BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN CAO QUÝ XÁC ðỊNH MỘT SỐ ðẶC ðIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH
DỊCH TẢ VỊT TẠI HUYỆN GIA VIỄN, TỈNH NINH BÌNH VÀ
ỨNG DỤNG VACXIN NHƯỢC ðỘC DỊCH TẢ VỊT CHỦNG
DP – EG 2000 ðỂ PHÒNG VÀ CAN THIỆP DỊCH

MÃ SỐ: 60 64 01 01
CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. BÙI TRẦN ANH ðÀO
2. TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI, 2013

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
i

LỜI CAM ðOAN

TS. Bùi Trần Anh ðào.
TS. Nguyễn Bá Hiên.
Người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài
nghiên cứu này.
Xin cảm ơn các bạn ñồng nghiệp và những người thân ñã ñộng viên, giúp
ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài này. Rất mong nhận ñược sự ñóng góp ý
kiến của các thầy cô giáo và các bạn ñồng nghiệp ñối với ñề tài nghiên cứu của
tôi.
Xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận văn Trần Cao Quý Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vi
Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t viii
MỞ ðẦU 1


1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS DỊCH TẢ VỊT 26

1.3.1. ðáp ứng miễn dịch không ñặc hiệu 26

1.3.2. ðáp ứng miễn dịch ñặc hiệu 26

1.3.3. ðộ dài miễn dịch 30
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iv

PHẦN II. NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 34

2.1.1. ðiều tra tình hình chăn nuôi vịt của các nông hộ trên ñịa bàn 3
xã. Gia Trung, Gia Minh và Gia Vượng 34

2.1.2. ðiều tra tình hình dịch bệnh từ năm 2011 ñến tháng 5 năm 2013
về các tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết theo lứa tuổi, các yếu tố nguy cơ 34
2.1.3. Chẩn ñoán virus dịch tả vịt bằng phản ứng PCR 34
2.1.4. Ứng dụng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt vào thực tế sản xuất. 34

2.1.5. ðề xuất một số biện pháp phòng, chống bệnh dịch tả vịt trên ñịa
bàn huyện 34

2.2. NGUYÊN LIỆU 34

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35


v

3.3.3. Kết quả bước ñầu thử nghiệm vacxin nhược ñộc dịch tả vịt
chủng DP-EG-2000 tại ñịa bàn nghiên cứu 68

3.4. ðỀ XUẤT MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG, CHỐNG BỆNH DỊCH
TẢ VỊT VỚI ðIỀU KIỆN CỦA HUYỆN 76

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 79

1. KẾT LUẬN 79

2. ðỀ NGHỊ 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vi

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số nước châu á 7

Bảng 3.1 Kết quả ñiều tra tình hình chăn nuôi vịt của các hộ gia ñình
tại xã Gia Trung (Tính ñến hết tháng 5/2013) 45

Bảng 3.2 Kết quả ñiều tra tình hình chăn nuôi vịt của các hộ gia ñình
tại xã Gia Minh (Tính ñến hết tháng 5/2013) 47

Bảng 3.3 Kết quả ñiều tra tình hình chăn nuôi vịt của các hộ gia ñình


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vii

Bảng 3.15. Kết quả gửi mẫu phát hiện virus dịch tả vịt bằng phản ứng
PCR 59

Bảng 3.16 Kết quả ñiều tra tình hình sử dụng vacxin DTV trên ñịa bàn
nghiên cứu năm 2011 62

Bảng 4.17 Kết quả ñiều tra tình hình sử dụng vacxin DTV trên ñịa bàn
nghiên cứu năm 2012 63

Bảng 3.18. Kết quả ñiều tra tình hình sử dụng vacxin DTV trên ñịa bàn
nghiên cứu năm 2013 69

Bảng 3.19. Kết quả ứng dụng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt ñể phòng
bệnh trong thực tiễn 71

Bảng 3.20. Kết quả khi can thiệp trực tiếp vacxin nhược ñộc dịch tả vịt
chủng DP-EG-2000 73 DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh dịch tả vịt theo lứa tuổi năm 2011 50


