Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
…………………………………
NGUYỄN ĐỖ PHÚC
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH
ĐỘC TỐ RUỘT (ENTEROTOXIN)
CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS
GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 40 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ: VI SINH VẬT HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
GS.TS. NGUYỄN THỊ KÊ
PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC

TP. Hồ Chí Minh – năm 2010

Cảm ơn bạn Đặng Vũ Bích Hạnh, giảng viên Trường ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc
gia TP. HCM, là người bạn cùng khóa NCS, đã luôn luôn hỗ trợ và động viên tôi trong
thời gian thực hiện luận án.
Và trên hết, con xin chân thành cảm ơn công ơn sinh thành, dạy dỗ và tảo tần nuôi
con khôn lớn của Cha, Mẹ ruột; Cha, Mẹ vợ đã hết lòng thương yêu và lo lắng cho gia
đình và các con của con và mọi người trong gia đình hai bên nội ngoại để cho con yên
tâm học tập và công tác tốt.
Xin cảm ơn tất cả!
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2010
Nguyễn Đỗ Phúc
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 4

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC HÌNH v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH CHẤT GÂY BỆNH VÀ GÂY
NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM CỦA S. AUREUS 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học chính 3
1.1.2. Các nhân tố độc lực 5
1.1.3. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus 7
1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA S. AUREUS 10
1.2.1. Đặc điểm chung và phân loại 10
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo độc tố SE. 12

Trang 5

2.2.6. Phương pháp gây miễm dịch trên thỏ và kiểm tra hiệu giá
kháng huyết thanh 39
2.2.7. Tinh chế kháng thể 41
2.2.8. Kiểm tra độ sạch kháng thể bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 42
2.2.9. Xác định nồng độ kháng thể bằng phương pháp Bradford 42
2.2.10. Đánh dấu kháng thể kháng độc tố A và B với enzyme HRP 43
2.2.11. Phương pháp ELISA trực tiếp phát hiện SEA, SEB bằng
kháng thể cộng hợp HRP 44
2.2.12. Kiểm tra phản ứng chéo của kháng thể cộng hợp HRP 44
2.2.13. Xây dựng qui trình ELISA sandwich phát hiện SEA, SEB
trong thực phẩm 45
2.2.14. Đánh giá qui trình ELISA sandwich phát hiện độc tố SEA/SEB 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM S. AUREUS TRONG
THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ VÀ TỶ LỆ GÂY NGỘ ĐỘC BỞI S.
AUREUS TẠI TP. HỒ CHÍ MINH 49
3.1.1. Khảo sát tình hình nhiễm S. aureus trong thực phẩm đường phố
tại TP. HCM 49
3.1.2. Tỷ lệ gây ngộ độc thực phẩm bởi S. aureus trong một số vụ ngộ độc
thực phẩm tại TP. HCM 50
3.2. XÁC ĐỊNH LOẠI ĐỘC TỐ RUỘT PHỔ BIẾN GÂY NGỘ ĐỘC
BỞI S.AUREUS 51
3.2.1. Khảo sát khả năng sinh độc tố ruột của các chủng phân lập
trên môi trường TSGM và BHI 51
3.2.2. Xác định loại độc tố SE bằng phương pháp ELISA 53
3.2.3. Xác định loại độc tố SE phổ biến bằng phương pháp multiplex-PCR
nhân bản sao các gen mã hóa độc tố 55
3.3. TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA

BP Baird - Parker
CFA Complete Freund’s Adjuvant
CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
entA
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEA
entB
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEB
entC
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEC
entD
Gen maõ hoaù ñoäc toá SED
entE
Gen maõ hoaù ñoäc toá SEE
ETA Exfoliative exotoxin A
ETB Exfoliative exotoxin B
Fc Fragment crystalizable
HRP Horse radish peroxidase
IFA Incomplete Freund’sadjuvant
Ig G Immunoglobulin (Kháng thể lớp G)
IL Interleukin
INF Interferon
kDa Kilodalton
MHC Major histocompatiblity complex
MPN Most probable number
MSA Mannitol salt agar
MWCO Molecular weight cut off
ODTB OD trung bình
OD Optical density
OPD o-Phenylenediamine

