TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
=======***======= PHAN THỊ THANH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
ĐÓNG GÓI MÀNG BC TẠO RA TỪ VI KHUẨN
GLUCONACETOBACTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. Phƣơng Phú Công
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung
HÀ NỘI - 2014
LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.
Phƣơng Phú Công và PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ
bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành tốt
khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2,
Khoa Sinh - KTNN, phòng thí nghiệm Vi sinh vật, cùng các thầy cô trong tổ
Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2014
Sinh viên Phan Thị Thanh
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A.xylinum : Acetobacter xylinum
BC : Bacterial cellulose
CS : Cellulose synthanse
cs : cộng sự
GK : Glucokinase
MC : Microbial cellulose
PC : Plant cellulose
PCR : Polymerase Chain Reaction
PMG : Phosphoglucomutase
VSV : Vi sinh vật
Nxb : Nhà xuất bản
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC
Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật
Hình 1.3. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter
Hình 1.4. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose
Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter
Hình 3.2. Gluconacetobacter trên môi trƣờng thạch nghiêng
Hình 3.3. Nhân giống giống Gluconacetobacter cấp 1
Hình 3.4. Lên men tĩnh trong 5 ngày
Hình 3.5. Màng BC sau 5 ngày lên men
Hình 3.6. Màng BC sau khi xử lý
Hình 3.7. Túi nilon thông thƣờng
Hình 3.8. Đóng gói màng BC trên ngọn lửa đèn cồn
Hình 3.9. Chế phẩm màng BC đóng gói thủ công
Hình 3.10. Nấm mốc xuất hiện trên bề mặt màng
Hình 3.11. Máy chân không và túi hút chân không
Hình 3.12. Màng BC đóng gói bằng máy hút chân không
Hình 3.13. Màng BC đƣợc tẩm Berberin clorid 0,1%
Hình 3.14. Màng BC đƣợc tẩm tinh dầu nghệ
Hình 3.15. Màng BC đƣợc tẩm nƣớc sắc lá sim
Hình 3.16. Màng BC sấy ở 50
0
C
Hình 3.17. Chế phẩm màng BC sau khi ngâm tẩm chất phụ gia
Hình 3.18. Sơ đồ quy trình công nghệ đóng gói màng BC
1.4.2. Ở Việt Nam 14
Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất 16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 16
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 16
2.1.3. Hóa chất 16
2.1.4. Môi trƣờng 17
2.1.4.1. Môi trƣờng giữ giống (MT1) 17
2.1.4.2. Môi trƣờng nhân giống (MT2) 17
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 17
2.2.1.1. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng 17
2.2.1.2. Phƣơng pháp hoạt hóa giống 17
2.2.1.3. Phƣơng pháp lên men tạo màng 18
2.2.1.4. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế
bào trên tiêu bản nhuộm kép 18
2.2.2. Phƣơng pháp vật lý 19
2.2.3. Phƣơng pháp xử lý màng BC từ Gluconacetobacter 19
2.2.4. Phƣơng thức đóng gói màng BC 20
2.2.4.1. Đóng gói bằng phƣơng pháp thủ công 20
2.2.4.2. Đóng gói bằng máy hút chân không 21
2.2.5. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả 21
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22
3.1. Lên men và thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BNH
2
trên quy mô phòng thí nghiệm 22
3.1.1. Lên men tạo màng 22
một lớp màng, trong đó có bản chất là cellulose liên kết với các tế bào vi
khuẩn Gluconacetobacter. Màng này đƣợc gọi là Bacteria cellulose (màng
BC). Cellulose trong màng vi khuẩn có một số đặc tính quý nhƣ: Độ dẻo dai,
độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi. Nhờ những đặc tính đó mà hiện nay màng BC
đƣợc xem nhƣ là một nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng, nó đang thu hút
đƣợc sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỷ XIX và đƣợc
ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau nhƣ : Trong công nghiệp sản xuất giấy
màng BC đƣợc dùng để sản xuất điện tử chất lƣợng cao, trong công nghệ môi
trƣờng đã đƣợc sử dụng màng BC làm màng phân tách để xử lý nƣớc và biến
đổi độ nhớt của nƣớc (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998). Ngoài ra, màng
BC còn đƣợc dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng
lƣợng (Brown, 1989). Trong công nghiệp thực phẩm sử dụng vi khuẩn
Gluconacetobacter nuôi trên môi trƣờng nƣớc dừa tạo màng BC để sản xuất
thạch dừa. Trong lĩnh vực mỹ phẩm và dƣợc phẩm, lợi dụng những đặc tính
quý báu của màng BC nhƣ thông thoáng, kháng khuẩn, tính tƣơng đồng về
cấu trúc với sợi collagen trong da nên màng BC đƣợc coi là nguồn nguyên
liệu quý giá dùng làm mặt nạ dƣỡng da, da nhân tạo, dùng trong điều trị bỏng
và tổn thƣơng da Tuy nhiên màng BC trong quá trình đến tay ngƣời sử dụng
thƣờng bị giảm chất lƣợng hoặc bị nhiễm một số loại nấm mốc và vi khuẩn
không mong muốn do đó công việc đóng gói màng là một khâu rất quan trọng
trƣớc khi đƣợc đem ra sử dụng, mặt khác màng BC sau khi lên men và đƣợc
xử lý thì cần tiến hành bảo quản ngay để giữ đƣợc các đặc tính quan trọng và
không làm biến đổi tính chất của màng BC vì vậy việc đóng gói để bảo quản
màng BC càng trở nên cấp thiết.
