ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG NHẬT LỆ
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN TRÊN GEN FLT3

Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN LƠ XEMI CẤP
DÒNG TỦY

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. LÊ XUÂN HẢI
2. GS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA
1
Hà Nội - Năm 2014
2
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, TS. Lê Xuân
Hải những người thầy tận tâm đã hướng dẫn, dìu dắt, dành nhiều thời gian quí báu,
tạo mọi điều kiện tốt nhất và tâm huyết giúp đỡ cho em hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng bày tỏ lòng cảm ơn chân thành nhất đến TS. Phạm Bảo Yên, ThS.
Trịnh Lê Phương, ThS. Ngô Kim Toán và cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập
tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và protein đã giúp đỡ và chia
sẻ kinh nghiệm thực tế trong quá trình thực hiện thí nghiệm phân tích đột biến gen.
Tôi cũng xin được cảm ơn chân thành nhất tới GS.TS. Nguyễn Anh Trí, Viện
trưởng Viện Huyết học- Truyền máu TW, đã hết sức tạo điều kiện để tôi hoàn thành
chương trình học đào tạo của một học viên cao học.
Tôi cũng chân thành cảm ơn Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học và Bộ môn Sinh
lý thực vật và Hóa sinh, các thầy cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học

TBBT: Tế bào bất thường
TKD: Tyrosin kinase domain
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Gi i thi u chung v AML 3ớ ệ ề
1.1.1. L ch s phát hi n AML 3ị ử ệ
1.1.2. Phân lo i b nh AML 4ạ ệ
1.1.3. Phân lo i b nh theo FAB 6ạ ệ
1.2. Tình tr ng m c b nh AML 9ạ ắ ệ
1.2.1. Tình tr ng m c b nh AML trên th gi i 9ạ ắ ệ ế ớ
1.2.2. Tình tr ng m c b nh AML Vi t Nam 10ạ ắ ệ ở ệ
1.3. M t s nguyên nhân gây b nh AML 11ộ ố ệ
1.3.1.Y u t di truy n 11ế ố ề
1.3.2. Y u t môi tr ng 11ế ố ườ
1.3.3. Virus 12
1.3.4. B t th ng v nhi m s c th 12ấ ườ ề ễ ắ ể
1.3.5. Các y u t khác 13ế ố
1.3.6. C ch b nh sinh c a AML 13ơ ế ệ ủ
1.4. Gen FLT3 v các lo i t bi n trên gen FLT3 14à ạ độ ế
1.4.1. C u trúc v ch c n ng c a gen FLT3 (hình 1.6 v hình 1.7)ấ à ứ ă ủ à
14
1.4.2. Ý ngh a c a xét nghi m phát hi n t bi n gen FLT3 trongĩ ủ ệ ệ độ ế
tiên l ng i u tr AML 17ượ đề ị
1.4.3. Các lo i t bi n trên gen FLT3 18ạ độ ế
1.4.4. Ph ng pháp phát hi n t bi n trên gen FLT3 20ươ ệ độ ế
Chương 2 22
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. i t ng nghiên c u 22Đố ượ ứ

