ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
PHẠM VĂN ĐẠI Đề tài:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TRÍCH LY HOẠT
CHẤT SINH HỌC DITERPENOID TỪ NẤM ĐẦU KHỈ
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Khoa : CNSH & CNTP
Khóa : 2010 - 2014
Giảng viên hướng dẫn : 1. ThS. Nguyễn Đức Tiến
(Viên Cơ điện Nông nghiệp & Công nghệ sau thu hoạch)
2. ThS. Trần Thị Lý
(Khoa CNSH & CNTP - Trường ĐH Nông lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên, năm 2014
``LỜI CAM ĐOAN
hoạch đã hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình và bạn bè đã là nguồn động viên, giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu những lời cảm ơn chân thành nhất.
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014
Sinh viên
Phạm Văn Đại MỤC LỤC
Trang
Phần 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
Phân 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về nấm Đầu Khỉ 3
2.1.1. Khái niệm và phân loại nấm Đầu Khỉ 3
2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của nấm Đầu Khỉ 4
2.1.3. Thành phần hóa học của nấm Đầu Khỉ 5
2.1.4. Hoạt chất sinh học và tác dụng của nấm Đầu Khỉ 6
2.2. Giới thiệu về hoạt chất sinh học Diterpenoid 9
2.2.1. Khái niệm Diterpenoid 9
2.2.2. Hoạt tính sinh học của Diterpenoid 11
2.3. Trích ly các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ 13
2.3.1. Cơ sở khoa học của quá trình trích ly 13
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 40
4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả
trích ly Diterpenoid 42
4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng các thông số trích ly tới hiệu quả trích ly
Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 44
4.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiểu quả
trích ly Diterpenoid 44
4.3.2. Nghiên cứu ảnh của hưởng nhiệt độ trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid .46
4.3.3. Nghiên cứ ảnh hưởng của thời gian trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 47
4.3.4. Nghiên cứ ảnh hưởng của số lần trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 49
4.4. Lọc, cô dịch trích ly và thu chế phẩm Diterpenoid 50
4.5. Đưa quy trình trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 52
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
5.1. Kết luận 54
5.2. Kiến nghị 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Trang
Bảng
2.1:
Thành
phần
Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 41
Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liêu/dung môi tới hiệu quả 43
trích ly Diterpenoid 43
Đồ thị 4.5. Ảnh phương pháp trích ly đến hiểu quả trích ly Diterpenoid 45
Đồ thị 4.6. Ảnh hưởng nhiệt độ trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 46
Đồ thị 4.7. Ảnh hưởng thời gian trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 48
Đồ thị 4.8. Ảnh hưởng của số lần trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 49
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1. Nấm Đầu Khỉ 3
Hình 2.1. Công thức cấu tạo Erinacines Diterpenoid (A – I) trong nấm Đầu Khỉ 11
Hình 2.2. Nấm hầu thủ dạng viên nang 21
Hình 2.3. Nấm hầu thủ dạng khô 21 DANH MỤC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1. Quy trình dự kiến trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 28
Sơ đồ 4.1. Quy trình quy trình trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 52
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
NGF : Nerve growth factor (yếu tố tăng trưởng thần kinh)
HPA : Hericium Polysaccharides A
HPB : Hericium Polysaccharides B
GC-MS : Gas Chromatography Mass Spectometry (Sắc kí ghép khối phổ)
1
2
thụ nấm rộng lớn. Mặc dù vậy, nấm Đầu Khỉ vẫn còn khá mới đối với người dân
nước ta, nhất là những sản phẩm mang tính tiện lợi có bổ sung các hoạt chất sinh
học từ nấm như: Sử dụng làm đồ uống, chiết xuất thành dạng viên nang, ứng dụng
trong sản xuất trà túi lọc, trà hòa tan… Hiện nay, trên thị trường Việt Nam những
sản phẩm từ nấm Đầu Khỉ chủ yếu dưới dạng khô và dạng bột từ quả thể nấm, vừa
không tiện dụng lại hiệu quả kinh tế thấp.