SN : Serum Neutralization
Tr : trang
VN : Virus Neutralization
VSV-TN : Vi sinh vật – Truyền nhiễm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
1

MỞ ðẦU
1. Tính cấp thiết của ñề tài
Vịt là loài thủy cầm ñược chăn nuôi nhiều nhất. Trên thế giới hàng năm
có khoảng 550 ñến 600 triệu vịt ñược chăn nuôi, trong ñó ở châu Á chiếm tới 80
– 86% tổng ñàn vịt. Nước ta hàng năm ñàn vịt sản xuất khoảng 30.000 ñến
40.000 tấn thịt hơi; 0,8 ñến 1 tỷ quả trứng và khoảng 1000 ñến 1500 tấn lông
(Trịnh Quang Khuê, 2003). Theo số liệu thống kê của FAO (2003) : Tổng số vịt
của Việt Nam là 60 triệu con, ñứng thứ 2 thế giới, sau Trung Quốc.
ðể phấn ñấu ñưa chăn nuôi thành ngành sản xuất chính, trong sản xuất
Nông nghiêp, trong những năm gần ñây ngành chăn nuôi nước ta luôn ñược
ñầu tư phát triển. Trong ñó ngành chăn nuôi gia cầm cũng luôn ñược quan
tâm ñặc biệt.
ðể ñạt ñược mục tiêu kể trên, ngành chăn nuôi gia cầm ngoài việc ưu tiên
ñầu tư cho lĩnh vực con giống, giải quyết vấn ñề thức ăn thì việc tăng cường các
biện pháp thú y bảo vệ ñàn gia cầm khỏe mạnh là một khâu hết sức quan trọng.
Cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi, chăn nuôi vịt ñang trở thành ngành
sản xuất hàng hóa góp phần vào chương trình xóa ñói giảm nghèo.
ðể tăng năng xuất hàng năm, chúng ta ñã tiến hành nhập nội hàng loạt các
giống vịt cao sản và nhân chúng lên trên diện rộng các giống này tuy có năng

nên trên ñàn vịt nuôi. Không nằm ngoài tình hình chung ñó người chăn nuôi vịt
ở huyện Gia Viễn, tỉnh Ninh Bình cũng phải ñối mặt với những tổn thất do bệnh
gây ra.
Gần ñây bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm (VSV- TN ) trường ðại Học
Nông nghiệp Hà Nội ñã có giống virus vacxin dịch tả vịt nhược ñộc chủng DP-
EG- 2000 xuất xứ từ nước ngoài. Những nghiên cứu bước ñầu về các chỉ tiêu vô
trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin này ñối với vịt nuôi ở Việt Nam ñã cho kết
quả tốt.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3

Vì vậy ñể có cơ sở khoa học ñánh giá về tình hình dịch bệnh, sự thiệt hại
của bệnh trong chăn nuôi và góp phần bổ sung hoàn thiện các biện pháp phòng
chống bệnh cho ñàn vịt ñạt hiệu quả cao. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
“Xác ñịnh một số ñặc ñiểm dịch tễ học của bệnh dịch tả vịt tại huyện Gia
Viễn, tỉnh Ninh Bình và ứng dụng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt chủng DP –
EG 2000 ñể phòng và can thiệp dịch”.
2. Mục ñích ñề tài
- Xác ñịnh một số ñặc ñiểm dịch tễ học của bệnh dịch tả vịt tại huyện Gia
Viễn – tỉnh Ninh Bình
- ðánh giá khả năng bảo hộ của vacxin.
- Bước ñầu ứng dụng vacxin vào thực tế sản xuất.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
- Là cơ sở ñề ra biện pháp phòng trị bệnh dịch tả vịt cho huyện Gia Viễn
có hiệu quả cao
- Là cơ sở ñể sử dụng chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt chủng DP – EG
2000 vào sản xuất vacxin phòng bệnh cho ñàn vịt ở nước ta.