2.4.2. Tách chi t v nh l ng DNA t ng s 25ế àđị ượ ổ ố
2.4.3. Tách chi t DNA plasmid b ng ph ng pháp Bibdo 26ế ằ ươ
2.4.4. i n di phân tách DNA trên gel agarose 27Đệ
Sau khi ki m tra n ng DNA b ng ph ng pháp o h p th ánhể ồ độ ằ ươ đ ấ ụ
sáng tia t ngo i b c sóng A260 /A280, chúng tôi ti nử ạ ở ướ ế
h nh i n di DNA t ng s trên gel agarose 1% trong mà đệ ổ ố đệ
TBE 1 X, v i hi u i n th 90V trong kho ng th i gian 1 gi .ớ ệ đ ệ ế ả ờ ờ
27
m TBE m c g p 10 l n (Tris-axit boric-EDTA 10X): HòaĐệ đậ đặ ấ ầ
tan 108 g Tris v 55 g axit boric trong 600 ml n c. Thêm 40à ướ
ml EDTA 0,5 M v thêm n c c t kh ion l 1 lít. H p vôà ướ ấ ử à ấ
trùng 121oC trong 15 phút, b o qu n nhi t phòng. 27ở ả ả ở ệ độ
Khi s d ng, thêm 900 ml n c v o 100 ml dung d ch TBE g cử ụ ướ à ị ố
(10X) th nh dung d ch TBE 1X. 27à ị
Sau khi i n di xong, b n gel c nhu m v i dung d ch ethidiumđ ệ ả đượ ộ ớ ị
bromide 1% trong 10 phút v soi b n gel trên h th ng máyà ả ệ ố
c geldot. 27đọ
2.4.5. Nhân b n gen b ng PCR s d ng c p m i c hi u c a genả ằ ử ụ ặ ồ đặ ệ ủ
FLT3 27
2.4.6. Nhân dòng gen FLT3 v o E. coli 29à
Tinh s ch o n gen mang t bi n FLT3 b ng kít thôi gel c aạ đ ạ độ ế ằ ủ
hãng Promega 29
Sau khi i n di s n ph m PCR trên gel agarose 2% xác nh sđệ ả ẩ để đị ự
chênh l ch kích th c c a b ng DNA v b ng DNA c c tệ ướ ủ ă à ă đượ ắ
v cho v o ng eppendorf. B sung dung d ch g n m ngà à ố ổ ị ắ à
(membrance binding) v i t l 10 l /10 mg gel, un h n h pớ ỷ ệ μ đ ỗ ợ
trên nhi t 60oC - 65oC cho n khi gel tan ch y ho nở ệ độ đế ả à
to n. Dung d ch ng nh t c chuy n qua c t SVà ị đồ ấ đượ ể ộ
milicolumn (hãng Promega) v nhi t phòng trong 1à ủ ệ độ
phút. Ly tâm c t SV 16000 g x 1 phút lo i b dung d chộ để ạ ỏ ị

chuy n l i trên t á 5 phút v b sung 800 l dung d ch LBể ạ ủđ à ổ μ ị
l ng, nuôi t v i nhi t 37oC trong 1 gi v l c v i t c ỏ ở ủ ớ ệ độ ờ à ắ ớ ố độ
l 200 vòng/1 phút. 30à
Ti n h nh ly tâm, l i kho ng 50-100 l dung d ch bi n n p ế à để ạ ả μ ị ế ạ để
c y tr i trên a petri có ch a môi tr ng TSA có b sungấ ả đĩ ứ ườ ổ
ampicilin, 15 l Xgal, 15 l IPTG v nuôi c y qua êm tμ μ à ấ đ ở ủ
m 37oC. 30ấ
Ph ng pháp ch n l c khu n l c tr ng – xanh 30ươ ọ ọ ẩ ạ ắ
Vector nhân dòng pGEM -T có gen lacz có tác d ng chuy n hóaụ ể
ng lactose. Vì v y i v i plasmid không mang o n genđườ ậ đố ớ đ ạ
chèn v o, khi ó gen lacz ho t ng bình th ng trong vi cà đ ạ độ ườ ệ
t ng h p -galactosidase khi có m t X-gal v IPTG trong môiổ ợ β ặ à
tr ng thì enzyme s chuy n hóa c ch t th nh m u xanhườ ẽ ể ơ ấ à à
khi có m t c a oxy. 30ặ ủ
Còn i v i plasmid tái t h p có m u tr ng do gen lacz b b t ho tđố ớ ổ ợ à ắ ị ấ ạ
l vì o n gen l chèn v o v l m m t ho t tính –à đ ạ ạ à à à ấ ạ β
galactosidase c a các th tái t h p, quá trình chuy n hóa củ ể ổ ợ ể ơ
ch t không x y ra khi có m t c X-gal v IPTG. 30ấ ả ặ ả à
Do ó theo lý thuy t khu n l c tr ng l nh ng khu n l c có thđ ế ẩ ạ ắ à ữ ẩ ạ ể
mang o n gen t bi n, khu n l c xanh l nh ng khu n l cđ ạ độ ế ẩ ạ à ữ ẩ ạ
không mang o n gen t bi n. 30đ ạ độ ế
Ki m tra khu n l c tr ng thu c b ng PCR v i n di s n ph mể ẩ ạ ắ đượ ằ àđệ ả ẩ
PCR ki m tra úng o n gen c chèn v o hay không,để ể đ đ ạ đượ à
b ng cách ti n h nh nuôi c y v tách chi t plasmid theoằ ế à ấ à ế
ph ng pháp Bibdo v g i m u ã tách chi t plasmid gi iươ à ử ẫ đ ế để ả
trình t . 30ự
2.4.7. Xác nh trình t gen theo nguyên lý c a Sanger v c ng sđị ự ủ à ộ ự
30
2.5. Phân tích, x lý s li u theo ph ng pháp nghiên c u 31ử ố ệ ươ ứ
Chương 3 32