Để tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có và những tác dụng ưu việt của nấm
Đầu Khỉ chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ
trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ”.
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ
1.2.2. Yêu cầu
Xác định được ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến hiệu quả trích
ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
Xác định được ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích Diterpenoid trong
nấm Đầu Khỉ
Xác định được ảnh hưởng các thông số trích ly (nhiệt độ, thời gian, số lần
trích ly) đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
Lọc, cô dịch trích ly và thu nhận chế phẩm Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
Xây dựng được quy trình trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid trong nấm
Đầu Khỉ
Chi (Genus): Hericium
Loài (Species): Hericium erinaceum
Qua nghiên cứu có 9 loài thuộc chi Hericium [6;7]:
1. Hericium erinaceum (Bull.) Pers
2. Hericium ramosum (Bull.) Letell
3. Hericium flagellum (Scop.) Pers
4. Hericium abietis (Weir.) Harrison
5. Hericium caputmedusa
6. Hericium cirrhatum (Fr.) Nikol
7. Hericium laciniatum (Leers) Banker
8. Hericium clathroides (Palles.) Pers
9. Hericium caput-ursi (Fr.) Corner
Theo hệ thống phân loại cổ điển, cho đến giữa thế kỷ 20, dựa vào đặc trưng
hình thái học đại thể (macromorphology), người ta vẫn xếp các nấm có thể dạng tua
gai vào cùng một nhóm. Trước đây chi Hericium được xếp vào họ Hydnaceae [6].
Về phương diện phân loại học, năm 1964 Donk đã xác lập họ nấm tua
Hericiaceae với chi chuẩn là Hericium và xếp vào họ Hericiaceae trong bộ
Cantharellales. Đến năm 1981, Julich đã nâng lên thành bộ Hericiales, tách biệt với
bộ Cantharellales.
2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của nấm Đầu Khỉ
Quả thể Nấm Đầu Khỉ thường hình cầu hoặc hình ellip, mọc riêng rẽ hoặc
thành chùm, không phân nhánh có kích thước 5 - 20cm. Nấm Đầu Khỉ có nhiều sợi
dài dạng lông dày đặc, rũ xuống như đầu khỉ, lúc già tua dài và chuyển sang màu
vàng trông như bờm sư tử. Các tua nấm chính là tổ chức bào tầng (Hymenium) [9].
Quả thể non tua ngắn, mỏng manh, khi trưởng thành tua dài 0,5 - 3cm,
đường kính từ 1,8 - 3mm. Quả thể khi non có màu trắng đến trắng ngà, thịt màu
trắng, khi già nấm ngả sang màu vàng đến vàng sậm. Quả thể cắt dọc mô thịt có
màu trắng kem, khi để lâu ngoài không khí ngả sang màu nâu đến nâu vàng, có
hương thơm dễ chịu [9].
vitamin. Tuy nhiên ở các điều kiện nuôi trồng khác nhau cũng sẽ có chất lượng của
chúng cũng khác nhau về thành phần dinh dưỡng, hàm lượng acid amin… Các kết
quả phân tích về thành phần của nấm Đầu Khỉ trồng tại các nước khác nhau trên thế
giới được thể hiện ở bảng sau:
6
Bảng
2.1:
Thành
phần
dinh
dưỡng
của
100g nấm Đầu Khỉ khô [5;19].
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Protein
23 g - 31,7 g
Ka 4,46 mg - 43,7 mg
Lipid 1,8 g - 4,68 g
lệ cao. Các loại vitamin trong nấm Đầu Khỉ cũng rất phong phú, đặc biệt là vitamin PP
và D chiếm tỷ lệ khá cao.Thành phần amino acid cũng có giá trị cân đối về dinh dưỡng,
đặc biệt trong nấm Đầu Khỉ có sự hiện diện đầy đủ của 7 trong số 16 loại acid amin
thiết yếu cần cho cơ thể động vật [2].