Hình 2.2. Bố trí mẫu trong phương pháp khuếch tán trong gel 40
Hình 3.1. Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S. aureus
trong môi trường TSGM 52
Hình 3.2. Động học tăng trưởng và tạo độc tố của chủng S. aureus
trong môi trường BHI 53
Hình 3.3. Kết quả
phân tích gen mã hóa độc tố SE ở các chủng S. aureus
phân lập từ thực phẩm và mẫu chất nôn 59
Hình 3.4. Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh kháng SEA với độc tố
SEA ở thỏ trước khi gây miễn dịch 63
Hình 3.5. Kết quả phản ứng của kháng huyết thanh kháng SEB với độc tố
SEB ở thỏ trước khi gây miễn dịch 64
Hình 3.6. Kiểm tra độ sạch của kháng thể qua các bước tinh chế bằng điện di
SDS-PAGE 65
Hình 3.7. Định lượng kháng thể bằng phương pháp Bradford 66
Hình 3.8. Kết quả ELISA trực tiếp kiểm tra khả năng phát hiện độc tố SEA và
SEB của kháng thể cộng hợp bằng phương pháp ELISA trực tiếp 68
Hình 3.9. Kết quả khảo sát loại dung dịch đệm phủ giếng trong qui trình
ELISA sandwich phát hiện SEA, SEB 70
Hình 3.10. Kết quả khảo sát loại tác chất khóa giếng trong qui trình ELISA
phát hiện SEA, SEB 71
Hình 3.11. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEA thích hợp để
phủ giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEA 72
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEB thích hợp dùng
để phủ giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEB 73
Hình 3.13. Kết quả khảo sát thời gian ủ giếng thích hợp của qui trình ELISA
phát hiện SEA, SEB 74
Hình 3.14.
Kết quả khảo sát thời gian thích hợp ủ kháng nguyên trong qui trình
ELISA phát hiện SEA, SEB 75

phân lập từ thực phẩm 54
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra khả năng nhân bản và độ đặc hiệu của 5 cặp mồi
nhân bản sao 5 gen mã hóa 5 loại độc tố SE bằng phản ứng
multiplex-PCR 56
Bảng 3.5
Kết quả kiểm chứng loại độc tố được sản sinh bởi các chủng S. aureus
bằng phản ứng multiplex-PCR nhân bản sao các gen mã hóa độc tố SE 58
Bảng 3.6. So sánh kết quả xác định loại độc tố tạo ra bởi các chủng S. aureus
bằng phương pháp ELISA và kết quả xác định gen mã hóa độc tố
bằng phản ứng multiplex-PCR 60
Bảng 3.7. Kiểm tra sự hình thành kháng thể kháng SEA, SEB trong huyết thanh
thỏ được gây đáp ứng miễn dịch xác định bằng phương pháp khuếch
tán trên gel 62
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính của kháng thể kháng SEA, kháng thể
kháng SEB cộng hợp HRP bằng phản ứng ELISA trực tiếp 67
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra phản ứng chéo giữa kháng thể kháng SEA cộng hợp
với SEA với SEB và của kháng thể kháng SEB cộng hợp với SEA 68
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát loại dung dịch phủ giếng 69
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát lọai tác chất khóa giếng trong qui trình ELISA
phát hiện SEA, SEB 71
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEA thích hợp để phủ giếng
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 9

trong qui trình ELISA phát hiện SEA 71
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát nồng độ kháng thể kháng SEB thích hợp dùng để phủ
giếng trong qui trình ELISA phát hiện SEB 72
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát thời gian ủ giếng thích hợp của qui trình ELISA

