BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
%$* »9^ «ỉ« «9^ mỊ^ «2^ «Ỹ^ %f^ »$4 «1^
•Ị^ •ĩ^ *31^ •ĩ^ •ậ^
TRẦN THỊ THU TRANG
XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
AMIKACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VỚI DETECTƠ TÁN XẠ BAY HƠI
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 2000- 2005)
^? ĩffiỂ àỉáư íẩn ạ. : Th.s Nguyễn Thị Kiều Anh
Th.s Nguyễn Tuấn Anh
* 9 ^ iA ự ie /ù ẹ ft : Phòng Đông Dược- Viện Kiểm Nghiệm
Q X ià ỉạ ừ ín . ¿AạHe A iên. : Tháng 3- 5/ 2005
Hà Nội- 5/ 2005
N ' r j • A
D + 3 /^ i’ ■
e Ầ m y i M
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm
ơn Thạc sĩ Nguyễn Thị Kiều Anh, Thạc sĩ Nguyễn Tuấn Anh , người
đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
đề tài này.
Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Đông Dược- Viện Kiểm
Nghiệm, các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá Phân Tích - Trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành
khoá luận.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo đã giảng dạy và
giúp đỡ em trong thời gian học tập tại nhà trường.
Em xỉn chân thành cảm ơn !
s v : Trần Thị Thu Trang
Trang

amikacin trong chế phẩm 31
Phần 4: KÊT LUẬN VÀ ĐÊ XUẤT 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
NHữ^G CHỮVIẾT TẮT
AMK : Amikacin sulfat
ELSD : Detectơ tán xạ bay hơi
( Evaporative Light- Scattering Detector)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
( High- Performance Liquid Chromatography)
IS : Chuẩn nội ( Internal Standard)
MeOH : Methanol
SKS : SỐ kiểm soát
Ký hiệu
Nội dung Trang
Bảng 1
Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký
27
Bảng 2
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
29
Bảng 3
Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
30
Bảng 4
1
I
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
31
Báng 5

25
Hình 6
Sắc ký đồ thu được khi đặt nhiệt độ detectơ 100°c (a) và
105"C (b)
25
Hình 7
Sắc ký đồ minh hoạ xác định sự phù hợp của hệ thống sắc ký
26
Hình 8
Sắc ký đồ (a):mẫu trắng; (b): mẫu trắng thêm chuẩn nội; (c):
mẫu chuẩn AMK có thêm chuẩn nội
28
Hình 9
Đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích
pic AMK/ IS vào nồng độ AMK
29
ĐẶT VẤN ĐỂ
Hiện nay trên thị trường các chế phẩm kháng sinh rất phong phú và đa
dạng. Aminoglycosid là nhóm kháng sinh lớn, rất có hiệu quả trong điều trị,
đặc biệt với các nhiễm khuẩn nặng. Là một kháng sinh trong họ, amikacin
được chỉ định trong các trường hợp như; nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn tiết
niệu, viêm phổi
Với kháng sinh aminoglycosid, phương pháp vi sinh được sử dụng phổ
biến trong kiểm nghiệm, tuy nhiên phương pháp này gặp phải một số hạn chế:
tốn nhiều thời gian, độ chính xác chưa thật cao, không có khả năng định tính
và đặc biệt khó khăn khi định lượng chế phẩm kháng sinh là hỗn hợp nhiều
thành phần.
Để khắc phục hạn chế này, một số các phưofng pháp phân tích hiện đại
đã được ứng dụng như: phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC),
phương pháp điện di mao quản (EC) hay phưoỉng pháp sắc ký lófp mỏng Tuy

Tên khoa học. 6-0-(3-amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-4-0-(6-amino-6-deoxy-a-D-
glucopyranosyl)-1-A/-[(2S)-4-amino-2-hydroxybutanoyl]-2-deoxy-D-streptannine sulphate
Tên chung quốc tê: Amikacin Sulfat
Tính chất lý hoá: Amikacin S u lfa t dạng bột kết tinh trắng tan tốt trong nước,
khó tan trong alcol và aceton. Không có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại.
Dược lý và cơ chế tác dụng:
Amikacin là một kháng sinh bán tổng hợp. Thuốc diệt khuẩn nhanh do
gắn hẳn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom và ngăn chặn sự tổng hợp protein của
vi khuẩn.
Thuốc có tác dụng mạnh trên các vi khuẩn gram âm đặc biệt các trực
khuẩn ưa khí và tác dụng được trên một số vi khuẩn gram dương ( s.
pneumoniae, s. pyogenes ).
Chỉ định:
Amikacin được chỉ định để điều trị nhiễm khuẩn nặng đe doạ lính
mạng, đặc biệt chưa biết nguyên nhân hoặc nhiễm khuẩn nghi do vi khuẩn
gram âm. Có hiệu quả tốt trong điều trị nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn tiết
niêu
Liều dùng:
Người lớn, trẻ em có có chức năng thận bình thường: 15 mg/kg/ngày,
tiêm bắp, truyền tĩnh mạch, tiêm dưới da 1- 2 lần/ ngày. Không tiêm tĩnh
mạch trực tiếp.
Dạng thuốc: Lọ dung dịch tiêm amikacin Sulfat; lọ bột đông khô kèm nước
cất pha tiêm.
Một số biệt dược: Amikacin; Amikaye (Hàn quốc); Amikacin Sulfat;
Opekacin (Mỹ); Amiklin (Pháp); Licacin (Italia); Opekalin (Hồng kông)