họng và lỗ huyệt. Lần này, Boss (1943) ñã phân lập ra virus và cấy truyền 18
ñời trên vịt.
Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thế giới lần thứ XIV, căn cứ vào những kết
quả nghiên cứu của mình về chủng virus do Boss phân lập ñược, Jansen và
Kunst ñã ñề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000). Bệnh
dịch tả vịt còn có các tên gọi khác nhau như: Endenpest (Hà Lan), Pest du
canard (Pháp), Enteupest (ðức) (Nguyễn Xuân Bình, 2006).
* Phân bố bệnh
Tại Châu Âu, bệnh dịch tả vịt ñã ñược Devos phát hiện ở Bỉ năm 1964.
Năm 1970, Gaudry phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp; Asplin phát hiện bệnh ở
Anh. Bela Toth và Voxapeer Suwathanaviroij công bố bệnh dịch tả vịt xảy ra ở
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5

ðức. Do sự lan rộng của virus cúm gia cầm nên chính phủ các nước châu Âu,
ñặc biệt là ðức ñã ñề cao biện pháp cách ly thuỷ cầm bằng lưới trong khoảng
thời gian từ 20/10/2005-15/12/2005. Tuy nhiên tỷ lệ chết ñã tăng ñột biến trong
những ngày này. Tổng cộng có 17/124 (14%) loài chim trưởng thành và 149/184
(81%) loài chim 1 năm tuổi bị chết. Phản ứng trung hoà sử dụng kháng huyết
thanh dịch tả vịt ñã phát hiện vịt và các loài chim chết do bệnh dịch tả vịt
(Kaleta E.F. & cs, 2007).
Tại Châu Mỹ, bệnh dịch tả vịt ñược chẩn ñoán lần ñầu tiên ở tây bán cầu
vào năm 1967 từ một vùng sản xuất vịt thương phẩm tập trung tại hạt Suffolk,
New York (Leibovitz & Hwang, 1967). Vụ dịch ñầu tiên xảy ra trên ñàn thuỷ
cầm hoang ở Mỹ xuất hiện vào tháng 1 và 2 năm 1973, tại hồ Andes, miền nam
Dakota. Vụ dịch này ñã tấn công với sự tàn phá nhanh chóng và khốc liệt. Gần
40% của 100.000 loài thuỷ cầm trú ñông, hầu hết là vịt trời ñã bị chết. Vào thời
kỳ cao ñiểm của dịch, mỗi ngày chết hơn 1000 chim. Tất cả những loài thuỷ cầm
ñại diện tại hồ Andes ñều bị gánh chịu bao gồm ngỗng Canada, vịt trời, vịt ñen,
vịt lai nhọn ñuôi, vịt trời Mỹ, vịt gỗ, vịt mỏ nhọn Mỹ ñầu ñỏ mắt vàng, vịt Nga

dịch ñã bị thu hẹp lại, chỉ còn âm ỉ ở một số cơ sở chăn nuôi phân tán.
Năm 1980, dịch phát ra mạnh mẽ ở Hà Nam Ninh (cũ), Thanh Hoá và
ñồng bằng sông Cửu Long. Từ ñó dịch lan ra tới tận Nghệ Tĩnh, Kiên Giang,
Hậu Giang, ðồng Tháp.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
7

Bảng 1.1 Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số nước châu á

Năm Quốc gia Số vịt mắc bệnh Số vịt chết
Malaysia 138400 22430
Singapore 3000 400
1996
Trung Quốc 2000 1100
Ấn ðộ 424 17
1997
Malaysia 770 770
1998 Malaysia 100 100
Ấn ðộ 1215 119
Malaysia 2500 50
Nepal 100 74
1999
Việt Nam 123851 51752
Ấn ðộ 141 85
2000
Việt Nam 6747 2964
Ấn ðộ 1434 396
Malaysia 790 790
Thái Lan 1414 998

