1.2.2. Những điều kiện với multiplex-PCR được lưu ý khi thực hiện đề tài
1.2.2.1. Điều kiện về mồi
Sử dụng trong multiplex-PCR ít nhất có số lượng từ 3 mồi (primer) trở lên, nhiều
trường hợp có vài cặp mồi trong cùng một phản ứng. Do vậy, mồi thiết kế phải tuân thủ
một số điều kiện :
i) Có kích thước khoảng 20 – 24 nucleotide, tỷ lệ (%) GC trong tổng số
nucleotide của mồi chiếm khoảng 40 – 60%, để đảm bảo tính bắt cặp (pairing) với
khuôn được tốt ; nhiệt độ nóng chảy của mồi không quá 65
o
C và chênh lệch không quá
4 – 6
o
C (ví dụ : trong 4 mồi sử dụng, mồi có nhiệt độ chênh lệch thấp nhất cho phép là
55
Khi vùng gen đích của một đối tượng có thể có đột biến (đứt đoạn hoặc thêm vào) trong
tế bào, thì nguồn khuôn tổng số sẽ chứa 2 hay nhiều vùng đích khác nhau cho
multiplex-PCR. Do vậy, rất có thể hoặc số lượng băng DNA sẽ giảm, hoặc số lượng số
băng ước tính không thay đổi, nhưng hàm lượng DNA của một số băng DNA thay đổi.
1.2.2.4. Số l
ượng chu kỳ multiplex-PCR
Số lượng chu kỳ để thực hiện multiplex-PCR cũng cần xác định để sử dụng, vì
nếu số chu kỳ quá nhiều, số lượng DNA sinh ra sẽ bị bão hoà, do vậy, hàm lượng DNA
của mỗi băng DNA sẽ khác nhau và cũng có trường hợp một số băng DNA biến mất
hoặc một số khác xuất hiện. Một số phản ứng PCR ngược (RT-PCR) đa năng s
ử dụng
nguồn khuôn là RNA (bao gồm RNA của hệ gen hay RNA thông tin), cũng giống như
multiplex-PCR sử dụng nguồn khuôn là DNA, rất phụ thuộc vào số lượng khuôn ban
đầu. Nếu số lượng chu kỳ thực hiện, điều kiện phản ứng không chuẩn hoá, thì kết quả
sinh ra sẽ không phản ánh trung thực thực tế.
1.2.2.5. Hiệu suất multiplex-PCR
Phản ứng multiplex-PCR cùng lúc có thể cho kết quả phát hiện ít nhất 2 gen đích
cần chẩn đoán, do vậy, multiplex-PCR tiết kiệm nguồn khuôn, thời gian, kinh phí, hoá
chất so với sử dụng đơn lẻ từng phản ứng PCR (uniplex-PCR). Tính hiệu quả kinh tế 15
còn ở chỗ chỉ cần một lần tách chiết DNA tổng số làm khuôn, hoặc được sử dụng riêng
rẽ với các cặp mồi tìm kiếm vùng đích trên một khuôn này; hoặc trộn lẫn nhiều khuôn
để thực hiện multiplex-PCR với nhiều cặp mồi tìm kiếm vùng đích trên một hay nhiều
khuôn có trong một phản ứng.
1.2.2.6. Kích ứng và tăng cường multiplex-PCR
Do có nhiều thành phần, đặc biệt là khuôn DNA tổng số có th
ể không được tinh
khiết 100%, lẫn một số vết protein hoặc chuỗi xoắn kép của khuôn có nhiều cấu trúc
KST trong vật chủ trung gian). Đối tượng cung cấp khuôn DNA chẩn đ
oán còn là thể
cộng sinh/ký sinh trong KST (ví dụ: Wolbachia pipientis cộng sinh trong nematode), 16
hoặc các gen “độc” của các loài gây bệnh chuyển nạp vào vi khuẩn thông qua plasmid,
cũng như các gen kháng thuốc hỗn hợp trong việc phát hiện đa kháng. Đây cũng là các
tính độc đáo có hiệu quả và là lợi thế của chẩn đoán multiplex-PCR mà không có
phương pháp nào đối sánh được.