Từ những thực tiễn trên và mong muốn tìm hiểu thêm về vi khuẩn
Gluconacetobacter, quá trình tạo màng, cũng nhƣ nhiều ứng dụng hữu ích của
màng BC vì vậy tôi chọn đề tài: “ Hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói
màng BC tạo ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter”
2. Mục đích nghiên cứu
Hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói màng BC tạo ra từ vi khuẩn
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic nhƣ Rothenback
1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Fraterur
1950 Thuật ngữ “Gluconacetobacte” đƣợc dùng đầu tiên cho cấp độ phân
loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận
thấy các thành phần Ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn
sinh acetic khác nhau.
Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonasdaceae, bộ
Pseudomonasdales, lớp Schizomycetes [12].
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy,
cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học
Gluconacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc
khoảng 2µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả
năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào đƣợc bao bọc bởi chất nhày tạo
váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose khi gặp H
2
SO
4
và thuốc nhuộm
iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), và bắt màu hồng khi
nhuộm fucshin. Gluconacetobacter có thể tích lũy 4,5% acid acetic trong môi
trƣờng. Khi nồng độ acid acetic quá cao vƣợt giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế
hoạt động của vi khuẩn [12]. Chúng có thể sống chung với nấm men trong một
số loại nƣớc giải khát dân gian làm bằng nƣớc chè và đƣờng loãng, pH thích
hợp là 5,4 - 6,2, nhiệt độ thích hợp từ 25- 30
0
đổi oxy và các chất dinh dƣỡng [4], [18].
Ngƣợc lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng sợi nhỏ với
kích thƣớc không đều nhau và phân tán trong môi trƣờng dinh dƣỡng tạo ra
những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
* Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25- 35
o
C, pH = 4- 6.
Nhiệt độ và pH tối ƣu tùy thuộc vào giống. Ở 37
o
C, tế bào sẽ suy thoái hoàn
toàn ngay cả trong môi trƣờng tối ƣu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác
nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter sinh trƣởng và tạo màng. Gluconacetobacter có khả năng
chịu đƣợc pH thấp, vì thế thƣờng bổ sung thêm acid acetic và môi trƣờng nuôi
cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
* Đặc điểm sinh hóa
Năm 1950, Fruteur [23] đã chính thức đƣa ra một khóa phân loại mới
căn cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO
2
và H
2
O;
hoạt tính catalase; Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadaceae, lớp Schizomycetes. Đặc điểm
phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi đƣợc trình bảng dƣới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur
3
+
6
Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu
Không hình thành sắc tố nâu
-
7
Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất kiện màu lam
+
1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trƣởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon đƣợc cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dƣỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: Thành phần hóa học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Ngƣời ta sử dụng đƣờng làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị
dƣỡng. Đƣờng đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hóa thành loại hợp chất có
màu tối khó hấp thụ. Trong môi trƣờng kiềm sau khi khử trùng, đƣờng còn dễ
bị chuyển hóa là biến đổi pH môi trƣờng. Để tránh hiện tƣợng này khi khử Phan Thị Thanh 7
trùng môi trƣờng có chứa đƣờng ngƣời ta thƣờng chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
110
0
C trong 30 phút. Từ các loại đƣờng đơn rất phổ biến tốt nhất nên sử dụng
+
trong môi trƣờng sẽ tích lũy anion vô cơ làm hạ
thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng. Muối amoni của các acid hữu cơ ít
làm chua môi trƣờng hơn do đó có lúc đƣợc sử dụng nhiều hơn.
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,
xạ khuẩn nhƣng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết
NO
3
-
các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trƣờng. Vi sinh vật có khả
năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là
nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật. Vi sinh vật không
có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid
không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế
bào chất của vi sinh vật.