MỞ ĐẦU

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 11 An toàn Vệ sinh thực phẩm là vấn đề được nhiều quốc gia trên thế giới rất
quan tâm. Việc sử dụng thực phẩm không an toàn là một trong những nguyên nhân
gây ra các bệnh truyền nhiễm lây qua thực phẩm. Theo Cục An toàn Vệ sinh Thực
phẩm (Bộ Y tế) và Tổ chức Y tế Thế giới, hàng năm tại Việt Nam có khoảng 3 triệu
người bị nhiễm độc từ thực phẩm, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD. Mặt khác, theo
số liệu của Bộ Y tế, trong các năm 2000-2007 cả nước có 1.358 vụ ngộ độc thực
phẩm ở bếp ăn tập thể với 34.411 người bị ngộ độc và 379 người tử vong (Hội thảo
về Vệ sinh an toàn thực phẩm ngày 23/10/2007).
Hiện nay phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vi sinh vật gây ô nhiễm thực
phẩm là phương pháp nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa và miễn dịch.
Các phương pháp mới như PCR, ELISA đang được nghiên cứu ứng dụng trong
phân tích vi sinh vật trong thực phẩm nhằm giúp cho công tác thanh tra giám sát
thực phẩm hoặc điều tra nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật được

phẩm” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định loại độc tố S. aureus gây ngộ độc
phổ biến tại Việt Nam, xây dựng qui trình multiplex-PCR phát hiện các gen sinh
độc tố và xây dựng qui trình ELISA phát hiện các độc tố này trong thực phẩm, góp
phần xây dựng các công cụ phân tích hữu hiệu dùng cho việc xét nghiệm, giám sát
độc tố ruột do S. aureus trong thực phẩm ở nước ta.
Nội dung nghiên cứu của luận án
Nội dung của luận án tập trung và giới hạn vào các vấn đề sau:
1- Khảo sát tình hình nhiễm S.aureus trong thực phẩm đường phố và tỷ lệ gây
ngộ độc bởi S. aureus tại thành phố Hồ Chí Minh.
2- Xác định loại độc tố ruột phổ biến gây ngộ độc bởi S.aureus bằng phương
pháp ELISA và phương pháp multiplex-PCR.
3- Tạo kháng thể và xây dựng qui trình ELISA phát hiện độc tố phổ biến trong
thực phẩm.
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 13 CHƯƠNG 1.
TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU


A B
Hình 1.1. Hình thái của S. aureus
A. Dưới kính hiển vi điện tử; B. Dưới kính hiểm vi quang học

Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 15

Về đặc điểm sinh hóa, S. aureus có men catalase, cho phản ứng đông huyết
tương dương tính nhờ enzyme coagulase. Phản ứng đông huyết tương là đặc trưng
để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. S. aureus cho phản ứng DNAse,
phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose,
sucrose, nhạy với novobicine[4]. Một số chủng S. aureus có khả năng gây tan máu
trên môi trường thạch máu. Hầu hết các dòng S. aureus đều tạo sắc tố vàng, thường
thấy rõ sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng [25]. Trên môi trường Baird
Parker, khuẩn lạc S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 - 1,5mm,
quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 - 5mm. Trên môi trường Manitol salt agar
(môi trường Chapman), khuẩn lạc S. aureus có dạng tròn, bờ đều và lồi, màu vàng
nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (Hình 1.2.).

Catalase + + +
Coagulase + - -
Thermonuclease + - -
Nhạy với Lysostaphin + + -
Sử dụng glucose + + -
Sử dụng manitol + - -

1.1.2. Các nhân tố độc lực
S. aureus có thể gây nhiễm trùng, tạo mủ ở những vết xây xước trên bề mặt
da, gây nhiều bệnh truyền nhiễm như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm
màng não, nhiễm trùng tiểu, viêm xương tủy, viêm màng trong tim. S. aureus cũng
là nguyên nhân gây nhiễm trùng vết mổ và nhiễm trùng dụng cụ y khoa. Mặt khác
S. aureus còn gây ngộ độc thực phẩm bởi độc tố ruột enterotoxin, và gây hội chứng
shock do siêu kháng nguyên trong máu [62]. Độc lực của S. aureus được hình thành
do tác dụng phối hợp của nhiều nhân tố độc lực khác nhau sau đây.
* Staphylococcus aureus tạo nhiều yếu tố độc lực:
- Protein nhận diện và bám dính

Bề mặt tế bào S. aureus có adhesin protein với vai trò nhận diện và bám
dính, tạo protein gắn kết fibrinogen và fibrinetin làm kích thích sự kết dính các khối
máu và mô bị chấn thương. Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường gặp ở
những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp.
- Các nhân tố xâm nhiễm