2.1.4. Hoạt chất sinh học và tác dụng của nấm Đầu Khỉ
2.1.4.1. Hoạt chất sinh học trong nấm Đầu Khỉ
Từ lâu nấm Đầu Khỉ đã được biết tới như là loại thực phẩm bổ dưỡng được
nhiều người ưa chuộng. Đặc biệt nấm Đầu Khỉ chứa nhiều chất có hoạt tính sinh
học cao có tác dụng rất tốt trong việc hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh viêm loét
dạ dày, ung thư dạ dày, ung thư thực quản, cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ ở
người cao tuổi, tăng cường hệ miễn dịch, nâng cao sức đề kháng với tình trạng thiếu
oxy, chống mệt mỏi, lưu thông tuần hoàn máu… [12]. Cho đến nay đã thống kê
được hàng chục hợp chất hữu cơ có trong nấm Đầu khỉ như: Diterpenoid, Acid
amin, Polysaccharides, Peroxide, nguyên tố vi và đa lượng. Gần đây các phương
pháp phân tích đã chứng minh được trong nấm Đầu Khỉ có các hoạt chất chính sau:
a. Nhóm Polysaccharides:
Các Polysaccharides của nấm Đầu Khỉ như: xylan, glucoylan, heteroxyglucan
và phức hợp protein của chúng có các đặc tính cải thiện đáp ứng sinh học, có lợi
7
cho khả năng miễn dịch. Trong nghiên cứu thực nghiệm kháng ung thư của
Polysaccharides ở nấm Đầu Khỉ có 5 loại Polysaccharides được phân lập là Flo-a-α;
Flo-a-β; Flo-b; FIIo-1 và FIII-2b có hoạt tính kháng ung thư và tác dụng kéo dài
thười gian sống [19]. Polysaccharides trích ly từ nấm Đầu Khỉ rất phong phú, trong
đó hợp chất chính có hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch là 1,3; 1,6- β-Glucan:
- Beta 1,3/1,6 D glucan
Beta Glucan D đã được khẳng định chức năng hạn chế tăng trưởng của vi
khuẩn hình xoắn ốc, đẩy nhanh cicatrisation áp xe, kháng ung thư dạ dày và niêm
mạc ruột. Hiện nay, tại Nhật Bản chế phẩm chứa Beta Glucan D đã được phổ biến
Nấm Đầu Khỉ là nguồn nguyên liệu quý để sản xuất một số loại dược phẩm
phục vụ sức khỏe con người. Bởi nấm Đầu Khỉ có tác dụng ngăn cản quá trình lão
hóa và phục hồi các noron thần kinh, tăng cường hệ miễn dịch và đặc biệt hiệu quả
với các bệnh nhân ung thư phổi di căn. Polysaccharides chiết xuất từ nấm có hiệu
quả chống ung thư dạ dày, thực quản và ung thư da [16].
Y học cổ truyền Trung Quốc cho rằng nấm Đầu Khỉ tính bình, vị ngọt,
chuyên chữa trị rối loạn tiêu hóa, suy nhược thần kinh, loét dạ dày, nó vừa là món
ăn bổ dưỡng vừa là thuốc bổ quý hiếm, có công hiệu “trợ tiêu hóa, lợi ngũ tạng” cho
cơ thể. Sử dụng nấm Đầu Khỉ đặc biệt có lợi cho người già và những người cơ thể
suy nhược. Y học hiện đại đã chứng minh được rằng nấm Đầu Khỉ là dược liệu tốt
giúp trị liệu các bệnh về hệ thống tiêu hóa và khống chế cơn đau dạ dày. Dùng nấm
Đầu Khỉ chế thành dược phẩm đối với các bệnh về đường tiêu hóa như viêm dạ dày
mãn tính, loét dạ dày hành tá tràng … hiệu quả đến 85,2% [2].