iii) Chẩn đoán bằng kit đa gen (multiplex PCR) có tính chính xác rất cao, đặc biệt
có thể phân biệt một lúc nhiều loài ký sinh trùng nhiễm phối hợp trong cùng một bệnh
phẩm, thể hiện tính ưu việt trong ứng dụng.
iv) Cho đến nay, ở Việt Nam, phương pháp multiplex-PCR, còn rất ít được ứng
dụng. Một số bệnh ở người, ở động vật lây sang người, bệnh mới nảy sinh ở Việt Nam,
bệnh gây thiệt hại nặng nề đối với sức khoẻ và nền kinh tế mà lẽ ra nếu được chẩn đoán
sớm sẽ tránh
được rủi ro, thiệt hại và lây lan. Áp dụng chẩn đoán multiplex-PCR ở Viêt
Nam trên một số bệnh giun sán thường gặp và tiếp tục thực hiện trên các loại hình bệnh
tật khác ở người và động vật truyền sang người sẽ là loại hình mới ứng dụng trong thực
tế.
Từ những năm 2000 đến nay, nhiều nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng bằng
hình thái học kết hợp thẩm định bằng sinh họ
c phân tử và phát triển kit chẩn đoán để
xác định một số loài sán lá, sán dây chủ yếu ở Việt Nam. Kết quả bước đầu đã có hàng
chục công trình nghiệm thu và hàng trăm bài báo đăng tải trên tạp chí, tuy nhiên, vẫn
còn rất ít các kit multiplex-PCR xây dựng và ứng dụng. Một số kit chẩn đoán virus và vi
khuẩn đã có kết quả thành công nhất định, trong đó cũng có những phát triển kit chẩn
đoán phân biệt ký sinh trùng (Le et al., 2006).
Đối với KST, cho đế
dạng trùng Babesia caballi và B. equi
ở động vật (Alhassan et al., 2005).
Multiplex-PCR còn được ứng dụng chẩn đoán lỵ amíp do khả năng phát hiện nhanh,
chính xác phân biệt các loài gây bệnh với nhiều loài khác có hình thái tương tự, trước hết là
Entamoeba histolytica và Entamoeba dispar từ phân người bệnh (Haque et al., 2007).
1.4. CÁC LOẠI UNI-, MULTIPLEX-PCR VÀ CHỌN LỰA GEN ĐÍCH TRONG
NGHIÊN CỨU
1.4.1. Các loại PCR
Được sử dụng nhiều nhất là loại phản ứng multiplex-PCR sử dụng nhiều cặp
mồi, mà mỗi cặp phát hi
ện đặc hiệu mỗi một gen đích với độ nhạy cao, nhưng nhờ sản
phẩm PCR thu được có kích thước khác nhau, do vậy, khi điện di trên thạch agarose các
sản phẩm phân biệt dễ dàng ứng với mỗi loài đích cần chẩn đoán (Deng et al., 2000).
Nghiên cứu phát triển multipex-PCR theo hướng này, đòi hỏi thiết kế mồi và thử/kiểm
nghiệm phản ứng phải hết sức chuẩn xác (Kaderali et al., 2007).
PCR đơn
mồi (uniplex-PCR) sử dụng một cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên một
nguồn khuôn từ một loại KST; PCR đa mồi (multiplex-PCR) sử dụng nhiều cặp mồi (ít
nhất 3 mồi trở lên), tìm kiếm sản phẩm trên nhiều vùng đích khác nhau của cùng một
khuôn; hoặc của nhiều nguồn khuôn khác nhau; do đó cùng lúc chẩn đoán, phát hiện 18
nhiều gen của nhiều loại KST khác nhau. Tuỳ theo số lượng gen đích cần chẩn đoán mà
multiplex-PCR được chia làm các loại là duplex-PCR, phát hiện 2 vùng đích; triplex-
PCR, phát hiện 3 vùng đích; quadruplex-PCR, phát hiện 4 vùng đích; pentaplex-
PCR, phát hiện 5 vùng đích; hexaplex-PCR, phát hiện 6 vùng đích và có thể nhiều hơn
(Edwards, Gibbs, 1994; Kaderali, 2007). Nói chung, khi sử dụng hơn một cặp mồi để
phát hiện 2 vùng đích trở lên, đều gọi là PCR đa mồi và loại hình multiplex-PCR này
chính là ph
AC
BC
Taeni a
(solium)
Taeni a
(saginata)
Ta enia
(asiatica)
D
Paragonimus
(heterotremus)
Paragonimus
(westermani)
E
PHÂN, CHẤT THẢI ĐƯỜNG RUỘT (STOOL)
ĐỜM, CHẤT THẢI
ĐƯỜNG HÔ HẤP
(SPUTUM)
Hình 1.7. Các bộ kit multiplex-PCR dự kiến xây dựng giữa các giống và loài; và giữa các loài trong cùng giống.