1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMIKACIN
Trong dược điển Anh, Mỹ, Trung Quốc, và các tài liệu khác đã công bố một
số phương pháp được áp dụng để định lượng AMK.
1.2.1. Phương pháp vi sinh: [17]

1.2.4 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detectơ huỳnh quang: [15]
AMK trong huyết tương sau khi xử lý được dẫn xuất hoá với thuốc thử
1- methoxycarbonyl- indolizine- 3,5- dicarbaldehyde 15 phút trong bóng tối.
Sản phẩm tạo thành được phân tích bằng điện di mao quản điện động
mixen ( MEKC) trong ống mao quản ( 75 cm X 50 ụm), ở nhiệt độ 40 “c, và
đặt điện thế 30 kv.
Pha động: 40 nM- sodium dodecyl sulfat trong 20 nM đệm phosphat-
borat pH= 7.
Detectơ huỳnh quang: bước sóng phát xạ 482 nm, bước sóng kích thích
414 nm.
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Trong dược điển Anh, Mỹ cũng như một số tài liệu tham khảo khác đã
sử dụng hệ thống HPLC để định lượng AMK với các detectơ thích hợp khác
nhau. Một số các chương trình sắc ký đã được áp dụng
aJ Phương pháp HPLC với detectơ điện hoá: [20]
Theo dược điển Mỹ 27, AMK được định lượng bằng phương pháp
HPLC dựa trên các điều kiện:
Cột: 250 X 4 mm với chất nhồi L47 (cột trao đổi anion, nhóm liên kết
triethylamin)
Pha động: Dung dịch NaOH 0,115 N
Tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút
Thể tích tiêm: 20 ụl
Detectơ điện hoá.
bJ Phương pháp HPLC với detectơ huỳnh quang: [19]; [21 ]
* Chương trình 1: Dẫn chất hoá trước cột: [19]
Sau khi loại protein và tạp chất trong mẫu huyết tương chứa AMK, tiến
hành dẫn xuất hoá mẫu thử với thuốc thử 0-phthalaldehyde, sản phẩm tạo
thành được phân tích bằng phương pháp HPLC với detectơ huỳnh quang theo
các điều kiện sau:
Cột: Kromasil 100 C18 (15 cm X 4 mm, 5ụm)

có pyridine trong môi trường phản ứng. Hỗn hợp được làm nóng cách thuỷ tới
75°c trong vòng 45 phút, sau đó được làm lạnh tới nhiệt độ phòng và lọc qua
màng lọc có kích thước nhỏ hofĩi 0,5 ụm được dung dịch chạy sắc ký.
Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh; cột Cjg (250x 4,6 mm, Sụm)
Pha động: CH3OH: K2HPO4 0,27% =72: 28 .
Điều chỉnh pH tới 6,5 bằng dung dịch KOH 0,4 N
Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút
Thể tích tiêm: 20 ụ ỉ
Detectơ UV: Bước sóng 340 nm.
* Chương trình 3: [12]
Cũng tiến hành dẫn xuất hoá AMK với acid 2,4,6-
trinitrobenzensulfonic trong môi trường pyridin có thêm 4-
dimethylaminopyridin ở nhiệt độ 75° c trong 75 phút. Sau đó làm lạnh xuống
nhiệt độ phòng, thêm dung dịch acid triAuoroacetic. Lung, K. R.; Kassal,
K.R.; Green, J.s.; Hovsepian, P.K đã chọn các điều kiện sắc ký như sau:
Cột sắc ký: Zorbax SB- C18 (15 cm X 4,6 mm)
Pha động: KH2PO4 0,02 M: CH3CN: CRjOU= 45: 41: 14, chỉnh
pH= 7,7 bằng dung dịch NaOH 50%
Tốc độ dòng: 2 ml/ phút
Thể tích tiêm: 20 MI
Detectơ UV; bước sóng 350 nm.
Như đã trình bày ở trên, AMK không định lượng được trực tiếp bằng
phương pháp HPLC với detectơ huỳnh quang hoặc u v . Do phân tử không
chứa các nhóm chức hấp thụ tử ngoại hoặc có khả năng phát xạ do đó cần phải
tiến hành dẫn xuất hoá.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành triển khai một phương pháp
mới sử dụng detectơ tán xạ bay hơi- có khả năng phát hiện trực tiếp các chất ít
bay hơi hơn pha động, không dựa trên đặc tính quang học của chất phân tích,
thích hợp cho định lượng kháng sinh aminoglycosid. Trên cơ sở đó xây dựng
phương pháp định lượng AMK bằng HPLC với ELSD.