S. aureus tạo ra nhiều protein giúp vi khuẩn xâm nhập và lan nhiễm trong vật
chủ, được gọi tên chung là invasins, là bộ phận đóng vai trò quan trọng trong độc
lực của vi khuẩn này. Sau đây là các invasins chính của S. aureus.
+ Hemolysin: là độc tố tế bào có hoạt tính làm tan màng hồng cầu. Ở S.
aureus độc tố này gồm 3 loại: (i) α-Hemolysin: là độc tố tan màng mạnh nhất tác
dụng lên tiểu cầu và bạch cầu ở người; (ii) β-Hemolysin có tác dụng phân hủy màng

90% các chủng phân lập từ vết xước trên da.
+ Siêu kháng nguyên (superantigen): S. aureus tiết ra hai độc tố có hoạt tính
siêu kháng nguyên là TSST-1 (Toxic shock syndrom toxin) gây hội chứng sốc
nhiễm độc tụ cầu (TSS) và Enterotoxin gây nôn mửa, tiêu chảy, thường xảy ra ở các
vụ ngộ độc thực phẩm. Hai siêu kháng nguyên này sẽ kích hoạt 1/5 tế bào T không
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 18

chuyên biệt vốn không nhận được những kháng nguyên thông thường gây ra hội
chứng sốc do S. aureus [62].
1.1.3. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus
a. Triệu chứng ngộ độc thường gặp
S. aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực
phẩm ở nhiều nước sau Salmonella và Clostridium perfringens [31] [46]. Triệu
chứng thường gặp ở các vụ ngộ độc do S. aureus là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng,
có hay không có tiêu chảy, ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết
áp. Các triệu chứng này xuất hiện khoảng 3 - 6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm,
tùy vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm, độ nhạy với
độc tố và sức khỏe của từng người. Thông thường, các triệu chứng ngộ độc chỉ kéo
dài khoảng 6 - 8 giờ và hết bệnh sau 1 - 2 ngày [4].
b. Ngộ độc do S. aureus trên thế giới
Trên thế giới, vụ ngộ độc lớn đầu tiên do S.aureus xảy ra vào năm 1884 ở
Michigan (Mỹ) do phô mai. Các vụ ngộ độc lớn sau này được ghi nhận do thịt bò,
khô bò bị nhiễm, sữa, bánh kem,… [12].
Tại Mỹ, S. aureus gây ra khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm, gây
thiệt hại khoảng 1,5 tỷ đô la hằng năm; trong đó độc tố ruột A (SEA) chiếm 77,8%,
độc tố D (SED) 37,5% và độc tố B (SEB) 10% [46].
Ở Nhật Bản, năm 2000, ngộ độc sữa do độc tố A (SEA) của S. aureus đã gây

nhiễm độc tố ruột của S. aureus. Cùng năm này đã ghi nhận vụ ngộ độc ở nhà trẻ tại
Huyện Phú Quốc, Kiên Giang do yaourt bị nhiễm độc tố A (SEA) của S. aureus.
Tháng 12/2007 đã ghi nhận được 2 vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus tại
một số trường tiểu học, mầm non với trên 100 trẻ em bị ngộ độc. Hiện nay
S. aureus đã được xem là một chỉ tiêu vi sinh vật cần được kiểm soát trong thực
phẩm bởi các cơ quan chức năng tại Việt Nam. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực
phẩm của nước ta qui định mật độ S. aureus được phép hiện diện trong thực phẩm
thay đổi tùy theo loại thực phẩm (0, 3, 10, 10
2
CFU/g hoặc ml thực phẩm) và được
trình bày ở Bảng 1.2. Tuy nhiên, hiện nay chưa có tiêu chuẩn kiểm soát độc tố ruột
SE trong thực phẩm tại Việt Nam. Các công trình khác nghiên cứu về độc tố ruột
và sản xuất bộ ELISA để xác định độc tố ruột cũng chỉ giới hạn phát hiện SEA,
trong đó các thành phần bộ kít ELISA đều nhập ngoại do nhóm tác giả
Lê Quang Hà
và CS (2009) của Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nghiên cứu.
Bảng 1.2. Qui định về mức cho phép hiện diện của S. aureus trong thực phẩm tại
Việt Nam
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 20