A. Giữa C. sinensis và O. viverrini; B Giữa F. gigantica và F. hepatica; C. Giữa H. taichui và H. pumilio; D.
Giữa T. solium, T. saginata và T. asiatica; E. Giữa P. heterotremus và P. westermani; AB. Giữa C. sinensis, O.
viverrini và Fasciola spp; AC. Giữa : C. sinensis, O. viverrini và Haplorchis spp; BC. Giữa Fasciola spp và
Haplorchis spp.
19
Các loài KST đã lần lượt được giải mã gen/hệ gen ty thể và đăng ký vào Ngân
hàng gen thế giới ()
một số loài khác. 20
Chương 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu là các loài KST được thu thập có định hướng dịch tễ và hình
thái học (Bảng 2.1), thông qua hợp tác đề tài với:
- Bộ môn Ký sinh trùng, Trường Đại học Y Hà Nội;
- Khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng và Côn trùng Qui Nhơn;
- Viện Thú y trung ương và một số cơ sở khác.
Bảng 2.1. Các loài sán lá sán dây được sử dụng trong nghiên cứu của đề tài
Loài Ký hiệu
Dạng mẫu
Nguồn gốc
C. sinensis CsND
SLG nhỏ trưởng thành
Nam Định (Việt Nam)
C. sinensis CsHB
SLG nhỏ trưởng thành
Hòa Bình (Việt Nam)
O. viverrini OvQT
SLG nhỏ trưởng thành
Quảng Trị (Việt Nam)
O. viverrini OvBD
SLG nhỏ trưởng thành
Bình Định (Việt Nam)
F. hepatica FhAUS
đây và không mô tả kết quả.
Hợp tác với quốc tế, cụ thể Trường Đại học Y khoa Kochi, Nhật Bản (GS.TS
Takeshi Agatsuma); Trường Đại học Khon Kaen, Thái Lan (PGS.TS Banchob Sripa;
PGS.TS Paiboon Sithithaworn); Trường Đại học Seoul, Hàn Quốc (PGS.TS Min-Ho
Choi; GS.TS Sung-Tae Hong), trong nghiên cứu.
Mẫu thu thập ở dạng sán trưởng thành, trứng và metacercaria, phần lớn bảo quản
trong cồn 70%, một số thu tươi và vận chuyển trong đá lạnh về phòng thí nghiệm. Mẫu
sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý. Mẫ
u được cho vào cồn 70
o
C hoặc dạng tươi
và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi sử dụng.
21
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị phục vụ nghiên cứu
+ Máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D).
+ Máy PCR (PTC-100) của MJ. Research Inc (Mỹ).
+ Máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), có kèm theo máy vi tính.
+ Máy tính và các phần mềm tin – sinh học.
+ Thiết bị dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hãng Bio-Rad.
+ Máy ổn nhiệt, máy lắc có điều nhiệt để nuôi tế bào.
+ Lò vi sóng Samsung, box laminair vô trùng, tủ lạnh -20
0
C và tủ ấm (SANYO-
Nhật Bản), Máy Vortex.
+ Bộ pipetman (10µl, 20µl, 200µl, 1000µl) và đầu côn các loại, ống Eppendorf
®
Genomic DNA Extraction Kit” (hãng BIONEER, Hàn Quốc).
Nguyên lý tách chiết DNA tổng số từ mô: Mẫu sán khi xử lý được nghiền trong
bộ cối chày nhựa, để phá vỡ mô. Huyền dịch thu được gồm thành phần chính tế bào và
protein hoặc có thể có RNA nên cần phải loại bỏ chúng. Loại bỏ protein bằng cách bổ
sung proteinase-K, phá huỷ RNA bằng RNase A. Các thành phần khác của nguyên sinh
chất cần tách riêng khỏi DNA, bằng isopropanol và một số hóa chất khác, rồi thu DNA
khi cho lọc trên màng lọc tích điện d
ương.