• Hoà tan được chất cần phân tích
• Bền vững, nhanh đạt được cân bằng trong quá trình sắc ký
• Có độ tinh khiết cao
• Phù hợp với loại detectơ dùng để phát hiện các chất phân tích
• Có tính kinh tế và không quá hiếm
Các chất sau khi ra khỏi cột được phát hiện bởi detectơ. Một detectơ lý tưởng
phải đạt được những yêu cầu: [5;
• Độ nhạy cao
• Đáp ứng được với chất cần phân tích
• Thể tích chết ngoài detectơ nhỏ
• Không phá huỷ mẫu
• Độ lặp lại tốt, dễ sử dụng.
Có một số loại detecto như: detectơ UV- VIS , detectơ điện hóa, detectơ
huỳnh quang, detectơ tán xạ bay hơi (ELSD), detectơ khúc xạ ánh sáng
Hiện nay phương pháp HPLC được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong
phân tích dược phẩm. Là thiết bị dùng để định tính, định lượng đồng thời
nhiều chất cho kết quả có độ tin cậy cao. Tuỳ theo đặc tính của chất phân tích,
hệ thống HPLC sẽ được kết nối với các detectơ thích hợp. Như đã trình bày ở
trên, với hoạt chất amikacin, có rất nhiều phương pháp định lượng đã được
nghiên cứu dùng HPLC với các detectơ: điện hoá, huỳnh quang hay u v . Mỗi
phương pháp đều có những điểm ưu việt nhất định, trong nghiên cứu này
chúng tôi muốn trình bày một phương pháp mới nhằm mở rộng hơn nữa phạm
vi ứng dụng của HPLC, đồng thời cung cấp một phương pháp định lượng
AMK với thời gian phân tích hợp lý, kỹ thuật đcm giản và cho kết quả tin cậy:
Phương pháp HPLC với detectơ tán xạ bay hơi.
* Detectơtán xạ bay hơi ( Evaporatỉve Light Scatterìng Detector ): [6]; [10];
[14]; [16]
ELSD mới được đưa vào sử dụng ở Việt Nam dùng để phát hiện các
chất không hấp thụ ánh sáng tử ngoại. Pha động chứa chất phân tích được mù
hoá cùng với khí trơ và được bay hơi trong ống gia nhiệt. Các tiểu phân chất

ír (Thời gian lưu thực) = tf, - íq.
ỗ( (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa pic tại các điểm uốn tương ứng.
(Oq 5 (Độ rộng pic ở nửa chiều cao) = 2,354ôt.
(Oj,: Độ rộng đáy pic.
1.3.2 Một sô thông sô đặc trưng: [2]; [3]; [4]; [5]; [20]
* Thời gian lưu tỵ:
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ
thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic. Thời gian lưu Ir cho thông tin về mặt
định tính đối với mỗi chất khi tiến hành sắc ký trong điều kiện nhất định.
* Hệ sô dung lượng k':
Trong thực nghiệm k' được tính theo công thức:
k ' = — = ~ = ^ - 1
/q Íq Íq
Hệ số dung lượng cho ta biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha,
tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha
động ở thời điểm cân bằng. Trên thực tế k nằm trong khoảng từ 1-5 là tốt
nhất, các giá trị k lớn hơn chỉ dẫn đến sự doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian
lưu kéo dài, k’ thấp tương ứng với chất bị rửa giải ở thời điểm gần với thời
điểm bơm mẫu và do đó làm giảm khả năng tách.
* Hệ sô chọn lọc a:
a = ^ = (k 2 > k ',)
Để tách riêng hai chất thường chọn a nằm trong khoảng 1,05 ^ 2 .
* Hiệu lực cột:
Hiệu lực cột sắc ký được đánh giá thông qua hai thông số: số đĩa lý
thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký coi như có N tầng lý
thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân
bằng. Mỗi tầng được giả định như một pha tĩnh có chiều cao H.
Số đĩa lý thuyết (N) trên một đofn vị độ dài của cộ t:
N =
ỈR