- Tác dụng trên hệ tiêu hóa
Trong lâm sàng, các bác sĩ Trung Quốc đã sử dụng rộng rãi nấm Đầu Khỉ để điều
trị các bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng, viêm loét ruột, co thắt dạ dày và các bệnh đường
tiêu hóa khác. Có nghiên cứu thực hiện trên 227 bệnh nhân, có bệnh từ 2 năm trở lên, có
hiệu quả đạt tới tỷ lệ 85,2% - 92,5%. Đặc biệt ở Trung Quốc người ta đã dùng để điều trị
ung thư dạ dày, kể cả trường hợp điều trị bằng hóa chất không hiệu quả [21]
- Tác dụng trên hệ thần kinh
Theo Eun Woo Lee và cộng sự (2000), đã nghiên cứu và kết luận nấm Đầu
Khỉ có tác dụng tốt trên bệnh Alzeimers, ngăn cản quá trình lão hóa và phục hồi các
neuron thần kinh [11].
9
Theo Muzino và cộng sự (1998), đã nghiên cứu cho thấy nấm Đầu Khỉ có
một số hợp chất có khả năng sinh tổng hợp yếu tố tăng cường thần kinh có khả năng
điều kiển bệnh Alzheimer như: Hericinone, hericinone D, hericinone E [19].
- Tăng cường hệ miễn dịch và chống lại tế bào ung thư
Đa số các Diterpenoid là hợp chất vòng. Đối với các Diterpenoid chủ yếu
kiểu đóng vòng điển hình thành các dẫn xuất của perhidronaphtalen và
perhidrophenantren. Có hai kiểu đóng vòng:
Kiểu 1: Đóng vòng do sự proton hoá nối đôi của đơn vị isopropyliden xuất
phát. Kiểu thứ nhất thuộc về cùng dãy lập thể với steroid.
Kiểu 2: Nhóm pyrophotphat rời khỏi phân tử cho một cacbacation và khai
mào cho phản ứng đóng vòng.
Từ các tiền thân không vòng, thông qua các kiểu đóng vòng khác nhau mà
dẫn đến các hệ thống khung vô cùng phong phú của các Diterpenoid. Ngày nay ta
đã biết đến trên 170 khung cacbon của các Diterpenoid.
- Diterpenoid không vòng
Phytan thuộc loại Diterpenoid không vòng, có cấu trúc hoá học (2,6,10,14-
tetrametylhexadecan).
Các Diterpenoid loại này khác nhau bởi số lượng, vị trí và cấu hình các
nhóm hydroxy, xeton và olefin
- Diterpenoid vòng lớn Cembran
Cembran thuộc loại Diterpenoid một vòng lớn chung có cấu trúc hoá học
4,8,12-trimetyl-1-isopropyl-cyclotridecan khác nhau bởi số lượng, vị trí và cấu
hình của liên kết olefin.
Erinacines là Diterpenoid được phân lập từ sợi nấm của nấm Đầu Khỉ.
Hợp
chất này kích thích mạnh mẽ các yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF - nerve growth
factor) sinh tổng hợp và tăng catecholamine. Erinacine A đên I làm tăng yếu tố tăng
trưởng thần kinh (NGF) sản xuất trong tế bào nuôi cấy bởi astroglial lớn hơn năm
11
kinh trung ương và ngoại vi. NGF thấp hơn so với mức bình thường có thể là dấu
hiệu liên quan đến giai đoạn đầu của bệnh Alzheimer và chứng mất trí. Deterpenoid
erinacine đã thể hiện tiềm năng đáng kể trong việc kích thích tổng hợp NGF, khả
năng này như là tác nhân để điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh
Alzheimer hoặc bệnh Parkinson [18].
