ĐẠI I1ỌC QUỐC GIA IIÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC K1IOA HỌC Tự NHIÊN
♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦
TÊN ĐÊ ỉ Àl
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH PROTEINAZA
THỰC VẬT VÀ n ư ớ c f)ẦU THẢM DÒ KHẢ NẢNG
ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG.
MÃ SỔ: QG -9 5 -21
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: CN. NGUYEN t h ị n e n
'■ ■■ *J< ' " y - : • ri,:
ĨK líỉ)j^AV rHCT:f;'ì.‘í r !'L' <:
Ho D T/ J Q O ^ I
■

——— —

I
HÀ NỘI, 1997.
ĐỂ TÀI
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH PROTEAZA THỤC VẬT V À Bước Đ ẦU
THÁM DÒ KHẢ NÀNG ÚNG D ỤN G CỦA CHÚNG.
SỐ ĐẢNG KÝ: QG 95 - 21
CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: CN. NGUYỄN THỊ NỀN.
CHÌ ĐẠO KH : PGS -PTS LẺ ĐÚC NGỌC
Các cán bộ phối hợp:
Võ Sỹ Hùng, Phạm Quỷ Hải, Trần Quốc Tuấn - ĐHKHTN.
BẢO CÁO TÓM TẮT
KẾT QUẢ ĐÊ TÀI NGHIÊN cúu QG - 95 - 21.
• Tên để tài: " Nghiên cứu cố định Proteinaza thực vật và bước đẩu thăm
dò khả năng ứng dụng của chúng".
• Mã số: QG - 95 -21.

- Thuê hạp đồng:
- Đánh máy, in ấn tài liệu:
- Chi khác:
4.000.000đ
3 800.000đ
525.000đ
1,970.000đ
ỌOO.OOOđ
185.000d
220.000đ
CIIỦTRÌĐlVlÀI
CN. Nguyễn Thị Nền.
Cơ QUAN QUẢN LÝ ĐH TẢI
Hà nội, ngày 30 tháng 12 năm 1998.
QUAN CIIÙ TRÌ ĐH TẢI.
J ù T ~
r
OUTLINE REPORT ON RESULTS AND REALIZATION
OF SUBJECT OF SICIENTIFIC RESEARCH
QG - 95 - 21
1. Name of subject:
Stady the immobilization of Plants Protease and the bigin to explore
their pratical applications.
2. Subject manager: Nguyen Thi Nen
3. Objectives and Sibjiect matters of study:
Study the immobilization of Plant protease and test its ability in
medical application.
4. Results achieved:
Enzymes, presented in all living cells, are thos specialized Proteins
which have catalizing functions for most of the chemical reactions in our

SƯR.ĨECT MANAGER
Nguyen Thi Nen
MỤC LỤC
1 - Phần mở đầu báo cáo chính tr. 1
2 - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: tr. 2
3 - Kết quả và thảo luận: tr. 3 - tr. 9
4 - Phần kết luận: tr.10
5- Tài liệu tham khảo: tr. 11
5- Phiếu đăng ký kết quả nghiên cứu: tr. 12 - tr. 13
MỎ ĩ ) X u
Enzim có trong mọi tế bào sống, là những Protein đặc biệt có chức năng
xúc tác cho các phản ứng hoá học trong cơ thể. Mỗi Enzim chỉ có khả năng xúc tác
cho sự chuyển hoá của một hay một số chất nhất định, theo một kiểu phản ứng
nhất đinh. Nhờ tính đặc hiệu này mà enzim đã đóng vai trò cực kỳ quan trọng
trong đời sống con người. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại
thì việc nghiên cứu enzim càng được chú trọng.
Một trong những enzim có nhiều ý nghĩa trong đời sống con người đó là
Proteaza. Proteaza xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptít. Với tính chất
như vậy Proteaza có thể thuỷ phân Protein thành các Polypeptít, Peptít và các Axit
amin. Vì thế Proteaza có nhiều ứng dụng trong đời sống , kinh tế, xã hội như :
công nghiệp dệt/ công nghiệp thực phẩm, công nghiệp thuộc da, mỹ phẩm, Y được
học v v
Các enzim nói chung và Proteaza nói riêng thường không ổn định, dễ bị thuỷ
phân và bị giảm hoạt tính do nhiệt độ, môi trường, thời gian v.v Vì thế ở một số
nước người ta đã tiến hành cố định Proteaza để giữ được lâu hoạt tính xúc tác cuả
nó, đáp ứng cho nhu cầu sử đụng Proteaza trong đời sống như ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm (thuỷ phân đậu tương, công nghệ sản xuất bia), trong Y học, chữa
vết thương, đặc biệt trong điều trị bỏng. Proteaza đã được cố định có nhiều đặc tính
im việt, có độ Ổn định cao, bảo quản và sử dụng dễ dàng. Sau đây là các ưu điểm
chính của enzim đã được cố định:

- Phương pháp liên kết cộng hoá Irị.
- Phương pháp giới hạn.
Dù sử dụng phương pháp nào thì vé nguyên lắc quá trình cố định Proteaza là quá
Irình gắn Proteaza (bằng liên kết hoá Irị hoặc liên kết vại lý) lên chat mang (các polyme,
các oxit kim loại) hoặc giữ Proteaza (rong khổng gian hẹp của lưới gel.
Trong đề tài này với mong muốn sử dụng Proteaza BĐ trong điểu Irị các vết
thương, vết bỏng thì đòi hỏi các chAÌ lĩiíing dể cỏ' định Protenza phải khổng có độc lính,
Ihấm nước và xốp để đảm bảo quá trình hổ hấp và quá Irình dào thải cầc sản pliíim cùn
quá trinh Ihuỷ phan. Hơn nữa quá Irình cố dinh Prolea/a phải dảm bảo cả vè mặt kỹ
ihuộl thì chế phẩm mới dược sử dụng rông rãi. Mặl khác dể quá (rình có kéi quả cao Ihì
cần phải đáp ứng một cách tương đói các yếu 10' sau:
1- En/im phải ổn định Irong những điểu kiện tliẽn ra phan ứng.
2- Các chnì Iham gia phản ừng lạo liên kếl ngang khổng lương tác được với những
nhóm chức năng nằin trong lílm hoại dộng của Enzitn.
3- Trong trường hựp điếu kiCn Iren khổng llụrc hiẹn dược Ihì chái tham gia phản
ứng tạo liên kếl ngang phải có kích thước 1ỚI1 để I1Ó khổng xam nhạp được vào tam hoai
động của Enzim.
4- TAm hoại dọng phải luOn được bảo vẹ.
5- Enzim dã dược gỉin len chnì mang khOng bị gAy ảnh hương xấu hởi biên pháp
rửa dể lách En/im "chưa được gắn".
6- Càn chú ý tới lính cliál cơ hục của chai mang.
3
Dựa vào những yêu cầu trẽn chúng (ôi chọn phương pháp giới hạn Proleaza trong
gel. Khi xem xél các gel chúng loi (hấy rằng với mục đích ứng dụng Irong y học 1 hì gel
PVA (polyvinylancol) và Aga-aga ỉà phù hợp hơn cả. Do vây chúng toi chọn hai loại gel
này để nghiên cứu cố định Proleaza bí dao.
Để nghiên cứu quá trinh này chúng lỏi tiến hành cố định Proteaza bí đao len PVA
và Aga-aga theo tỷ lệ sau:
Nồng đọ gel PVA:
1%

rất phù hợp vối mục đích nghicn cứu. Do vạy Aga-Aga được chọn làm dổi lơong nghiồn
cứu tiếp Iheo.
4
II.2. Nghiên cứu tìm nồng độ Aga-Aga thích hợp cho quá trình cố định Proteaza
Bi đao.
Trong khi nghiên cứu cố định Proteaza trong không gian mạng lưới gel thì
điêu đầu tiên mà chúng tôi quan tâm là phải nghiên cứu tìm nồng độ gel thích hợp
để tạo ra gel có kích thước lỗ phù hợp với kích thước của Proteaza. Nếu kích thước
lỗ gel quá nhỏ thì sẽ cản trở hoạt động của Proteaza và cản trở sự tiếp xúc của
proteaza với cơ chất. Nếu kích thưóc lỗ gel quá lớn thì Proteaza sẽ đễ dàng
khuyếch tán ra khỏi gel và làm mất đi tính chất cố định. Do vậy chúng tôi đã tiến
hành thí nghiêm như sau:
Nồng độ Proteaza được giữ cố đinh (0,0025 g/mL), thay đổi nồng độ Aga-
Aga. Sau đó xác định hoạt tính Proteaza cố định. Kết quả nghiên cứu thu được như
sau:
Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ Aẹơ - Aga lên hoạt độ Proteaza
âược cô’ định ở Agơ - aga.
Mẫu
Mẫu thí
nghiệm
Mãu so sánh
Hoa độ Proteaza
ng
% so với Proteaza
Aga-aga 0,5%
0,386 ± 0,002 0,148 + 0,002
0,237
76,95
Aga-aga 0,8%
0,396 ± 0,003