Cách thực hiện:
Bước 1: Mẫu vật sau khi xử lý được nghiền trong bộ cối chày nhựa.
Bước 2: Thêm 200 µl dung dịch Tissue Lysis buffer (ATL) và tiếp tục nghiền
cho đến khi thành huyễn dịch đồng nhất. Bổ sung 20 µl Proteinase-K (50mg/ml), ủ
60
o
C trong 3 giờ cho đến khi mô được ly giải hoàn toàn.
Bước 3: Bổ sung 4 µl RNase-A (100mg/ml) và 200 µl dung dịch Binding buffer
(AL hoặc GC), lắc mạnh rồi ủ ở 70
o
C trong 30 phút
Bước 4: Thêm 200 µl dung dịch Isopropanol (96 – 100%), rung lắc trong 15
giây. Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 5: Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm 10.000 vòng/phút
trong 1 phút, loại bỏ phần dung dịch bên dưới.
Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa cột
lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới. 23
Bước 7: Thêm 500 µl dung dịch (Washing buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa, ly
Elution Buffer để ở nhi
ệt độ trong 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột,
giữ lại dịch bên dưới, đó chính là DNA tổng số tách được từ trứng có trong phân
Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 20
0
C cho đến khi sử dụng.
2.3.2. Thiết kế các cặp mồi
Thiết kế mồi dựa trên nguyên tắc cặp mồi nhân vùng gen cho sản phẩm có độ dài
chênh lệch nhau giữa các đối tượng chẩn đoán, để đánh giá sử dụng phương pháp điện 24
di. Cặp mồi (primer) dùng trong nhân bản DNA đích bằng phản ứng PCR được thiết kế
trên cơ sở các trình tự khác nhau khi so sánh các chuỗi của các loài với nhau.
Bảng 2.2. Thành phần nucleotide các mồi dùng trong phản ứng multiplex-PCR
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’ → 3’)
Độ dài
(bp)
Độ dài của sản phẩm
thu được
OV5F TACGCAGGTGGTTTGGTTG 19
OVN3R GCTCAATAAAGAGACCACGAAC 22
OV5F-OVN3R: 818 bp
(O. viverrini)
CSF ATACCTTTGCGTGGTGGGAG 20
CSR CATACTCAACAAGCCCAATG 20
CSF-CSR: 489 bp
(C. sinensis)
TASF GGGTTTAAGTTATAAATGTGATGT 24
(P. ohirai)
2.3.3. Thực hiện PCR đơn (uniplex-PCR) và đa mồi (multiplex-PCR)
Phản ứng PCR đơn loài (sử dụng một cặp mồi) được bố trí với dung tích là 25 µl.
Mỗi loại đều sử dụng 1 µl (10 pmol/µl) cho mỗi phản ứng. Nếu là phản ứng uniplex-
PCR, chỉ sử dụng 1 cặp mồi; nếu là duplex-PCR sử dụng 2 cặp mồi hoặc 3 mồi (có thể
có 1 mồi chung); nếu là triplex-PCR thì sử dụng 3 cặp mồi hoặc 4 mồi (có 1 m
ồi
chung) cho hỗn hợp trong cùng một phản ứng (Bảng 2.3) với chu trình nhiệt đã được
thử nghiệm (Bảng 2.4).
Khuôn DNA tổng số (50 ng/µl) được sử dụng 1 µl cho đơn loài và 2 - 3 -4 µl
DNA khuôn trộn chung cho 2 hoặc 3 loài hoặc 4 loài (1 µl cho mỗi loài) theo tỷ lệ
bằng nhau (1:1). Các thành phần khác không thay đổi, còn mồi thì tùy loại PCR (uni-,
duplex-, triplex-PCR) mà cho các mồi và điều chỉnh nước cho phù hợp dung tích 25 µl
hay 50 µl (Bảng 2.3). Thành phần được bổ sung DMSO (dimethyl sulfoxide), có tác
dụng tăng cường hoạt động củ
a phản ứng PCR và cho sản phẩm chất lượng cao
(Frackman et al., 1998).
Copyright: Tài liệu đại học ©