Bảng 1.2. Ý nghĩa tiên lượng của đột biến FLT3 ở bệnh nhân trưởng
thành
Bảng 1.3. Nhóm tiên lượng theo NCCN 2013 [44]
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR
Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi của các tác giả
Qua thống kê phân tích các kết quả nghiên cứu trên đây cho thấy về độ
tuổi mắc bệnh của các tác giả trong nước và ngoài nước có kết quả
tương tự nhau về độ tuổi mắc bệnh AML
Bảng 3.2. Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB
Bảng 3.3. Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen FLT3-ITD với đột biến nhiễm sắc
thể
Bảng 3.4. Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD
Bảng 3.5. So sánh tình trạng thiếu máu của BN giữa hai nhóm
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2
Hình 1.2. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3
Hình 1.3. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4
Hình 1.4. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M5
Hình 1.5. Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn
Hình 1.6. Vị trí của gene FLT3 trên nhiễm sắc thể số 13
Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của FLT3
Hình 3.1. Phân bố của bệnh AML theo giới
Hình 3.2. So sánh kết quả điều trị giữa nhóm có đột biến và không đột
biến
Hình 3.3. Hình ảnh một số mẫu bệnh nhân AML được tách DNA tổng số

Hình 3.4. Sàng lọc mẫu bệnh nhân AML bằng PCR
Giếng 1: Đối chứng âm không có DNA khuôn
Hình 3.5. Hình ảnh tinh sạch băng đột biến FLT3
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 100 bp

kinase 3 (FLT3) và CCAAT- enhancer binding protein alpha (CEBPA) [29,30,32,40].
Khoảng 30% tổng số bệnh nhân mắc AML với kiểu hình nhiễm sắc thể bình
thường bị đột biến gen FLT3, hậu quả là enzyme tyrosine kinase này luôn luôn ở
trạng thái hoạt động mà không cần dimer hóa, dẫn đến rối loạn quá trình phát triển
và biệt hóa tế bào máu. Nhiều nhóm nghiên cứu FLT3 đã phát hiện ra hai kiểu đột
biến thường gặp nhất trên gen này là lặp đoạn nội phân tử (ITD - internal tandem
duplication) và đột biến điểm gây thay thế acid amin aspartic ở vị trí 835 thuộc
vùng tyrosine kinase [38,42,49,55].
Tỷ lệ mắc bệnh LXM cấp ở Mỹ năm 2012 khoảng 3-5 trường hợp trong
100.000 dân, chiếm khoảng 3% tổng số các bệnh ung thư. Ở Việt Nam, theo nghiên
cứu của Bạch Quốc Khánh và cộng sự năm 2012 lơ xê mi cấp chiếm tỷ lệ 41,5%
trong các bệnh máu. Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới. Tuy nhiên bệnh có xu
hướng gặp nhiều hơn ở trẻ em và người già [7]. Nhóm AML thường gặp ở người
lớn trong khi đó, nhóm LXM cấp dòng lympho chiếm 75-80% LXM cấp ở trẻ em
Trước đây việc chẩn đoán AML chủ yếu dựa vào hình thái học tế bào, hóa học
tế bào kết hợp với triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân do đó việc phân loại AML
còn gặp nhiều khó khăn đối với bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường thì
không phát hiện được những tổn thương trên gen để có định hướng điều trị.
Tuy vậy, hầu như chưa có các nghiên cứu đi sâu phân tích các dạng đột biến
cụ thể gây nên bệnh AML. Chính vì vậy việc áp dụng các phương pháp phân tích
1
DNA để xác định và phát hiện các loại đột biến ở bệnh nhân AML là rất cần thiết và
có ý nghĩa giá trị thực tiễn thiết thực trong chẩn đoán bệnh. Đề tài: ˝Nghiên cứu đột
biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy” của chúng tôi
được đặt ra nhằm mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân bị bệnh lơ xê mi cấp
dòng tủy.
2. Bước đầu xác định các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các bệnh
nhân có đột biến này.
2