Yamada và cộng sự năm 1997, đã phân lập Diterpenoid erinacines A, B, C,
D, E, F, G, H, I từ sợi nấm của nấm Đầu Khỉ và đưa ra kết luận các Diterpenoid
erinacines đã thể hiện được khả năng kích thích sản xuất các yếu tố tăng trưởng
thần kinh (NGF) trong các thử nghiệm với động vật và là tác nhân điều trị tốt trong
điều trị bệnh Alzheimer và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác [21].
Theo Kawagishi và cộng dự năm 2005, các erinacines là các hợp chất
diterpenoid có khả năng kích thích mạnh đối với việc sản xuất NGF và đã được
chứng minh làm tăng một số mức độ dẫn truyền thần kinh và làm tăng mức độ NGF
trong não của những con chuột thí nghiệm được liều erinacines là 0,023 mg/g [15].
Một nghiên cứu lâm sàng gần đây tại Nhật Bản với một nhóm người là phụ
nữ độ tuổi 50 - 80 được chẩn đoán suy giảm nhận thức nhẹ và được điều trị với chế
phẩm diterpenoid được phân lập từ nấm Đầu Khỉ. Các kết quả của nghiên cứu cho
thấy các đối tượng trong nhóm điều trị đã cải thiện đáng kể chức năng nhận thức ở
thời gian 8, 12, 16 tuần và sự cải thiện này kéo dài không quá 4 tuần sau khi ngừng
13
sử dụng chế phẩm. Điều này cho thấy các Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ có khả
năng điều trị bệnh suy giảm nhận thức nhẹ [17].
2.3. Trích ly các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ
2.3.1. Cơ sở khoa học của quá trình trích ly [4]
Trích ly là dùng những dung môi hòa tan các chất khác, sau khi hòa tan, ta
được hỗn hợp gồm dung môi và chất cần tách, đem hỗn hợp này tách dung môi ta sẽ
thu được chất cần thiết.
Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly là dựa vào sự khác nhau về hằng số
Yêu cầu đối với dung môi: Dung môi phải có tính hoà tan chọn lọc, không
độc, không ăn mòn thiết bị, rẻ và rễ tìm.
Cơ chế hoà tan: Dung môi thấm qua các mao quản vào các tế bào nguyên
liệu, thời gian thấm phụ thuộc vào đường kính, chiều dài mao quản, bản chất dung
môi Quá trình hoà tan phụ thuộc vào bản chất hoá học của các chất tan và dung
môi. Các chất có nhiều nhóm phân cực (-OH, -COOH) dễ tan trong dung môi phân
cực (nước, cồn, propyl, ). Các chất có nhiều nhóm không phân cực (chất béo, CH3
- C2H5- và đồng đẳng) dễ tan trong dung môi không phân cực.
Các phương pháp trích ly:
Dựa vào trạng thái nguyên liệu và đặc tính dung môi có 2 loại: Trích ly tĩnh
và trích ly động. Ở phương pháp trích ly tĩnh nguyên liệu và dung môi không được
đảo trộn. ở phương pháp trích ly động nguyên liệu và dung môi được đảo trộn bằng
cánh khuấy, do đó hiệu suất cao hơn.
Dựa vào phương pháp và số bậc trích ly có hai loại là trích ly một bậc và nhiều
bậc. Với phương pháp trích ly một bậc thì toàn bộ quá trình trích ly được thực hiện
trong thiết bị trích ly, nguyên liệu và dung môi chỉ tiếp xúc một lần. Phương pháp
trích ly nhiều bậc được tiến hành trong một số thiết bị trích ly. Thiết bị cuối cùng
dung dịch đậm đặc đi vào nồi chưng. Hơi dung môi từ thiết bị chưng đi vào thiết bị
ngưng tụ rồi vào thùng chứa rồi vào thiết bị thứ nhất. Quá trình tiếp tục cho đến khi
đạt được độ trích ly cần thiết của nồi thứ nhất. Sau đó tháo hết dung môi và bã ra khỏi
thiết bị thứ nhất rồi cho vật liệu mới vào, lúc này thiết bị thứ nhất thành thiết bị cuối
Copyright: Tài liệu đại học ©