Sau khi tim được nổng đô Agn-Aga Ihích hợp để chế tạo gel có kích thước lỗ
phù hợp thì vấn đế tiếp theo là phải tìm hàm krựng Proleaza thích hợp dể loàn bọ
Proleaza được lap dủ các lỗ gel. Dư Proteaza sẽ dãn dến hiện lượng Proleaza bị hạn
chế tác dụng trong mạng lưởi gel hoặc bị đẩy ra khỏi gel lain giảm hiệu quả cố định.
Thiếu Proteaza sẽ dãn đến chế phảm cố định khổng cỏ hoạt lính tói đa. Để nghiên cứu
quá trình này chúng (ổi cố định nổng đọ Aga-Aga ròi Ihay dổi hàm lượng Proleaza
váo gel. Kết quả được (rình bày ở bảng
Ràng 3 : Ảnh hưởng của nồng âộ Prntpaza lới hoạt (ìộ enzim
cố định hồng Aga-aga 1,5%.
MÂU với nồng đọ
Proteaza (g/ ml)
MÂU thí nghiỌm
El
MÂU so sánh
E2
Hoạt đọ Prolea/a
cố định ( E)
0,1/20
0,447 ± 0,003
0,158+0,005
0,287
0,1/40
0,4Ơ7 ± 0,002 0,142 ±0,002
0,266
0,1/60
0,400 ± 0,004 0,130 ±0,002
0,227
0,1/80
0,380 ± 0,004
0,140 ±0,003

->
0.26<t
m nh_2_ 2 Hoạt lính Proleaza tiong gel Aga - aga
■ Nổng flrt Aga - Aga
Hình 3 : Iỉiệii suíít c ố (lịnli l^olcnzn líCii các gcl A ga - agn
Từ kết quả thu được ở bảng trên chúng tôi thấy rằng trong khoảng nồng độ
Proteaza nghiên cứu, gel vản đảm bảo khả năng cố định toàn bộ Pioteaza. Thông
thường trong điều trị vết thương bỏng thì sử dụng Proteaza có hoạt tính tương
đương với mâũ 0,1 g Proteaza / 2QmL là phù hợp, do vậy chế phẩm thu được có
khả năng sử dụng tốt.
II.4. Nghiên cứu độ Ổn định chế phẩm Proteaza cổ định.
Để đánh giá độ ổn định cuả chế phẩm Proteaza cố định người ta thường thực
hiện như sau: Đặt chế phẩm vào các điều kiện phản ứng rồi theo đõi quá trình mất
hoạt tính theo thời gian, ở dây chúng tôi đã ngâm chế phẩm vào trong nước cất ở
30°c và cứ sau một giờ lại xác định hoạt tính Proteaza trong nước. Kết quả thu
được như sau:
Bảng 4: Kết quả phân tích hoạt độ Proteaza giải phóng khỏi chất mang
Thời gian (giờ) Mẫu thí nghiệm
Mẫu so sánh
Hoạt độ Proteaza
1
0,136 + 0,002
0,134 + 0,002
0,004
2
0,145 ±0,001 0,136 ±0,002
0,008
3
0,149 ±0,001
0,140 + 0,002