chẩn đoán đối với những bệnh nhân có triệu chứng xuất huyết và thiếu máu ở trên.
Năm 1889, Wilhelm Ebstein đã dùng thuật ngữ (leukemia-lơ xê mi cấp) với triệu
chứng bệnh tiến triển nhanh, tiên lượng xấu để chẩn đoán phân biệt với lơ xê mi mạn.
Năm 1900, Naegeli gọi myeloblast là tế bào ác tính trong bệnh lơ xê mi cấp
và chia lơ xê mi cấp thành dòng tủy (AML) và dòng lympho (ALL).
Năm 1976, FAB đã đưa ra phân loại AML dựa vào hình thái học và hóa học
tế bào [31].
Năm 2001, WHO đã đưa ra phân loại lơ xê mi cấp để chẩn đoán xác định về
tế bào blast đã giảm xuống còn ≥ 20% tổng số tế bào có nhân trong tủy được chẩn
đoán xác định so với tiểu chuẩn của FAB (1986) tế bào blast ≥ 30%.
Năm 2008, WHO đã đưa ra phân loại mới dựa trên tổn thương gen để chẩn
đoán và đánh giá tiện lượng của bệnh đề ra phương pháp điều trị thích hợp.
1.1.2. Phân loại bệnh AML
AML có nhiều thể loại khác nhau, phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái
học, hóa học tế bào, các dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào, các đột biến về mặt di
truyền và gen. Trong bảng phân loại của WHO năm 2001 có nhiều thể bệnh AML
với các rối loạn về di truyền, bất thường trên gen từ đó giúp cho việc chẩn đoán
được tiên lượng về bệnh rõ ràng hơn [31].
Năm 2008 WHO đã đưa ra phân loại mới về AML mở rộng hơn so với phân
loại của WHO năm 2001 với một số bệnh đáng chú ý, trong đó đặc biệt một số gen
được đưa vào để xác định AML (bảng 1.1), gen FLT3 mặc dù chưa được đưa vào
chính thức để áp dụng trong chẩn đoán, nhưng cũng được khuyến cáo nên tiến hành
xét nghiệm trong điều kiện cho phép [56].
4
Bảng 1.1. Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO
Phân loại WHO 2008 – AML Phân loại WHO 2001 – AML
1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay gặp 1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay
gặp
AML có t(8;21)(q22;q21); RUNX1-
RUNX1T1

AML tăng sinh toàn bộ xơ AML tăng sinh toàn bộ xơ
Myeloid sarcoma (mô liên kết) Myeloid sarcoma (mô liên kết)
5. Tăng sinh tủy liên quan đến hội chứng
Down
6. Blastics plasmacytoid dendrictic cell
neoplasm
1.1.3. Phân loại bệnh theo FAB
Phân loại AML đã được sử dụng rộng rãi từ năm 1976 cho đến nay và dựa
trên chủ yếu là phân loại bằng hình thái học tế bào và hóa học tế bào. Người ta phân
loại thành 8 thể sau:
* Thể M0: AML thể không biệt hóa trong đó có tế bào non bất thường ≥ 90%,
- Tế bào tiền tủy bào < 3%.
* Thể M1: AML thể chưa trưởng thành (AML without maturation):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen.
- ≥ 90% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast.
- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào.
* Thể M2: AML thể trưởng thành (AML with maturation, hình 1.1):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen.
- ≤ 89% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast.
- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào.
6
Hình 1.1. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2
* Thể M3: AML thể tiền tuỷ bào (acute promyelocytic leukemia, hình 1.2):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và hoặc Sudan đen.
- < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
Đại đa số tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào, có nhiều hạt đặc hiệu trong
bào tương.
Hình 1.2. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3