chết vì bệnh dịch tả vịt là 22.447 (xem bảng 1.1).
Như vậy, bệnh dịch tả vịt là căn bệnh cần ñược quan tâm, nghiên cứu sâu
nhằm góp phần giảm thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi.
1.1.2. Truyền nhiễm học
1.1.2.1. Loài mắc bệnh
Bệnh dịch tả vịt là bệnh của nhiều loài vịt: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt ñầu
ñỏ, … Các loài thuỷ cầm khác như ngan, ngỗng, thiên nga và một số loài chim
hoang dã cũng cảm nhiễm bệnh (Friend, 1973), (Docherty D.E. & Franson C.J.,
1992). Vịt là loài cảm nhiễm nhất, các giống vịt ở mọi lứa tuổi ñều có thể mắc
bệnh. Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết có thể lên tới 100%. Mức ñộ cảm nhiễm có thể
khác nhau tùy theo giống vịt. Loài vịt nhọn ñuôi ñược coi là ít cảm nhiễm nhất
ñối với bệnh (Sandhu T.S. & Leibovitz L., 2003). Theo Vandorssen (1955) thì
trong họ Anatideae, chỉ loài vịt xám ñược coi là ñề kháng với bệnh. Các ñộng
vật khác như bồ câu, công và ñộng vật có vú không cảm thụ với bệnh.
Kaleta EF & cs (2007) cho biết tại vụ dịch ở châu Âu vào năm 2005,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9

ngoài 34 loài thuộc bộ Anseriformes còn có thêm 14 loài thuỷ cầm cảm nhiễm
với bệnh dịch tả vịt.
Trong phòng thí nghiệm, vịt con là ñộng vật thí nghiệm cảm nhiễm nhất
ñối với bệnh. Virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi
(Jansen, 1968).
1.1.2.2. Mùa vụ phát bệnh
Bệnh dịch tả vịt xảy ra nhiều nhất vào tháng 4-6. Sự bùng nổ dịch bệnh
phụ thuộc vào ñiều kiện thời tiết, mùa sinh sản của vịt và ảnh hưởng của nhân tố
stress (Sarmah R. & Sarmah A.K., 1996).
Theo Phạm Sỹ Lăng (2002), ở Việt Nam, bệnh dịch tả vịt xảy ra quanh
năm nhưng phát triển mạnh vào thời vụ chăn nuôi vịt và trùng với thời vụ thu
hoạch lúa: Vụ chiêm tháng 5-6, vụ mùa tháng 10-11.

Bệnh lây lan rất nhanh và mạnh theo phương thức truyền lây gián tiếp nhưng
phương thức truyền lây trực tiếp từ mẹ sang con cũng có thể xảy ra (Burgess
E.C & TM Yuill, 1981).
1.1.3. Triệu chứng và bệnh tích
1.1.3.1. Triệu chứng
Thời gian nung bệnh ñối với bệnh dịch tả vịt là 3-4 ngày, có thể dài hơn
hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần ñầu tiên xảy ra hay ñã từng xảy ra ñối với
ñàn vịt.
Ở ñàn vịt con bệnh thường bắt ñầu bằng những dấu hiệu: Nhiều con tự
nhiên lờ ñờ, không thích vận ñộng, không muốn xuống nước. Ở vịt lớn khi lùa
ăn một số con rớt lại sau ñàn. Bắt xem thấy chân có dấu hiệu liệt, thân nhiệt cao.
Ở ñàn vịt ñẻ khi bệnh xuất hiện sản lượng trứng giảm xuống, có khi ngừng ñẻ
hẳn. Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ ăn, ñứng một chân, ñầu rúc vào cánh. Trong ñàn
vịt nhiều con có tiếng kêu khản ñặc. Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt ñỏ.
Lúc ñầu chảy nhiều nước mắt làm ướt cả vùng lông dưới mi mắt. Sau nước mắt
ñặc lại có màu vàng như mủ ñóng ñầy khoé mắt và có khi làm 2 mi mắt dính lại
với nhau. Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè. Từ mũi chảy ra chất niêm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
11

dịch lúc ñầu trong, sau ñặc lại. Nước mũi khô, quánh lại quanh khoé mũi. Nhiều
con ñầu sưng to, sờ nắn có cảm giác ñầu mềm như quả chuối chín. Hầu, cổ cũng
có thể sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù thũng. Lúc mới bị bệnh, vịt khát
nên uống nhiều nước. Sau vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất loãng, có mùi khắm và
có màu trắng xanh. Hậu môn bẩn, lông dính bết ñầy phân. (Nguyễn Như Thanh,
2001).
Ngoài ra, bệnh dịch tả vịt còn có một số triệu chứng khác ñáng chú ý như:
Vịt sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh. Vịt tì mỏ xuống ñất. Vịt ñực bị sa dương
vật, niêm mạc có những vết loét. Vịt ñẻ giảm sản lượng trứng mạnh (Phạm
Quang Hùng, 2003). Sau khi xuất hiện triệu chứng ñược 5 - 6 ngày, vịt bệnh gầy