bỏng khí Mê tan, bỏng Axit ). Dưới tác dụng của các tác nhân đó tế bào bị tổn
thương nặng hoặc bị chết. Tuỳ theo mức độ mà sự tổn thương gây ra ờ lớp bề mặt
hoặc ở lớp tế bào sâu hơn. Khi tế bào bị tổn thương khả năng tự vệ bị yếu đi hoặc
mất hoàn toàn. Chính vì thế mà vi khuẩn và nấm từ bên ngoài đễ tấn công vào cơ
thể qua vết thương, hoặc chính những vi trùng có sẵn trong máu gặp môi trường
thuận lợi sẽ phát triển mạnh ở chỗ vết thương. Khi có sự tấn công của các vi trùng
vào cơ thể, theo phản ứng miễn dịch, cơ thể tập trung bạch cầu tại vết thương để
bảo vệ. Bạch cầu " chiến đấu" với vi trùng, xác bạch cầu, cùng với các tế bào hoại
tử sẽ hình thành mủ ở các vết thương, gây ra tình trạng rất nguy hiểm cho bệnh
nhân, vì ngoài độc tớ do các vi tríing sinh ra thì các độc tố hình thành từ mủ sẽ
ngấm vào máu gây ra nhiễm trùng máu rất nguy kịch. ĐAy cũng là nguyên nhăn
chính gây ra trên 60% số nạn nhân bỏng bị tử vong. Vì thế mà việc điều trị các vết
thương bỏng phải đặt việc chống nhiễm trùng lên hàng đầu. Để chống nhiễm tiling
người ta phải làm sao nhanh chóng loại bỏ được các tế bào hoại tử và mủ ở các vết
thương bỏng. Theo kinh nghiệm từ xưa tới nay có mấy phương pháp thông dụng
sau:
- Người ta bôi mỡ Sunfodiazin Bạc để chống nhiễm tiling từ ngoài vào. Sau
đó người ta cắt bỏ đần lớp tế bào hoại tử . Theo phương pháp này thì cần tối thiểu
là 20 ngày mới loại bỏ được hoàn toàn lớp tế bào hoại tử.
- Tại Viện bỏng Quốc gia Trung ương lâu nay đã sử dụng loại cao làm từ củ
Ráy đắp vào vết thương để loại bỏ lớp tế bào hoại tử. Theo phương pháp này thì
phải mất 15 ngày.
- Sử dụng enzim có thể rút ngắn thời gian điều trị xuống còn khoảng từ 7- 10
ngày. Mặt khác enzim như tạo ra 1 lớp màng bảo vệ có tấc đụng chống không cho
8
vi trùng bên ngoài xâm nhạp vào vếi thương. Hiện dang có 2 chế phảm ngoại nhạp
dược sử dụng nhiểu là Tripsin và Papain, sỉr dụng các chế phím này ihì Ihời gian loại
bỏ lớp tế bào hoại tử là 7-10 ngày. Tuy vạy chế phẢm này chưa được dùng rộng rãi vì
giá thành cao.Viẹc Iighiẽn cứu các chế phíỉm enzin để kìm thuổc chữa bỏng cũng đà
cố nhiều cơ sở Irong nước nghiổn cứu và dã dại dưực những thành cổng ,

Đai học Quốc gia Hà nội
Đia chỉ: Kill 8 (tường Hà nội - Sơn lAy
Điện thoại: 8.340564
Tổng kinh phí thực hiện:
3.80().(KK)cl
Trong đổ: - Từ ngân sách nhà nước: 3,8 í liệu đồng, hoặc USD.
- Kinh phí của
Trường: tr.đ - USD
- Vay tín dụng:
Ir.đ - USD
- Vốn lư cổ:
tr.đ - USD
- Thu hổi:
ti.il - USD
Thời gian nghiên cứu:
- Thời gian bắl đàu: 199?
- Tlìời gian kốl lliúc: 1996
Tên các cán bộ phối hợp nghiên cứu:
Chỉ đạo Khoa học : PGS.PTS Lê Đức Ngọc
Các can hộ Ihíim gia: Thạc sỹ Võ Sĩ Hùng Tníừng Dili học KMTN
CN. Phạm Quý Hài
CN. Trần Quốc Tuấn
Số đăng ký dồ tài: Số chứng nhện đãng ký Bào mật
Kốl qua ngliiôn cứu A.PIiỔ biến lộng rãi
B.PIiổ biến lụm chế
Ngày: C. Bảo mại.
1
Tóm tắt kêì quả nghiên cứu:
- Đã nghiên cứu lìm dược vẠI liệu Ihích hợp clể cố định Profeaza hí dao ( RD), dó
là Aga- Aga.