Nhóm thực phẩm Loại thực phẩm TCVN
QĐ-BYT-
46/2007
Sản phẩm từ ngũ cốc,
khoai củ, đậu đỗ
Phở, Bún khô Hủ tiếu ăn
liền

lý nhiệt, có xử lý nhiệt
TCVN 7050:2002
TCVN
7049:2002
10CFU/g 10
2
CFU/g
Thịt hộp TCVN 7048:2002 0CFU/g Không có
Thịt tươi, đông lạnh, xay
nhỏ, nghiền, (phải qua xử
lý nhiệt trước khi xử dụng
/ / 10
2
CFU/g
Cá và thủy sản
Cá và thuỷ sản tươi
/
/
10
2
CFU/g
Sản phẩm chế biến từ cá và
thủy sản không qua xử lý
nhiệt
/ / 10CFU/g

Thủy sản khô sơ chế / /
10
2CFU/g
Rau quả muối - rau

Sản phẩm chế biến từ trứng / / 3CFU/g
Nước giải khát và
nước uống
Nước giải khát không cồn
Nước giải khát có cồn .
Nước khoáng đóng chai
/ /
Không có/ml
Thức ăn dinh dưỡng
đặc biệt
Thức ăn khô,thức ăn thay
thế đặc biệt, phải xử lý
nhiệt
/ / 10
2
CFU/g
Thức ăn khô, dùng trực tiếp / / 3CFU/g
Gia vị

/ /
10
2
CFU/g
TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam; QĐ-BYT: Quyết định của Bộ Y tế
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 21

1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA S. AUREUS

thì chưa rõ. Do vậy, hiện nay hầu hết các bộ bộ kít thương mại chỉ được phát triển
đối với 5 độc tố SE là SEA, SEB, SEC, SED và SEE, chính là các độc tố thường
gặp nhất trong ngộ độc thực phẩm do S. aureus [21] [38]. Mặt khác, có khoảng 5%
các vụ ngộ độc do S.aureus được cho là có nguyên nhân bởi các độc tố chưa được
xác định [52].
- Độc tố A (SEA)
Độc tố SEA được mã hóa bởi gen entA được mang bởi một bacteriophage
ôn hoà trong vi khuẩn [14]. Gen entA mã hóa cho pre-SEA chứa 257 acid amin. Khi
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 22

- Độc tố B (SEB)
Độc tố SEB chứa 267 acid amin, trọng lượng phân tử 31,4 kDa được mã hóa
bởi gen entB trên DNA của vi khuẩn hoặc được mang bởi plasmid [55] [56].
- Độc tố C (SEC)
Độc tố SEC gồm 3 loại SEC1, SEC2 và SEC3 có trình tự acid amin rất giống
nhau. SEC1 chỉ khác SEC3 bởi 9 acid amin và SEC2 khác SEC3 4 acid amin. Gen
entC3 có chiều dài 801bp mã hóa pre-SEC3 chứa 267 acid amin với một peptid tín
hiệu 27 acid amin ở đầu N. Sự cắt loại bỏ peptid tín hiệu này khi được tiết ra khỏi tế
bào tạo thành SEC3 với 240 acid amin có hoạt tính [32].
- Độc tố D (SED)
Độc tố SED gồm 288 acid amin, là độc tố được mã hóa bởi gen entD nằm
trên plasmid. Gen entD mã hóa cho pre-SED gồm 258 acid amin chứa một peptid
tín hiệu 30 acid amin.
- Độc tố E (SEE)
Độc tố SEE là một protein 239 acid amin được mã hóa bởi gen entE có 81%
tương đồng entA. Gen entE mã hóa cho một pre SEE chứa 257 acid amin.
- Các độc tố khác:

Tài liệu
tham khảo
A 774 257 233 27100 7,3
[13]
B 801 266 239 28336 8,6
[17]
C1 801 266 239 27531 8,6
[17]
C2 801 266 239 27531 7,8
[17]
C3 801 266 239 27563 8,1
[32]
D 777 258 222 26360 7,4
[23]
E 774 257 230 26425 7,0
[26]
G 777 258 233 27043 5,7
[44]
H 726 241 218 25210 ND
[60]
I 729 242 218 24928 ND
[44]
J 806 268 245 28565 8,65
[44]

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo độc tố SE
Mặc dù SE có thể được tạo ra ở khoảng điều kiện rất rộng nhưng cũng bị ảnh
hưởng bởi một số yếu tố môi trường. Thông thường, khi S. aureus tăng trưởng đến
mức 10
6

trung tâm nôn gây nôn mửa là một trong các triệu chứng ngộ độc của SE. Liều gây
ngộ độc do SE khoảng 0,1µg, thay đổi tùy độ mẫn cảm của từng người. Họat tính
gây nôn được cho là có liên quan đến vòng cystine trong phân tử các SE [41].
1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS TRONG
THỰC PHẨM
1.3.1. Định lượng S. aureus trong thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy
a. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô
trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Nếu mẫu giữ đông phải làm tan băng trước
khi xét nghiệm. Mẫu thực phẩm nếu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo quản ở
-20
O
C và không quá 4 ngày. Thực phẩm khô không cần bảo quản lạnh.
Cân chính xác 25g mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị hoặc hút chính xác
25ml mẫu thực phẩm lỏng cho vào chai dural chứa sẵn 225ml nước đệm phosphat
(hay 90ml nước đệm phosphat). Lắc đều 2-3 phút thì thu được dung dịch mẫu thử
có độ pha loãng 10
-1
. Mẫu được pha loãng tiếp tục 10
-2
, 10
-3
, …tùy theo mức nhiễm
của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích mẫu xác định lên đĩa thạch Baird
Luận án tiến sĩ Nguyễn Đỗ PhúcTrang 25

Trang 26

pháp nuôi cấy. Tại Việt Nam, việc phát hiện S. aureus trong thực phẩm được thực
hiện chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy. Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của
phương pháp này là thời gian phân tích kéo dài, phải mất 3 - 4 ngày mới cho kết
quả chính thức. Năm 2006, phương pháp PCR để phát hiện S. aureus trong thực
phẩm đã được thiết lập tại Việt Nam trong báo cáo nghiệm thu đề tài Khoa học và
Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học
phân tử vào việc kiểm tra, giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm, KC.04-30, Bộ Khoa
học và Công nghệ, 2006 của tác giả Trần Linh Thước [5] dựa trên việc nhân bản sao
đoạn gen nuc mã hóa cho protein nuclease chịu nhiệt đặc trưng cho S. aureus với
cặp mồi chuyên biệt cho sản phẩm PCR có kích thước là 276bp. Do S. aureus
thường hiện diện với mật độ thấp trong thực phẩm, vì vậy để làm tăng độ nhạy phát
hiện, trước khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR cần phải qua bước tăng sinh trong
môi trường không chọn lọc. Qui trình phát hiện S.aureus trong thực phẩm bằng
phản ứng PCR được tiến hành qua các bước sau:
- Đồng nhất và tăng sinh 25g mẫu 225ml môi trường Saline Peptone Water
(SPW) hoặc Trytone Soya Broth (TSB) bằng máy dập mẫu Stomacher trong 30
giây, ủ 37
o
C trong 24 giờ.
- 1ml dịch canh khuẩn sau tăng sinh được ly tâm ở để thu sinh khối, rửa
bằng nước cất vô trùng, huyền phù hóa với 1ml nước cất và đun sôi cách thủy trong
10 phút. Dịch đun sôi được ly tâm để thu dịch nổi chứa DNA mẫu.
- Phản ứng PCR được thực hiện trong dung tích 25μl gồm các thành phần là
2,5μl đệm dùng cho phản ứng PCR (10X); 2,5μl dNTP 100μM; 1,0μl Taq
polymerase 1U; 1,0μl mồi 1 (5’- GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’) 6pM,
1,0μl mồi 2 (5’- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’) 6pM; 3,0μl DNA