1.2.1. Tình trạng mắc bệnh AML trên thế giới
Theo thống kê của Cộng đồng Châu Âu năm 2000-2002 tỷ lệ mắc bệnh AML
ở các nước trong khu vực như sau: Phía Bắc cộng đồng Châu Âu thì tỷ lệ mắc bệnh
AML là 2,95 trong 100,000 dân, trong đó khu vực miền Trung và miền Nam thì tỷ
lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân lần lượt là 2,92 và 2,90 nhưng riêng nước Anh
và Ireland thì tỷ lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân là 3,24.
Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Canada năm 2007 cho đến nay tỷ lệ mắc
bệnh của người dân Canada cứ 1,130 người mắc AML được chẩn đoán mới thì có
9
587 là nam giới và 543 là nữ giới. Tỷ lệ tử vong năm 2009 của AML là 897 trường
hợp trong đó nam giới là 479 người và nữ giới là 418 người [60]. Năm 2008 ước
tính trên toàn thế giới có khoảng 12,7 triệu ca bị ung thư trong đó có 7,6 triệu ca
chết vì ung thư.
Năm 2012 ở Mỹ có 47,150 người được chẩn đoán là lơ xê mi cấp trong đó
AML chiếm khoảng 3% so với các loại ung thư khác, độ tuổi chiếm 15-25% ở trẻ
nhỏ còn người lớn thì tăng theo tuổi cứ trên 67 tuổi thì tỷ lệ mắc bệnh AML ngày
càng tăng. Năm 2013 ở Mỹ có khoảng 48,610 ca được chẩn đoán mới về ung thư,
trong đó AML có khoảng 14,590 ca được chẩn đoán mới và 10,730 ca tử vong hầu
hết là người trưởng thành [61].
Theo Hiệp hội Ung thư thế giới ở các nước khu vực Tây Âu thì tỷ lệ mắc các
bệnh này là 2,07 trong 100,000 dân.
1.2.2. Tình trạng mắc bệnh AML ở Việt Nam
Bạch Quốc Tuyên, Nguyễn Thị Minh An cho thấy rằng giai đoạn 1974-1990
cho thấy tỷ lệ bệnh nhân đến khám và điều trị lơ xê mi cấp ngày càng tăng [1].
Trong thời gian này chẩn đoán chủ yếu dựa vào việc phân loại hình thái học tế bào
và triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân.
Năm 1997, nghiên cứu của Đỗ Trung Phấn và cộng sự về tình hình bệnh máu
tại Viện Huyết học - Truyền máu - Bệnh viện Bạch Mai cho biết tỷ lệ bệnh nhân
được chẩn đoán là bệnh máu ác tính chiếm 32,03% trong đó là AML chiếm tỷ lệ
cao là 64,3% [13].

đột biến nhiễm sắc thể [25,26].
Yếu tố di truyền: một số thể bệnh bẩm sinh di truyền như hội chứng Down,
Fanconi, Klinefelter… là những nguyên nhân để bệnh nhân mắc tỷ lệ ung thư máu
rất cao. Nguyên nhân có thể là do cấu trúc nhiễm sắc thể không bền vững rất dễ tổn
thương làm cho nhóm đối tượng này dễ phát sinh bệnh AML.
1.3.2. Yếu tố môi trường
- Tiếp xúc với môi trường độc hại như thuốc trừ sâu, dioxin, benzen, hóa chất đột
11
biến gen như ethidium bromide…làm cho nguy cơ xuất hiện lơ xê mi cấp ngày càng tăng.
- Các tia bức xạ ion hóa làm cho đột biến nhiễm sắc thể dẫn đến ung thư máu. Ví
dụ những cư dân Nhật Bản sống sót tại vụ nổ bom Hiroshima và Nagazaki mắc ung thư
cao gấp nhiều lần so với người khác. Tương tự như vậy vụ nổ nhà máy điện tử hạt nhân
Chernobyl tại Nga cũng là nguyên nhân làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh về ung thư.
1.3.3. Virus
Cho tới nay các nhà khoa học chưa tìm thấy được mối liên quan nào giữa virus
và bệnh lơ xê mi cấp. Tuy vậy một số công trình nghiên cứu thực nghiệm cho thấy
có mối liên quan một số virus như Epstein Barr virus (EBV) gây ung thư vòm họng,
Human Papilloma virus (HPV) gây ung thư tử cung và Human T-Cell
Lymphotrophic virus1, 2 (HTLV-1, 2) gây ung thư lơ xê mi dòng T lympho.
1.3.4. Bất thường về nhiễm sắc thể
Trong lơ xê mi thường gặp hiện tượng chuyển đoạn từ một nhiễm sắc thể này
tới một nhiễm sắc thể khác tạo nên một sự sắp xếp mới, chuyển phần promoter của
gen này nối với phần cấu trúc của gen khác làm cho gen được phiên mã, đảo đoạn
có thể trong cùng một nhiễm sắc thể hoặc nhiễm sắc thể khác, mất đoạn, lặp đoạn
đấy là những nguyên nhân thường gặp (hình 1.5).
Hình 1.5. Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn
12