pha động).
* Hệ số bất đối xứng (Tỷ. cho biết mức độ đối xứng của pic trên sắc ký đồ
co,.
T=
^0,05
2/
Với f khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến mép
đường cong phía trước ở tại 1/20 chiều cao pic; Woo5 là độ rộng pic ở 1/20
chiều cao pic. Trong phép định lượng để tính diện tích pic thì T < 2,5 là chấp
nhận được.
1.3.3. Các phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký: [3]
Các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của các chất tỷ
lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó
* Phương pháp chuẩn ngoại:
Là phương pháp trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến
hành sắc ký dưới cùng điều kiện. So sánh diện tích (chiều cao) pic của chất
phân tích trong mẫu chuẩn và trong mẫu thử sẽ tính được nồng độ các chất
phân tích trong mẫu thử.
* Phương pháp chuẩn nội:
Cho vào trong mẫu thử và mẫu chuẩn một lượng như nhau chất chuẩn
nội thích hợp. Chất chuẩn nội giúp cực tiểu hoá các sai số có thể xảy ra trong
quá trình xử lý mẫu, do máy móc và kỹ thuật tiến hành
Tiến hành sắc ký trong điều kiện đã khảo sát. So sánh tỷ số diện tích pic của
chất thử và chuẩn nội trong mẫu thử với tỷ số diện tích pic chất chuẩn và
chuẩn nội trong mẫu chuẩn, từ đó sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu
thử.
* Phương pháp thêm chuẩn:
Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn ngoại và chuẩn nội. Thêm
vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành
phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện.

- Bộ lọc dung môi
- Cân phân tích.
- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết: Bình định mức chính xác lOml, 20ml,
25ml; ống đong, pipet chính xác,
Hoá chất
- Chất chuẩn amikacin Sulfat (chuẩn asean 914 IU/ g- SKS: 89040)
- Methanol: dùng cho sắc ký lỏng
- Acid 2,2,3,33-Pentafluoropropionic
- Tobramycin Sulfat (chất đối chiếu 99,2%)
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu:
Thuốc tiêm Amikacin chứa amikacin Sulfat 500 mg/ 2ml, (sản xuất bởi
IL.Dong pharm.Co., LTD. SKS: 402001 và 009001).
2.2 Nội dung nghiên cứu:
2.2.1. Xây dựng phương pháp HPLC sử dụng ELSD định lượng amỉkacin
trong chế phẩm
<♦ Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Sử dụng cột sắc ký có sẵn Lichrosorb RP 18 (250 X 4 mm, 10 ụm), chúng
tôi tiến hành khảo sát các điều kiện:
* Tỷ lệ các thành phần trong pha động
* Tốc độ dòng của pha động
* Tốc độ khí của detectơ
* Nhiệt độ của detectơ
Từ các điều kiện đã lựa chọn chúng tôi tiến hành đánh giá sự ổn định của hệ
thống sắc ký.
*t* Thẩm định phương pháp định lượng amỉkacỉn
* Khảo sát độ chọn lọc
* Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ AMK và tỷ lệ diện tích pic
AMK/IS.
* Khảo sát độ chính xác của phương pháp
* Khảo sát độ đúng của phương pháp .

2.3.2. Điều kiện định lượng
■ Cột Lichrosorb RP 18 (250 X 4mm, 10 ụm)
■ Detectơ : Alltech ELSD 2000
■ Pha động: CH3OH: 0,3% acid pentafluoropropionic / HjO = 50:50
■ Tốc độ dòng : 0,8 ml/ phút
■ Nhiệt độ detectơ : 105 °c
■ Tốc độ dòng khí; 2 1/ phút
2.3.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả:
Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất phân tích tỷ lệ với tỷ số diện tích
pic (chất phân tích và chất chuẩn nội) trên sắc đồ. So sánh tỷ số diện tích pic của
mẫu chuẩn và mẫu thử để định lượng chất thử trong dung dịch phân tích từ đó
tính ra hàm lượng chất thử trong mẫu cần định lượng.
Công thức tính như sau:
Rj X c X D
X(mg/ml) = —

Rc X 1000
Trong đó;
Rc: lần lượt là tỷ số diện tích pic amikacin Sulfat/ tobramycin
sulfat của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
C: nồng độ của dung dịch chuẩn (Mg/ml)
D: hệ số pha loãng.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê. Các công
thức liên quan được sử dụng trong quá trình tính toán:
* Độ lệch chuẩn:
* Độ lệch chuẩn tương đối:
t
1 = 1
______________________________
n - 1