1.2.3. Hàm lượng ethanol trong dịch lên men
Ethanol đƣợc sử dụng nhƣ một cơ chất. Hàm lƣợng ethanol có thể thay
đổi từ 2 - 10% V. Hàm lƣợng cao hơn sẽ làm tăng năng suất lên men. Theo
Hong - Joo Son lại công bố hàm lƣợng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - 1% tốt
nhất là 0,6% . Theo Nodes, lƣợng ethanol duy trì trong môi trƣờng luân giữ ở
3 – 3,5%. Các tác giả Ebner và Heirich, cho lƣợng ethanol dùng từ 7 - 10% V
. Để tránh hiện tƣợng oxy hóa hoàn toàn acid acetic cần có một lƣợng ethanol
sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid
acetic và muối acetate. Ngoài việc oxy hóa ethanol, vi khuẩn acetic còn có
khả năng oxy hóa các rƣợu thành các acid tƣơng ứng.
1.3. Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Màng sinh học bacterial cellulose đƣợc cấu tạo bởi chuỗi polymer β - 1,4
glucopyranose mạch thẳng, đƣợc tổng hợp từ một số loại vi khuẩn nhƣ :
Gluconacetobacter. Màng này có bản chất là cellulose đƣợc liên kết với các tế
giảm khi chúng đƣợc nhúng vào dung dịch đƣờng và độ cứng tăng lên khi
đƣợc nhúng bằng dung dịch muối.
Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau:
Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
Khả năng giữ nƣớc và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp.
Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose
vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
Kiểm soát đƣợc kích thƣớc, cấu trúc và chất lƣợng của cellulose
(kiểm soát đƣợc cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo
cellulose.
Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp mà
không gắn lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì
vậy cellulose vi khuẩn đƣợc xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ƣu thế trong
tƣơng lai [8], [18].
1.3.3. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose
Quá trình tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bƣớc đƣợc điều
hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại
enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [5], [6].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cs có 4 enzyme tham gia xúc tác
tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter : Glucokinase,
Phosphoglucomutase, Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (UDPG
pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó UGP à
enzyme có vai trò quan trọng nhất.
Hình 1.3. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter Phan Thị Thanh 11
Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
Giai đoạn polymer hóa
về quá trình chuyển hóa, vận chuyển chất dinh dƣỡng và oxy đến tế bào.
Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung
quanh môi trƣờng hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng, điều này
ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện thuận
lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng
cellulose có khả năng giữ nƣớc nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh
dƣỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hƣởng của tia UV (tia tử
ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nƣớc của các lớp cellulose mà các tế
bào vi khuẩn kháng lại đƣợc những thay đổi không thuận lợi trong môi trƣờng
sống nhƣ giảm ẩm độ, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại. Các vi khuẩn
Gluconacetobacter có thể tăng trƣởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Phan Thị Thanh 13
Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng
khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter đƣợc bao bọc bởi
BC sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả
năng sống sót của tế bào giảm chỉ còn khoảng 3% [8].
Mạng lƣới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter luôn
ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trƣờng lỏng và không khí. Chính mạng lƣới này
làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trƣờng và làm tế bào thâu
nhận chất dinh dƣỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi
trƣờng lỏng không có mạng lƣới cellulose [18]. Trong môi trƣờng tự nhiên,
đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp
vỏ bao quanh tế bào và màng BC là một điển hình.
Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose đƣợc tổng hợp bởi
Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thể sử dụng khi vi sinh vật
này bị thiếu dinh dƣỡng. Sự phân hủy cellulose đƣợc xúc tác bởi enzyme
exo gluconase hay endo glucanase. Các enzyme exo gluconase hay endo
gluconase phân hủy cellulose đƣợc phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một vài
bƣớc đầu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng trên thỏ [12].
Trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi không sử dụng dầu mù u mà
thay thế vào đó là chúng tôi sử dụng các loại thuốc trị bỏng khác nhƣ:
Becberin clorid 0,1%, nƣớc muối sinh lý. Ngoài ra chúng tôi còn ngâm với
dịch chiết của một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đƣợc dùng
trong điều trị bỏng phải kể đến nhƣ là:
Nƣớc sắc cây cỏ lào (Eupatorium odoratum Linn), cây diếp cá
(Houttunynia cordata), dung dịch vàng đắng (Coscinum fenestratum) có tác Phan Thị Thanh 15
dụng làm sạch vết thƣơng, chống nhiễm khuẩn.
Nƣớc sắc lá sim (Rhodomyrtus tomentosa) có tác dụng làm se khô vết
thƣơng, chống nhiễm khuẩn.
Tinh dầu nghệ (Rhizoma curcumae longa) chiết suất từ nghệ tƣơi có tác
dụng tốt đến sự tái tạo tế bào da, làm cho da chóng lành, ít để lại sẹo.
Đặc biệt chúng tôi đã xây dựng và lựa chọn phƣơng thức đóng gói, bảo
quản màng BC tạo ra từ chủng Gluconacetobacter, tìm ra vật liệu đóng gói và
chất bảo quản phù hợp, vừa với giá thành, bảo quản đƣợc màng BC trong một
thời gian dài và nâng cao đƣợc tác dụng điều trị bỏng của màng.
Copyright: Tài liệu đại học ©