Kiểm tra một số ñặc ñiểm dịch tễ học, bệnh sử và truyền lây của bệnh
như: Bệnh xảy ra ở vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi; bệnh lây lan nhanh và trầm
trọng trong khoảng 2-3 ngày.
Kiểm tra triệu chứng: Vịt giảm ăn, mất thăng bằng, ỉa phân loãng, xù
lông. Mắt vịt có dử, mí mắt sưng, sợ ánh sáng, chảy nước mũi.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
13

Sơ ñồ 1

Sơ ñồ chẩn ñoán bệnh dịch tả vịt

ðặc ñiểm
dịch tễ học
Kiểm tra
lâm sàng
Lấy mẫu
bệnh phẩm

nên bệnh dịch tả vịt dễ ghép với hai bệnh này và gây khó khăn cho công việc chẩn
ñoán bệnh. Tuy nhiên nếu là ổ dịch tụ huyết trùng hoặc phó thương hàn ñơn thuần
thì khi ñiều trị bằng kháng sinh ñặc hiệu có thể nhanh chóng dập tắt dịch.
1.1.4.2. Chẩn ñoán virus học
a. Phát hiện virus
Xử lý bệnh phẩm:
- Mẫu gan, lách, thận ñược xử lý thành huyễn dịch 10% với PBS
(Phosphate Buffered Saline) có chứa 200 UI/ml Penicillin và 200 mg/ml
Streptomycin.
- Ly tâm 2.000 vòng/15ph.
- Lấy dịch trong ở trên
- Kiểm tra vô trùng: Trên môi trường nước thịt BHI, hoặc trên môi trường
thạch máu.
b. Phân lập virus
* Phân lập trên vịt con
Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm ñã ñược xử lý như trên cho vịt con (0,7-1 kg)
với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn. Nếu bệnh phẩm có virus dịch tả
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
15

vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích ñặc trưng của bệnh dịch tả vịt giống
như ñã mô tả ở phần 1.1.3.
* Phân lập trên trứng vịt có phôi
- Tiêm 0,2ml huyễn dịch bệnh phẩm ñã xử lý vào xoang niệu mô hoặc
màng nhung niệu phôi vịt 11 - 12 ngày: 5 phôi/mẫu bệnh phẩm.
- Trứng ñược ấp tiếp ở tủ ấp 37
0
C. Soi trứng. Loại bỏ những phôi chết
trong khoảng 24h sau khi tiêm.
- Virus dịch tả vịt gây chết phôi sau 4 - 10 ngày với ñặc trưng: Xuất huyết

- Tiến hành:
+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi), 5
phôi/nồng ñộ.
+ Phôi ñược ấp tiếp ở tủ ấp 37
0
C trong 10 ngày. Loại bỏ những phôi chết
trước 24h.
+ Phôi chết trong 4 - 10 ngày, có bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.
- ðánh giá kết quả:
+ Tính toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index). Nếu kết quả phân
lập và giám ñịnh dương tính với kháng huyết thanh chuẩn (bằng phương pháp
trung hoà VN), kết luận có virus dịch tả vịt.
* Phương pháp trung hoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):
- Chuẩn bị:
+ Tế bào DEF trên ñĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ ñã nuôi cấy ñược 2 - 3 ngày.
+ Pha loãng virus phân lập: Các nồng ñộ 10
-1
-10
-9
với môi trường nuôi cấy
MEM.
+ Lô ñối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với
các nồng ñộ virus ñã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
+ Lô ñối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng ñộ virus ñã
pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
- Tiến hành:
+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào ñĩa ñã nuôi cấy tế bào DEF (ñĩa 96 lỗ),
100µl/lỗ, 8 lỗ/nồng ñộ.
+ Ủ ñĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO
2